Résolution quantitative Haute Synaptic Proteome Profiling des souris régions cérébrales Après Auditory Discrimination apprentissage

L’objectif global de cette approche protéomique est la caractérisation de la réorganisation moléculaire au niveau des synapses après l’apprentissage et la formation de la mémoire afin de comprendre les mécanismes de base et les voies de signalisation. Le principal avantage de cette technique est une approche sans hypothèse, permettant une quantification et une caractérisation à grande échelle de la post-traduction et des modifications au sein des protéomes synaptiques. Notre flux de travail établi permet une corrélation entre un certain changement moléculaire et un comportement particulier.

L’apprentissage et la formation de la mémoire sont basés sur les changements d’efficacité synaptique et, par conséquent, les études protéomiques devraient se concentrer davantage sur l’analyse des structures synaptiques comme les synaptosomes que sur les homogénats du tissu cérébral. Les résultats protéomiques représentent des ensembles de données très complexes et nécessitent donc un traitement bio-informétique. Commencez l’entraînement en plaçant la souris de test dans une boîte navette faiblement éclairée à l’intérieur d’une chambre insonorisée.

Utilisez un horaire d’apprentissage entièrement contrôlé par ordinateur pour l’apprentissage de la discrimination auditive. Commencez par une période d’habituation de trois minutes de silence avant de commencer la séance d’entraînement. Lors des essais, l’animal doit franchir l’obstacle dans les six secondes suivant la présentation du ton pour marquer un coup.

Lors des no-go trials, l’animal doit rester dans le compartiment courant de la boîte de navette pendant les six secondes de présentation du ton. Effectuez 30 essais et 30 essais no-go dans un ordre pseudo-randomisé, avec un intervalle de 20 secondes entre les essais, de sorte qu’une séance se compose de 60 essais et dure environ 25 minutes. Une fois que tous les essais ont été effectués, retournez la souris dressée dans la cage de la maison jusqu’au sacrifice.

Après avoir sacrifié la souris et retiré le cerveau, localisez le cortex auditif à l’aide de repères visuels, notamment les vaisseaux sanguins et la forme de la surface. Ensuite, à l’aide d’un scalpel et d’une aiguille, vous pourrez disséquer bilatéralement le cortex auditif sous la forme d’un bloc de tissu rectangulaire. En utilisant le chiasma optique comme point de repère, disséquez le cortex frontal sous forme de tranche de cerveau entre Bregma 3,56 et 1,54.

Disséquez le striatum sous forme de tranche de cerveau entre Bregma 1,54 et 0,5. Et retirez soigneusement le tissu cortical. Disséquez l’hippocampe en stabilisant le cerveau avec l’aiguille à travers le cervelet et en déroulant le cortex en commençant par le lobe occipital.

Shock-freeze a disséqué des échantillons de cerveau dans de l’azote liquide. Commencez la purification des synaptosomes en transférant le tissu cérébral disséqué dans des vaisseaux d’homogénéisation contenant un millilitre de tampon A glacé, puis homogénéisez le tissu à 900 tr/min en utilisant environ 12 coups. Centrifugez les échantillons à 1 000 fois G pendant 10 minutes.

Après la centrifugation, conservez les surnageants. Réhomogénéisez le granulé comme précédemment et combinez les surnageants. Faites tourner les surnageants combinés pendant 20 minutes à 12 000 fois G.Remettez les granulés en suspension dans un millilitre de tampon d’homogénéisation et homogénéisez avec six coups à 900 tr/min suivis d’une centrifugation à 1 200 fois G pendant 20 minutes.

Pendant la centrifugation pour produire les pastilles P2, préparer des gradients de pas de saccharose dans des tubes d’ultracentrifugation. Commencez avec 2,5 millilitres de tampon de saccharose de 1,0 molaire, puis utilisez une pipette Pasteur en verre pour sous-couche de 1,5 millilitre de tampon de saccharose de 1,2 molaire. Après la centrifugation, ajoutez 0,5 millilitre de tampon de saccharose à 0,32 molaire aux pastilles P2.

Ensuite, réhomogénéisez à l’aide de six traits. Chargez les fractions homogénéisées au-dessus des gradients. Placez les gradients chargés dans un rotor à godets oscillants, puis faites tourner à 85 000 fois G pendant deux heures dans une ultracentrifugeuse.

Une fois la centrifugation terminée, jetez la couche supérieure de saccharose de 0,32 molaire, y compris le matériau à l’interface avec le tampon de saccharose de 1,0 molaire. Collectez les synaptosomes à l’interface tampon de saccharose d’une molaire à 1,2. Ajouter 0,32 tampon molaire de saccharose à la fraction synaptosomale dans un rapport de 1,1.

Mélangez soigneusement et tournez à 150 000 fois G pendant une heure. Les synaptosomes se trouvent dans la pastille et peuvent être remis en suspension dans un tampon pour un traitement ultérieur. Dissoudre les synaptosomes de chaque zone cérébrale d’un animal dans 20 à 50 microlitres de 8 molaires d’urée en incubant sur glace pendant une heure dans un bain à ultrasons.

Diluer avec un pour cent d’un détergent amovible pour assurer une concentration finale de deux molaires d’urée. Après avoir déterminé les quantités relatives de protéines à l’aide de la méthode SDS-PAGE, pipetez un tiers du reste de chaque échantillon dans un tube frais. Effectuez la digestion en solution en ajoutant deux millimolaires de DTT et 25 millimolaires de bicarbonate d’ammonium et agitez doucement l’échantillon.

Réduire les échantillons pendant 45 minutes à 20 degrés Celsius. Ajouter 10 millimolaires iota d’acédomide aux résidus de carbamidométhylate de cystéine et mélanger. Incuber pendant 30 minutes dans l’obscurité à 20 degrés Celsius.

Enfin, ajoutez un microlitre d’une solution mère de trypsine et incubez à 20 degrés Celsius pendant 12 heures. Pour éliminer le détergent clivable à l’acide, ajoutez de l’acide trifluoroacétique à une concentration finale d’un pour cent et incubez pendant une heure supplémentaire à 20 degrés Celsius. Après avoir centrifugé les échantillons à 16 000 fois G pendant 10 minutes, prélevez soigneusement les surnageants.

Placez la colonne d’extraction en phase solide dans un rack et équilibrez la matrice avec deux millilitres de méthanol. Après le lavage, ajoutez deux millilitres supplémentaires de tampon B et chargez l’échantillon. Après avoir lavé trois fois avec le tampon B, éluez les peptides en ajoutant 200 microlitres de 70 % d’acétonitrile et 0,1 % d’acide trifluoroacétique.

Ensuite, séchez les échantillons purifiés dans une centrifugeuse sous vide. Dans cet exemple, les animaux entraînés sur la tâche de discrimination de tonalité FM montrent un taux croissant de coups et un taux décroissant de fausses alarmes au cours des sessions d’entraînement. Une discrimination importante se produit à partir de la quatrième session.

Les abondances synaptiques relatives des protéines sélectionnées sont comparées entre des souris entraînées sur la tâche de discrimination tonale FM et des souris témoins naïves 24 heures après la première séance d’entraînement. Après l’entraînement, les niveaux de la protéine CYFP2 sont modifiés dans toutes les régions étudiées. N’oubliez pas que les animaux présentent souvent des variabilités intra-individuelles.

Par conséquent, il est fortement recommandé d’inclure au moins cinq réplicats biologiques ou plus de groupes d’animaux bien appariés dans l’étude. Une fois établie, cette technique peut facilement être adaptée à d’autres espèces. Par exemple, il a été utilisé pour surveiller les changements d’expression des protéines dépendants de l’apprentissage dans le cerveau d’une seule mouche des fruits.