Quantification de la distribution d’une protéine présynaptique dans le cerveau de la souris à l’aide de l’immunofluorescence

Prenez une tranche de cerveau de souris fixée chimiquement et intégrée dans un milieu d’enrobage tissulaire.

Lavez la tranche avec un tampon pour retirer le support.

Ajoutez une solution qui perméabilise les membranes et bloque les sites de liaison non spécifiques.

Retirez la solution.

Pour visualiser les protéines synaptiques neuronales, incubez la tranche avec des anticorps primaires.

Ces anticorps ciblent une protéine présynaptique exprimée dans les synapses de régions cérébrales spécifiques et une protéine synaptique exprimée de manière ubiquitaire comme marqueur de référence.

Laver avec un tampon pour éliminer les anticorps non liés.

Introduire des anticorps secondaires marqués au fluorophore qui ciblent les anticorps primaires.

Laver avec un tampon pour éliminer les anticorps secondaires non liés.

Contre-colorez les noyaux avec un colorant de liaison à l’ADN.

Laver avec un tampon et monter la tranche à l’aide d’un support de montage approprié.

Visualisez la tranche au microscope confocal.

Calculez les rapports moyens d’intensité de fluorescence de la protéine cible et du marqueur de référence pour analyser la distribution de la protéine cible dans différentes régions du cerveau.

Pour préparer les tranches à l’immunomarquage, utilisez une pipette en plastique pour retirer la solution PB d’un puits sans aspirer les tranches de cerveau. Ensuite, à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres, ajoutez 250 microlitres de PB frais pour les laver de l’excès d’OCT. Répétez ce lavage pour chaque puits à la fois pour éviter de dessécher les tranches.

Ensuite, utilisez une pipette en plastique pour retirer la solution de PB du premier puits. Utilisez une pipette de 1 000 microlitres pour ajouter 250 microlitres de tampon de blocage par puits, en travaillant à nouveau bien par puits. Incuber la plaque à température ambiante sur un shaker pendant trois heures. Pendant l’incubation à 250 microlitres de tampon d’anticorps par puits dans un tube de réaction.

Ensuite, utilisez une pipette de 2 microlitres pour ajouter la quantité appropriée d’anticorps, en le pipetant directement dans la solution, et pipetez doucement de haut en bas plusieurs fois pour mélanger. Ensuite, vortex cet anticorps dilué pour assurer un bon mélange.

En travaillant bien par puits, retirez le tampon de blocage à l’aide d’une pipette en plastique et ajoutez 250 microlitres de solution d’anticorps primaires par puits. Incuber l’assiette sur un shaker à 4 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, prélever la solution d’anticorps à l’aide d’une pipette en plastique. Lavez les tranches avec 300 microlitres de tampon de lavage 1 par puits, trois fois 10 minutes chaque lavage sur un shaker à température ambiante. Pendant le lavage, en travaillant dans l’obscurité, diluez l’anticorps secondaire couplé au fluorophore dans un tube réactionnel de la même manière que précédemment avec l’anticorps primaire.

Une fois le lavage terminé, retirez le tampon de lavage à l’aide d’une pipette en plastique et ajoutez 250 microlitres de solution d’anticorps secondaire par puits. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 90 minutes. Une fois l’incubation terminée, prélever la solution d’anticorps à l’aide d’une pipette en plastique. Lavez les sections trois fois avec le tampon de lavage 2 de la même manière qu’avec le tampon de lavage 1.

Au cours de ce lavage, diluez la coloration DAPI dans 0,1 molaire de PB pour obtenir une concentration de 1 à 2000. Après avoir retiré le tampon de lavage de la plaque, ajoutez 250 microlitres de solution DAPI et incubez à température ambiante sur l’agitateur pendant 5 minutes.

Après avoir retiré la solution DAPI à l’aide d’une pipette en plastique, utilisez une pipette de 1 000 microlitres pour ajouter 500 microlitres de PB molaire par puits. Placez une lame de microscope sous un stéréoscope. À l’aide d’un pinceau fin, ajoutez trois gouttes distinctes de 0,1 PB molaire sur la lame. À l’aide du pinceau, placez une tranche par goutte sur la lame, puis aplatissez et orientez les tranches.

Une fois que toutes les tranches sont correctement positionnées, utilisez un mouchoir en papier pour enlever l’excès de PB et séchez soigneusement sans sécher complètement les tranches. Ensuite, ajoutez 80 microlitres de milieu d’enrobage sur la lame et couvrez-la soigneusement d’une lamelle pour encastrer les tranches de cerveau.

Couvrez les lames pour éviter l’exposition à la lumière et laissez-les sécher dans la hotte pendant une à deux heures, puis rangez-les dans une boîte à lames de microscope à 4 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour la microscopie confocale.

Après avoir acquis des tissus virtuels de la tranche cérébrale entière pour différents canaux, comme décrit dans le manuscrit, chargez tous les canaux uniques d’une image dans Fidji en cliquant sur Fichier, puis sur Ouvrir. Ensuite, utilisez l’outil de sélection à main levée pour délimiter un hémisphère dans le canal DAPI. Cliquez sur Modifier, puis sur Sélection, puis sur Créer un masque pour créer un masque de la région sélectionnée.

Cliquez ensuite sur Analyser, puis sur Mesurer les particules pour déterminer l’intensité moyenne de fluorescence pour des canaux uniques, en veillant à sélectionner différents canaux pour déterminer les valeurs moyennes d’intensité de fluorescence pour chaque canal.

Après cela, copiez l’intensité moyenne de fluorescence pour les canaux individuels dans une feuille de calcul. Pour déterminer l’intensité moyenne de fluorescence pour les canaux individuels d’une zone d’intérêt, délimitez la zone à l’aide de l’outil de sélection à main levée.