Traitement du cerveau d’une souris pour l’analyse en aval

Prenez un cerveau de souris fraîchement récolté et congelez-le dans de l’isopentane pré-refroidi pour une conservation rapide des tissus.

Ensuite, transférez le cerveau, côté cortex vers le haut, dans une matrice cérébrale congelée pour maintenir un environnement froid pendant le tranchage.

Permettez au cerveau de s’équilibrer à la température de la matrice. Alignez-le dans la matrice le long des sinus sagittaux et transverses pour assurer des sections symétriques.

Insérez les lames réfrigérées dans le cerveau, en veillant à ce qu’elles soient correctement alignées.

Ensuite, appuyez uniformément pour obtenir des sections cérébrales uniformes.

Retirez les lames avec les sections et positionnez-les, côté rostral vers le haut, sur une plaque de verre congelée.

Organisez les sections de l’orientation rostrale à l’orientation caudale dans le bon ordre anatomique. Maintenant, séparez-les.

À l’aide d’une référence cérébrale appropriée, localisez et excisez la région d’intérêt de la section.

Transférez le tissu excisé dans un flacon pré-réfrigéré pour l’analyse en aval.

Après avoir retiré les cerveaux de souris adultes euthanasiées de type sauvage CD-1, congelez rapidement le tissu pendant 60 secondes dans de l’azote liquide ou de l’isopentane pré-refroidi avec de la glace sèche, et conservez-le à -80 degrés Celsius.

24 heures avant de disséquer le tissu, placez une matrice cérébrale propre sur une pile de blocs réfrigérants décongelés et prenez en sandwich les côtés de la matrice entre deux blocs réfrigérants, en veillant à laisser environ un demi-centimètre entre le bas des fentes du rasoir et le haut des paquets.

Installez une plaque de verre congelée pour la dissection en remplissant une boîte isolée de glace jusqu’à environ 5 centimètres du haut. Ensuite, placez une couche de 2,5 centimètres de glace sèche sur le dessus et couvrez-la d’une bâche en plastique noir. Placez une plaque de verre sur le plastique et de la glace sèche sur les bords de la plaque.

Retirez la matrice cérébrale congelée du congélateur et insérez le cortex cérébral vers le haut dans la matrice. Laissez le mouchoir s’équilibrer à la température de la boîte pendant 10 minutes, en gardant le couvercle ouvert pendant ce temps. Utilisez une pince à froid pour ajuster la position du cerveau dans la matrice, de sorte que le sinus sagittal et le sinus transversal s’alignent avec les rainures perpendiculaires du bloc.

Une fois le cerveau en position, placez une lame de rasoir réfrigérée près de son centre et enfoncez-la d’environ 1 millimètre dans le tissu. Ensuite, placez une lame refroidie à chaque extrémité du cerveau et appuyez jusqu’au fond de la matrice. Ensuite, commencez à ajouter des lames réfrigérées à l’extrémité rostrale, en les plaçant dans les fentes une à la fois et en les pressant doucement 1 millimètre dans le tissu. Continuez à ajouter des lames à intervalles de 1 millimètre, en travaillant vers l’extrémité caudale.

Lorsque toutes les lames sont en place, appuyez sur le dessus avec les doigts, la paume ou un objet contondant, et balancez-les lentement d’un côté à l’autre pour les déplacer à travers les tissus. Une fois que les lames ont atteint le bas des fentes, saisissez chaque côté du groupe de lames et libérez-les de la matrice en les balançant d’avant en arrière.

Après avoir libéré le groupe de lames, placez-les côté rostral vers le haut sur la plaque de verre et placez de la glace sèche à côté ou sur le dessus de la pile pour congeler davantage les échantillons et faciliter la séparation. Ensuite, placez la pile avec les arêtes vives vers le bas et séparez les lames en déplaçant la pile entre le pouce et les doigts.

Alignez la section sur les plaques de verre du rostral au caudal, et séparez le tissu des lames en les fléchissant entre les doigts ou en les séparant avec une deuxième lame refroidie. Parfois, les tissus peuvent coller aux deux côtés d’une lame et des précautions doivent être prises pour maintenir l’orientation rostrale à caudale.

Avant de commencer la dissection, ouvrez l’Allen Mouse Brain Atlas ou une autre référence et trouvez les points de repère nécessaires pour identifier les régions d’intérêt. Utilisez des pinces ou des lames réfrigérées pour retourner la section et assurez-vous que la zone d’intérêt est cohérente dans toute la section.

Coupez la section avec un scalpel ou un poinçon propre, en poussant le métal doucement mais fermement dans le tissu, en le balançant d’avant en arrière pour faire la coupe. Après avoir récolté la région d’intérêt, placez-la dans des tubes pré-refroidis de 1,5 millilitre étiquetés et stockez-les à -80 degrés Celsius.