Conception expérimentale pour Laser Microdissection ARN-Seq: Leçons tirées d'une analyse du développement du maïs Feuille

L’objectif global de cette méthode est de quantifier l’accumulation de transcrits dans des cellules ou des domaines cellulaires spécifiques afin de pouvoir faire des comparaisons entre différents domaines ou entre des domaines équivalents dans des échantillons de type mutant et sauvage. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie du développement, telles que la façon dont les domaines organiques sont spécifiés ou comment des mutations spécifiques affectent l’expression des gènes. Le principal avantage de cette technique est que l’accumulation de transcrits peut être quantifiée dans des domaines minuscules, définis avec précision, trop petits pour être disséqués à la main.

Avant de commencer cette procédure, cultivez des plateaux de plants de maïs dans des conditions standard jusqu’à l’âge de deux semaines. Pour disséquer les apex des pousses pour les sections latérales, excise d’abord un semis juste en dessous de la ligne du sol. Ensuite, à l’aide d’une lame de rasoir, prélever de fines tranches de la base de la tige jusqu’à ce qu’un ovale de calme entouré d’une ou deux feuilles matures soit visible.

Faites une autre coupe à environ 10 millimètres au-dessus de la base. Ce segment de 10 millimètres contient le méristème apical de la pousse chez les jeunes primordiums de feuilles. Tournez le segment de 10 millimètres de manière à ce que la base soit tournée vers le haut.

Faites deux entailles parallèles à l’axe latéral pour obtenir une lame de tissu de deux à trois millimètres d’épaisseur. Jetez les deux parties extérieures et conservez la tranche centrale pour la fixation et l’enrobage. Plongez la tranche de mouchoir dans environ 10 millilitres de pâte fermière dans un flacon en verre sur de la glace.

Une fois que tous les échantillons ont été disséqués, appliquez un aspirateur pour éliminer les bulles d’air et faciliter la pénétration du fixateur. Tenez l’aspirateur pendant 10 minutes, puis relâchez-le lentement. Remplacez le fixateur et incubez à quatre degrés Celsius pendant la nuit en secouant doucement.

Le lendemain, continuez à traiter les tissus pour l’enrobage comme décrit dans le protocole textuel. Pour couler des blocs de paraffine, placez les moules d’enrobage sur une plaque chauffante de la station d’enrobage de tissus, et utilisez une pince pour transférer les échantillons de tissus dans les moules d’enrobage avec la surface coupée vers le bas. Placez l’anneau d’enrobage sur le dessus du moule.

Remplissez chaque moule de paraffine fondue. Transférez les moules dans une assiette froide jusqu’à ce que la paraffine se solidifie. Conservez les blocs de paraffine dans un récipient hermétique avec du gel de silice à quatre degrés Celsius.

Les sections sont découpées à partir de blocs de paraffine sur un microtome selon les procédures standard, et les sections médianes qui incluent le méristème apical de la pousse sont sélectionnées pour le montage. Pour monter les sections sur des diapositives, placez des lames sans RNase ou cuites sur un chauffe-lames à 42 degrés Celsius. Appliquez plusieurs gouttes de solution d’éthanol à 50 % pour couvrir chaque lame.

Posez doucement les sections sur la glissière et faites flotter les sections sur la solution d’éthanol jusqu’à ce qu’elles se dilatent. Ensuite, inclinez la lame et retirez l’excès de solution d’éthanol par aspiration à l’aide d’une pipette de transfert jetable. Utilisez des lingettes non pelucheuses pour évacuer toute solution d’éthanol supplémentaire.

Faites sécher les lames à 42 degrés Celsius pendant plusieurs heures ou toute la nuit. Lorsque les lames sont sèches, conservez-les dans un récipient hermétique avec du gel de silice à quatre degrés Celsius. Déparaffiniser les lames le jour de la microdissection.

Préparez trois bocaux Coplin en verre, deux bocaux contenant environ 50 millilitres de 100 % de xylènes et un pot contenant environ 50 millilitres de 100 % d’éthanol. Immergez les lames dans des xylènes un pendant deux minutes, des xylènes deux pendant deux minutes et de l’éthanol à 100 % pendant une minute. Égouttez les lames sur des lingettes non pelucheuses et faites-les sécher à l’air libre à température ambiante.

Pour commencer cette procédure, fixez les lames sur la platine du microscope de microdissection laser. Un facteur critique du succès de la microdissection laser dans les expériences RNasiques est l’utilisation de marqueurs morphologiques et moléculaires pour sélectionner des domaines précis pour la microdissection. Examinez les lames à l’aide d’un objectif 5X et identifiez les cinq sections les plus médianes de chaque lame en utilisant l’apex du méristème apical de la pousse comme point de référence central.

Ensuite, utilisez un objectif 10X ou 20X pour identifier la position de la ligule sur le primordium à sept feuilles du plastochron de chaque section. La ligule sera visible sous la forme d’une bosse saillant de la surface adaxiale du primordium foliaire. Utilisez l’outil de dessin du logiciel de microdissection laser pour marquer cette position.

Sélectionnez l’icône de dessin à main levée, déplacez le curseur à l’emplacement approprié, puis cliquez et faites glisser la souris pour dessiner. L’étape suivante consiste à utiliser la règle et l’outil de dessin rectangulaire pour mesurer des rectangles de 100 micromètres de haut centrés sur une ligule de chaque section pendant que la ligule échantillonne. Pour utiliser l’outil règle, sélectionnez l’icône de la règle, déplacez le curseur à une extrémité de la région à mesurer, puis cliquez et faites glisser le curseur pour mesurer la région.

La longueur de la règle sera affichée à l’écran. Utilisez l’outil règle pour mesurer un segment de 100 micromètres centré sur une ligule. Pour dessiner un rectangle, sélectionnez l’outil de dessin de lignes droites et tracez quatre lignes droites.

De la même manière, mesurez des rectangles de 100 micromètres positionnés à 50 micromètres au-dessus et en dessous du rectangle de ligule. Il s’agira des échantillons de lames et de gaines. Microdissection les rectangles mesurés à l’aide de la fonction de découpe laser pour couper la section du tissu le long du contour du domaine sélectionné, et de la fonction de catapulte pour propulser le rectangle du tissu de la glissière dans le couvercle du tube.

Prélevez des échantillons de ligule, de lame et de gaine dans des tubes séparés. Utilisez la même procédure pour microdisséquer des échantillons d’épiderme adaxial en lame, en ligule et en gaine de primordiums à sept feuilles de plastochron. Enfin, appliquez un tampon d’extraction d’ARN sur le tissu microdisséqué et procédez à l’extraction de l’ARN, à l’amplification de l’ARN, à la construction de la bibliothèque, au séquençage et à l’analyse bioinformatique comme décrit dans le manuscrit.

Lorsque l’accumulation de transcrits a été analysée et que toutes les couches cellulaires des régions de la lame, de la ligule et de la gaine ont été trouvées, 2 359 gènes exprimés de manière différentielle ont été trouvés. Dans les régions de la lame épidermique adaxiale, de la ligule et de la gaine, 3 128 gènes exprimés de manière différentielle ont été trouvés. La microdissection laser, la RLM, le séquençage de l’ARN et les analyses d’hybridation in situ ont donné des résultats cohérents, comme l’illustrent ces gènes représentatifs.

Les caricatures de gauche illustrent LM de toutes les couches cellulaires, et les caricatures de droite illustrent LM de l’épiderme adaxial uniquement. Les pointes de flèches dans les images indiquent l’émergence de ligules. L’accumulation du transcrit de ligules un était significativement plus élevée dans la ligule dans toutes les couches cellulaires et dans le LM épidermique.

Un gène de fonction inconnue avait un recomptage moyen plus élevé dans le LM épidermique ligule que dans le LM de toutes les couches. Le quatrième gène, Zm PIN1a, n’a pas été exprimé de manière significativement différentielle dans l’analyse de toutes les couches cellulaires, mais a été significativement régulé à la hausse dans la ligule dans l’analyse de l’épiderme seul. Sa forte expression dans le tissu vasculaire peut avoir confondu les différences dans l’accumulation de transcrits dans l’épiderme lorsque toutes les couches cellulaires ont été collectées.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de se rappeler que le choix des domaines cellulaires à microdisséquer et à comparer, ainsi que la précision des microdissections, sont cruciaux pour le succès des expériences.