Microdissection laser appliquée au profil d'expression génique de la Sous-ensemble de cellules provenant de la Drosophile Wing disque

Nous fournissons ici une description détaillée de la microdissection laser appliquée pour réaliser un profilage comparé de la transcription de l’ARN des zones silencieuses et non silencieuses du disque alaire de la drosophile. Cette approche nécessite comme matériel biologique, des disques d’images de drosophile disséqués manuellement comme équipement principal, un micro dissecteur laser. Nous utilisons le LI A-L-L-M-D 6 000 et une machine PCR en temps réel.

Nous avons utilisé un BioRad iq. Cinq petits outils nécessaires sont une plaque concave, un petit pinceau, une pince de microdissection en pince, une lame de chute suspendue, des pings anti-insectes, montés sur des aiguilles de seringue, un cadre en métal avec membrane en PET, de petits tubes en plastique. Cette méthode comprend les étapes suivantes.

Première étape : croiser deux lignées transgéniques ophtalmologiques appropriées afin de déclencher un silençage génique localisé et spécifique dans la descendance, en utilisant le système GAL quatre UAS. Deuxième étape, pour traiter les cadres de dissection. Troisième étape, pour configurer le micro dissecteur laser.

Quatrième étape, collecter manuellement les disques imaginaux de l’aile de la descendance larvaire du croisement génétique. Cinquième étape, pour effectuer une microdissection laser de zones spécifiques des disques imaginaux marqués GFP. Etape six, le profilage transcriptionnel des zones équivalentes de régions silencieuses et non solides du disque permettra d’établir les effets déclenchés par le silençage de votre gène d’intérêt.

Le profilage de transcription in vivo du gène X nécessitera l’extraction de l’ARN des zones micro disséquées, le contrôle de la précision de la dissection manuelle, l’évaluation de l’expression de la GFP dans les deux échantillons par R-T-P-C-R, la quantification de l’expression de putatif. Cibles du gène silence dans les deux échantillons par R-T-P-C-R en temps réel ou par réalisation d’une analyse de microarray. Maintenant, plus de détails sur chaque étape.

La première étape, le croisement génétique. Le croisement génétique implique quatre souches transgéniques de GAL UAS et vise à obtenir des disques imaginaux silencieux dans la descendance larvaire. Le système polyvalent GAL four vous permet de déclencher un silençage génique spécifique et localisé par interférence ARN.

Une souche introduit dans le croisement le transgène pilote qui exprime GAL quatre dans un schéma temporel ou spatial spécifique. Et un rapporteur A-U-A-S-G-F-P qui permet la visualisation du domaine d’expression quatre de la GAL. La deuxième souche introduit un transgène répondeur UAS qui exprime l’ARN de silençage en épingle à cheveux, capable de cibler spécifiquement le gène X une fois exprimé dans la cellule.

Cet ARN est clivé pour générer un petit ARN interférent, qui est capable de réduire au silence le gène X sélectionné dans la descendance de ce croisement. Le transgène de silençage UAS n’est transcrit que dans les cellules exprimant la protéine GAL quatre, induisant ainsi un silençage spatialement restreint du gène X. Parmi la variété d’applications, nous nous sommes concentrés sur le profilage de la transcription de l’ARN dans le disque alaire réduit au silence par le pilote Grailed GAL four, qui dirige un silençage spécifique dans le compartiment postérieur.

La région du silence est marquée par l’expression du transgène U-A-S-G-F-P. Dans le compartiment postérieur. Deux événements seront déclenchés : l’expression de GGFP et le silençage du gène x.

Deuxième étape, traitement des cadres de dissection pour inhiber l’activité des ARN. Lavez les lames de cadre et les outils de dissection avec de l’eau DEPC pendant au moins une heure à température ambiante et laissez-les sécher dans une chambre stérile. Pour inhiber l’activité des ARN, utilisez un tout nouveau tube de 50 ml déjà exempt d’ARN, rempli d’eau DEPC avec une pince insérée dans le tube, une lame suspendue et un cadre pour animaux de compagnie.

Les deux nécessaires pour la microdissection. Fermez le tube, retournez-le, puis laissez-le réagir pendant au moins une heure. À température ambiante, une heure plus tard, déplacez l’eau DEPC dans un autre tube avec la pince.

Tenez les glissières à l’intérieur du tube afin qu’elles ne tombent pas. Laissez ensuite sécher les lames à l’intérieur du tube. Troisième étape, configuration microdisect.

Tout d’abord, allumez tous les appareils nécessaires, l’ampoule de fluorescence, le microscope et le logiciel de microdissection. Une fenêtre d’avertissement vous rappellera d’allumer également le laser. Faites-le et laissez le laser se réchauffer pendant que vous terminez la configuration du microdisect

Il est maintenant temps de préparer les puits dans lesquels collecter les tissus. Couper. L’équipement de découpe laser Leica LMD 6 000 permet de charger jusqu’à quatre tubes pour collecter différents échantillons. Pour notre objectif, nous n’avons besoin que de deux tubes.

L’un, pour recueillir le tissu de silence positif à la GFP, l’autre pour recueillir le tissu unile négatif à la GFP avec un micro pectoral. Remplissez les deux bouchons du tube avec 20 microlitres de solution de tri réactif pour préserver l’ARN. Maintenant, le microdisect est prêt à l’emploi Quatrième étape, dissection à la main des disques d’imagerie de l’aile à partir de larves de joof.

Isoler les disques alaires de la descendance larvaire obtenue comme décrit précédemment, et s’assurer que d’autres tissus ne contaminent pas les disques. Pour atteindre cet objectif, l’approche de la dissection est très différente de celle couramment utilisée pour collecter la majeure partie de tous les disques originaux. Tout d’abord, lavez la larve dans la solution de ringer pour éliminer les milieux adhérents. Ensuite, transférez-le dans une diapositive suspendue et coupez la tête immédiatement en tirant la bouche vers le bas.

À l’aide des épingles à insectes, disséquez maintenant soigneusement les autres tissus. Le contour rouge montre les disques d’ailes imaginaux à collecter. Gardez les disques exempts de tissu adhérent rapidement et doucement Transférez chaque disque d’aile isolé dans un cadre de dissection pour une coupe immédiate.

Cette procédure doit être répétée jusqu’à ce que le nombre total de cent disques d’aile soit atteint. Cinquième étape, microdissection au laser de zones spécifiques de disques d’aile marqués GFP. Une fois que le disque d’aile d’origine est sur la membrane, vous pouvez procéder à la coupe.

Placez le cadre sur son support et fixez le support sur la platine motorisée. Recherchez le disque d’aile original en utilisant le LMD 6 000 comme microscope commun. Concentrez-vous dessus et réglez la coupe.

Dessinez une zone ovale qui s’adaptera des deux côtés du disque, la GFP positive et l’autre. Sélectionnez le capuchon du tube où vous souhaitez collecter la partie positive GFP. Appuyez sur le bouton Démarrer la coupe.

Le micro dissecteur procède à la coupe du tissu avec la vitesse et la puissance que vous avez définies auparavant en sélectionnant la fonction déplacer et couper. Vous pouvez affiner la coupe manuellement jusqu’à ce que le morceau de tissu non sélectionné tombe. L’animation 3D montre ce qui se passe sous le micro Dissector Cut un laser se concentre sur le tissu En effectuant une coupe le long du périmètre sélectionné.

Une fois la coupe terminée, le morceau de tissu tombe dans le capuchon du tube sélectionné et par conséquent dans le réactif tri. Après la première coupe, déplacez la zone de coupe de l’autre côté du disque d’aile pour couper une zone négative GFP équivalente. Avant de procéder à la nouvelle coupe, assurez-vous de sélectionner un capuchon de tube différent pour séparer les tissus positifs à la GFP des tissus négatifs à la GFP.

Appuyez sur le bouton de démarrage de la coupe après la coupe automatique. Procédez à l’affinage manuel de la coupe comme indiqué par l’animation 3D avant la deuxième coupe. La platine motorisée déplace le capuchon de tube sélectionné sous la zone de coupe.

Le faisceau laser se concentre sur le tissu coupé le long du périmètre sélectionné, et une fois la coupe terminée, le morceau de tissu tombe dans le capuchon du tube sélectionné contenant le réactif Tri. Pour collecter suffisamment de matériel, nous avons répété la procédure sur une centaine de disques d’ailes imaginaux. Une fois que vous avez collecté les échantillons, déchargez les tubes.

Il s’agit d’une étape délicate qui peut vous faire perdre tout le travail que vous avez accompli jusqu’à présent. Soyez donc prudent. Fermez le capuchon à l’envers et poursuivez l’expérience.

C’est celui avec un tissu positif à la GFP. C’est l’autre avec un tissu GFP négatif. Sixième étape, profilage de transcription.

Faites tourner les tubes pour détacher le liquide du capuchon et ajoutez du réactif Essayez jusqu’à un millilitre. Effectuez l’extraction de l’ARN en suivant le protocole standard des réactifs d’essai à partir d’une centaine de zones d’environ 5 000 micromètres carrés chacune. Notre rendement était de 1,5 microgramme d’ARN.

Nous utilisons l’exposant trois in vitrogen pour synthétiser le CD NA avec des hexas aléatoires. La précision de la dissection manuelle a été contrôlée en vérifiant l’expression de la GFP dans les deux échantillons par R-T-P-C-R. Comme le montre le gel avec R-T-P-C-R quantitatif.

Nous avons évalué les niveaux d’expression du gène du silence X ainsi que ceux des cibles présumées possibles de la voie régulatrice médiée par le gène X. Ce schéma montre un exemple des niveaux d’expression du gène X et de l’une de ses cibles présumées. Appelez-les gènes Y en fonction de leurs niveaux d’expression basale dans les compartiments antérieurs postérieurs des disques alaires non solides.

L’activité du gène X sélectionné a été réduite à 40 % après réduction au silence. En revanche, l’une de ses cibles présumées, le gène Y, s’est avérée significativement régulée à la hausse, ce qui nous a amenés à valider l’hypothèse selon laquelle il était régulé négativement par le gène X.