Une seule étape simple protocole Dissection pour Whole-mount Préparation des adultes

L'objectif général de ce protocole est de décrire une procédure de dissection simple en une seule étape pour les cerveaux de Drosophila adultes, permettant rapidement d'obtenir des cerveaux dont la morphologie est bien préservée et adaptée à une analyse en montage complet. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans les domaines des neurosciences et de la génétique, notamment la cartographie fine des circuits cérébraux, l'étude des effets de manipulations génétiques sur les neurones et la caractérisation fonctionnelle des gènes.

Le principal avantage de cette technique réside dans sa procédure facile à apprendre. Elle permet de disséquer un cerveau de drosophile adulte tout en préservant bien sa morphologie en moins de 10 secondes. La démonstration vidéo de cette méthode est essentielle, car maîtriser l'impulsion nécessaire lors du relâchement de la pince pour arracher l'exosquelette entourant la tête de la drosophile demande de l'habileté et de la pratique.

Ces minuscules mouches à fruits agaçantes nous ont beaucoup appris sur les principes biologiques. Elles pourraient également nous aider à découvrir les causes et les traitements de maladies humaines, telles que la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson. À l’aide d’un microscope stéréoscopique réglé à un grossissement de 1,2 X, immobilisez une mouche anesthésiée et immergez-la dans une solution de dissection froide, l’abdomen orienté vers le haut.

Conserver la pince à un angle de 160 à 170 degrés par rapport à la plaque de dissection, puis exercer une légère pression sur l'abdomen de la mouche. Cela doit immobiliser la mouche, forcer la tête à s'incliner vers l'arrière de 15 à 25 degrés et étendre la proboscis vers le haut. Après cette manœuvre, une région souple et translucide de la cuticule située sous la proboscis devrait devenir apparente.

Augmentez le grossissement et ajustez le plan focal sur cette région. À l’aide de la main dominante, prenez une paire de forceps de dissection et exercez une pression pour fermer les pointes. Positionnez les forceps perpendiculairement aux forceps qui immobilisent la drosophile.

Percez les extrémités fermées de la pince à travers la région souple et translucide de la cuticule, en prenant soin de ne pas pénétrer trop profondément au point de toucher le cerveau. Ensuite, relâchez rapidement mais fermement la pince, de sorte que les pointes s'ouvrent et arrachent l'exosquelette de la tête de la drosophile. Utilisez l'élan produit par l'ouverture des extrémités de la pince pour retirer délicatement l'exosquelette ainsi que la majeure partie de la capsule crânienne, des yeux et de la trachée associés, du tissu cérébral en un seul mouvement.

Un cerveau intact doit maintenant être visible. À l'aide de la pince, retirer soigneusement les tissus accessoires résiduels, tels que le tissu fibreux blanc de la trachée, en prenant soin de ne pas tirer ou endommager le cerveau proprement dit. Placer les échantillons de cerveau disséqués avec les troncs associés dans environ un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % sur de la glace pendant 40 à 60 minutes.

Retirer le paraformaldéhyde, puis rincer les échantillons avec un millilitre de PBS 1 X en pipettant la solution vers le haut et vers le bas trois fois, en prenant soin de ne pas aspirer les cerveaux. Ensuite, éliminer le PBS et effectuer cinq lavages avec un millilitre de PBT 1 X chacun pendant cinq minutes, avec agitation rotative. Ajouter l'anticorps primaire d'intérêt à la dilution appropriée.

Incubez ensuite les échantillons toute la nuit à quatre degrés Celsius avec agitation rotative. Éliminez l'anticorps primaire et lavez les échantillons cinq fois avec un millilitre de PBT 1 X pendant cinq à dix minutes par lavage, avec agitation rotative. Ajoutez l'anticorps secondaire aux échantillons lavés à la dilution et pendant le temps d'incubation appropriés.

Ensuite, laver les échantillons six fois dans un millilitre de PBT 1 X pendant 10 minutes chacun avec agitation rotative. Cette étape est cruciale pour éliminer les anticorps secondaires liés de façon non spécifique. Incuber les échantillons dans une dilution au 1/10 000 de DAPI à un milligramme par millilitre dans un millilitre de solution de PBT 1 X pendant 30 à 60 minutes avec agitation rotative.

Enfin, rincez les échantillons en ajoutant un millilitre de PBS 1 X, puis en aspirant et en redistribuant la solution trois fois à l’aide d’une pipette. Placez un coverslip sur une lame porteuse. À l’aide d’une pipette dont la pointe a été coupée, transférez les cerveaux dans une solution de PBS 1 X sur le coverslip.

Ensuite, à l’aide de pinces, séparer les cerveaux des corps. Utiliser une pipette à embout fin pour éliminer le liquide autour du tissu cérébral. Puis, ajouter de 20 à 40 microlitres de milieu de montage anti-décoloration.

Étaler délicatement les cerveaux tout en déplaçant le milieu visqueux vers l'extérieur. En partant d'un côté, abaisser doucement une deuxième lame couvre-objet sur les échantillons, en prenant soin de minimiser le contact entre le cerveau et les bulles. Laisser les lames se déposer, puis retirer tout excès de liquide au bord des lames à l'aide d'un essuie-tout de laboratoire.

Utilisez un petit morceau de ruban adhésif pour fixer temporairement la paire de lamelles à la lame porteuse. Pour observer les échantillons, utilisez un microscope à fluorescence composé ou un microscope confocal. Ces images montrent des vues antérieure et postérieure du même adulte de Drosophila.

Les noyaux cellulaires ont été visualisés par coloration au DAPI et les neurones ont été marqués à l'aide d'un marqueur neuronal pan-neuronal et d'anticorps anti-ELAV. Les neurones dopaminergiques, ou DA, ont été révélés par coloration avec des anticorps anti-TH. Des niveaux d'intensité similaires ont été observés entre les deux côtés du cerveau pour tous les canaux d'image.

Des vues agrandies de la partie antérieure et postérieure du cerveau permettent un examen détaillé des groupes de neurones DA. Le groupe médian antérieur apparié est visible sur les images antérieures, tandis que les groupes médians postérieurs appariés et les groupes latéraux postérieurs appariés se trouvent du côté postérieur du cerveau. Le décompte de ces neurones a révélé que les mouches mâles de souche w1118 âgées de trois jours possèdent typiquement 27 neurones DA dans le groupe PPM dans l'ensemble du cerveau, 16 dans le groupe PPL par hémisphère et cinq dans le groupe PAL par hémisphère.

Un nombre moyen de 97 neurones DA a été observé dans chacun des groupes PAM. La reconstruction 3D des groupes PAL et PAM a également montré que les neurones DA du groupe PAM ont des tailles relativement plus petites et une coloration TH plus faible que ceux des autres groupes, comme le PAL. De plus en plus d'études s'intéressent aux cerveaux de mouches adultes pour analyser les voies moléculaires et les circuits neuronaux sous-tendant les fonctions cérébrales supérieures, ainsi que pour modéliser des maladies cérébrales humaines.

Dans de telles études basées sur le cerveau, il sera nécessaire de préparer efficacement des échantillons cérébraux dont la morphologie est bien préservée. Cela pourrait être particulièrement important dans le cadre de criblages à grande échelle basés sur le cerveau. J'ai eu pour la première fois l'idée de cette méthode en éprouvant des difficultés à maintenir les mouches avec la pince.

Au lieu de pinces à extrémités pointues que la plupart des chercheurs utilisant Drosophila emploient, Shebna a essayé des pinces à extrémités émoussées et a constaté qu'il était plus facile de disséquer les cerveaux. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de 10 secondes si elle est effectuée correctement. Une fois, j'ai disséqué environ 100 cerveaux de six génotypes différents pour une seule expérience en seulement une journée.

Bien que cette procédure de dissection puisse sembler simple, il est important de la pratiquer d'abord avec des mouches non précieuses. L'expérimentateur pourrait également éprouver des difficultés à positionner la pince sans endommager le cerveau de la mouche. Les cerveaux dissectés peuvent être utilisés pour d'autres études, comme l'ARN, l'hybridation in situ, et l'extraction d'échantillons de protéines et d'ARN à partir du tissu cérébral.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure de disséquer des cerveaux de drosophiles avec une morphologie bien préservée. Nous prédisons que des améliorations pourront être développées afin de rendre cette procédure plus simple et plus rapide. Celle-ci pourrait potentiellement être automatisée à l’avenir pour des études à grande échelle.

N'oubliez pas que le travail avec le paraformaldéhyde et les pinces chirurgicales pointues peut présenter des risques. Prenez des précautions, comme porter des gants, lors de la manipulation des solutions de fixateur, et une fois la dissection terminée, remettez immédiatement le capuchon sur les pinces avant de les ranger.