Une seule étape simple protocole Dissection pour Whole-mount Préparation des adultes Drosophila Brains

L’objectif général de ce protocole est de décrire une procédure de dissection simple en une étape pour les cerveaux de drosophile adultes, qui peut rapidement produire des cerveaux avec une morphologie bien préservée adaptée à l’analyse de l’ensemble du montage. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans les domaines des neurosciences et de la génétique. Cela comprend la cartographie fine des circuits cérébraux, l’étude des effets des manipulations génétiques des neurones et la caractérisation fonctionnelle des gènes.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle implique une procédure facile à apprendre. Il peut faciliter la dissection d’un cerveau de mouche adulte à la morphologie bien préservée en moins de 10 secondes. La démonstration vidéo de cette méthode est essentielle, car le contrôle de l’élan requis lors du relâchement de la pince pour arracher l’exosquelette entourant la tête de la mouche demande des compétences et de la pratique.

Ces minuscules mouches à fruits ennuyeuses nous ont beaucoup appris sur les principes biologiques. Ils peuvent également nous aider à trouver les causes et les remèdes pour les maladies humaines, telles que la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson. À l’aide d’un microscope de dissection réglé sur un grossissement de 1,2 X, immobilisez une mouche anesthésiée et plongez-la dans une solution de dissection froide avec l’abdomen vers le haut.

Gardez la pince à un angle de 160 à 170 degrés par rapport à la plaque de dissection, puis exercez une petite force sur l’abdomen de la mouche. Cela devrait immobiliser la mouche, forcer la tête vers l’arrière de 15 à 25 degrés et étendre la trompe vers le haut. Après cette manœuvre, une région translucide molle de la cuticule sous le proboscis devrait devenir apparente.

Augmentez le grossissement et ajustez le plan focal sur cette région. À l’aide de la main dominante, prenez une paire de pinces à dissection et exercez une pression pour fermer les pointes. Positionnez la pince perpendiculairement à la pince qui retient la mouche.

Percez les extrémités fermées de la pince à travers la région translucide molle de la cuticule, en prenant soin de ne pas pénétrer si profondément qu’elles ne touchent pas le cerveau. Ensuite, relâchez rapidement, mais régulièrement, la pince de sorte que les pointes s’ouvrent, arrachant l’exosquelette de la tête de mouche. Utilisez l’élan de relâchement des pointes de la pince pour retirer doucement l’exosquelette et la majeure partie de l’œil et de la trachée associés à la tête du tissu cérébral en un seul mouvement.

Un cerveau intact devrait maintenant être visible. À l’aide de la pince, retirez avec précaution les tissus accessoires restants, tels que le tissu trachéal fibreux blanc, en prenant soin de ne pas tirer ou endommager le cerveau proprement dit. Placez les échantillons de cerveau disséqués avec les torses associés dans environ un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % sur de la glace pendant 40 à 60 minutes.

Retirez le paraformaldéhyde, puis rincez les échantillons avec un millilitre d’un X PBS en pipetant la solution de haut en bas trois fois, en prenant soin de ne pas aspirer les cerveaux. Ensuite, retirez le PBS, puis lavez-le cinq fois avec un millilitre d’un X PBT pendant cinq minutes chacune avec une nutation. Ajouter l’anticorps primaire d’intérêt à la dilution appropriée.

Ensuite, incubez les échantillons pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec nutation. Retirez l’anticorps primaire et lavez les échantillons cinq fois avec un millilitre d’un X PBT pendant cinq à 10 minutes chaque lavage avec nutation. Ajouter des anticorps secondaires aux échantillons lavés au moment approprié de la dilution et de l’incubation.

Ensuite, lavez les échantillons six fois dans un millilitre d’un X PBT pendant 10 minutes chacune avec nutation. Cette étape est essentielle pour éliminer tout anticorps secondaire non spécifiquement lié. Incuber les échantillons dans une dilution de un à 10 000 d’un milligramme par millilitre de DAPI dans un millilitre d’une solution de PBT X pendant 30 à 60 minutes avec nutation.

Enfin, rincez les échantillons en ajoutant un millilitre d’un PBS X, puis pipetez la solution de haut en bas trois fois. Placez une lamelle sur une glissière de montage. À l’aide d’une pipette avec une pointe coupée, transférez les cerveaux d’une solution X PBS sur la lamelle.

Ensuite, à l’aide de pinces, séparez le cerveau des corps. À l’aide d’une pointe de pipette fine, vous pouvez retirer le liquide qui se trouve autour du tissu cérébral. Et ensuite, ajoutez 20 à 40 microlitres de support de montage anti-évanouissement.

Écartez doucement la cervelle, tout en déplaçant le milieu visqueux vers l’extérieur. En commençant par le côté, abaissez doucement une deuxième lamelle sur les échantillons, en prenant soin de minimiser le contact du cerveau avec les bulles. Laissez les feuillets se déposer, puis retirez tout excès de liquide du bord des feuillets à l’aide d’une lingette de laboratoire.

À l’aide d’un petit morceau de ruban adhésif, fixez temporairement la paire de lamelles à la glissière de montage. Pour imager les échantillons, utilisez un microscope à fluorescence composée ou un microscope confocal. Ces images montrent des vues antérieure et postérieure de la même drosophile adulte.

Les noyaux cellulaires ont été visualisés par coloration DAPI et les neurones ont été marqués à l’aide d’un marqueur neuronal pan et d’anticorps anti-ELAV. Les neurones dopaminergiques, ou DA, ont été révélés par la coloration des anticorps anti-TH. Des niveaux d’intensité similaires ont été observés entre les deux côtés du cerveau pour tous les canaux d’image.

Des vues agrandies de l’avant et de l’arrière du cerveau permettent un examen détaillé des amas neuronaux DA. Le cluster médial antérieur apparié peut être vu sur les images antérieures, et les groupes médial postérieur et latéral postérieur apparié dans le côté postérieur du cerveau. La quantification de ces neurones a révélé que les mouches mâles de trois jours de la souche w1118 ont généralement 27 neurones DA dans le groupe PPM dans l’ensemble du cerveau, 16 dans le groupe PPL par hémisphère et cinq dans le groupe PAL par hémisphère.

Une moyenne de 97 neurones DA a été observée dans chacun des groupes PAM clusters. 3D la reconstruction des clusters PAL et PAM a également montré que les neurones DA du cluster PAM ont des tailles relativement petites et une coloration TH plus faible que ceux des autres groupes, tels que le PAL. De plus en plus d’études se concentrent sur le cerveau des mouches adultes pour disséquer les voies moléculaires et les circuits neuronaux sous-jacents aux fonctions cérébrales supérieures, et pour modéliser les maladies du cerveau humain.

Dans de telles études basées sur le cerveau, il sera nécessaire de préparer efficacement des échantillons de cerveau avec une morphologie bien préservée. Cela pourrait être particulièrement important dans les écrans cérébraux à grande échelle. J’ai d’abord eu l’idée de cette méthode en luttant pour tenir les mouches dans les pinces.

Au lieu des pinces à pointes pointues que la plupart des chercheurs sur la drosophile utilisent, Shebna a essayé des pinces à bout émoussé et a constaté qu’il était plus facile de disséquer les cerveaux. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de 10 secondes si elle est correctement exécutée. Une fois, j’ai disséqué environ 100 cerveaux de six génotypes différents pour une expérience en une seule journée.

Bien que cette procédure de dissection puisse sembler simple, il est important de la pratiquer d’abord avec des mouches dispensables. L’enquêteur peut également avoir du mal à positionner les forceps sans détruire le cerveau de la mouche. Les cerveaux disséqués peuvent être utilisés pour d’autres études, comme l’ARN, l’hybridation in situ et l’extraction d’échantillons de protéines et d’ARN à partir de tissus cérébraux.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure de disséquer des cerveaux de mouches à la morphologie bien préservée. Nous prévoyons que des améliorations peuvent être développées pour rendre cette procédure plus simple et plus rapide. Cela peut potentiellement devenir automatisé à l’avenir pour des études à grande échelle.

N’oubliez pas que travailler avec le paraformaldéhyde et la pince de dissection tranchante peut être dangereux. Prenez des précautions, comme porter des gants, lorsque vous manipulez des solutions fixatrices et, une fois la dissection terminée, fermez immédiatement la pince avant de la mettre de côté.