Name: Forskoline induite par Gonflement dans Intestinal organites: Un In vitro Essai pour évaluer la réponse des médicaments dans les patients atteints de fibrose kystique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Découvrez le test de gonflement induit par la forskoline pour évaluer la fonction CFTR dans les organoïdes intestinaux de patients atteints de mucoviscidose. Cette méthode permet d'identifier les patients bénéficiant des modulateurs CFTR.

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Ce travail a été soutenu par le programme des FC fondation néerlandaise (NCFS), ZonMW (40-00812-98-14103), le Fonds de recherche de l&#39;Hôpital de Wilhelmina enfants et CZ et Zilverenkruis / Achmea HIT-CF. Nous tenons à remercier S. Heida-Michel, M. Geerdink, KM de Winter-de Groot, et G. Berkers (Département de pneumologie pédiatrique, Hôpital de Wilhelmina enfants, UMC Utrecht), et RHJ Houwen (Département de gastro-entérologie pédiatrique, Wilhelmina Hôpital pour enfants, UMC Utrecht) pour approcher les patients et d&#39;obtenir les biopsies pour la génération d&#39;un Biobanque CF.

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Hans Clevers est l’inventeur de brevets pour la culture d’organoïdes et le test de gonflement induit par la forskoline. Jeffrey M Beekman est l’inventeur d’un brevet pour le test de gonflement induit par la forskoline. Sylvia F Boj et Robert Vries sont employés par la Fondation Hubrecht Organoid Technology (HUB), qui détient la licence exclusive de la technologie Organoïde. Sinon, les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous fournissons un protocole complet pour la génération, l&#39;expansion, la congélation et la décongélation des organites colorectales humaines. Alors que nous avons établi des cultures de organoïdes humains il y a quelque temps 17, il a parfois avéré difficile d&#39;établir la technologie dans d&#39; autres laboratoires sans formation pratique. Nous prévoyons que ces protocoles remplaceront une telle formation. Wnt-3A-milieu conditionné est l&#39;un des réacti...

CF est causée par des mutations dans le gène régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) qui code pour un canal anionique épithéliale. CF touche environ 85.000 personnes dans le monde 1. Plus de 2000 mutations du gène CFTR ont été identifiées ( <a href="http://www.genet.sickkids.on.ca">www.genet.sickkids.on.ca</a> ). Cette diversité explique en partie un large spectre de phénotypes de la maladie observés ( <a href="http://www.CFTR2.org">www.CFTR2.org</a> ) 2, 3. Six classes de mutations du gène CFTR sont définies en fonction de leur effet sur l&#39;expression et la fonction de la protéine CFTR: (I) pas de synthèse, (II) avec facultés affaiblies le trafic, (III) canal défectueux gating, (IV) conductance modifié, (V) les niveaux de normalement réduite fonctionnant CFTR et (VI) ayant une déficience cellulaire stabilité de la surface 4. Bien que les mutations du gène CFTR communes sont bien étudiés, la fonction CFTR et relation avec l&#39;état clinique restent poorly compris au niveau de l&#39;individu, en particulier pour le grand groupe de rares &quot;orphelines&quot; mutations ( <a href="http://www.CFTR2.org">www.CFTR2.org</a> ) 1, 3. Récemment, les médicaments ont été développés qui ciblent la protéine CFTR de manière spécifique à la mutation. Deux classes de CFTR médicaments protéiques de ciblage sont actuellement en usage clinique et ont des modes d&#39;action distincts. Potentialisateurs, tels que le VX-770, d&#39; améliorer l&#39;open-probabilité de CFTR mutant apicale-localisé et agissent directement sur leur addition aux cellules 5. Correcteurs, tels que le VX-809, restaurer le trafic de endoplasmique misfolded CFTR réticulum localisée et nécessitent une pré-incubation avec des cellules avant que les effets sont observés 6. Le potentialisateur de CFTR, le VX-770, a été enregistrée pour les sujets atteints de la mutation G551D 7, 8, ainsi que pour les huit autresCFTR gating mutations, y compris S1251N 9; ensemble, ces mutations sont portés par 5% de tous les sujets des FC. D&#39; autres essais cliniques ont indiqué que le VX-770, combiné avec le correcteur VX-809, a des effets limités mais significatifs sur la fonction pulmonaire et provoque une diminution des taux d&#39;exacerbation chez les sujets homozygotes pour la mutation F508del porté par 45-50% des patients 10, 11. essais cliniques classiques pour identifier les sujets de drogue sensible dans les 50% restants des patients atteints de mucoviscidose sont coûteux et prend du temps et ne sont pas réalisables pour les personnes ayant de très rares génotypes de CFTR. Novel, méthodes personnalisées rentables sont cruciales pour correspondre au nombre croissant de modulateurs de CFTR à des individus porteurs de tout type de mutation CFTR. Jusqu&#39;à présent, l&#39;inclusion d&#39;essai de groupes de patients porteurs de mutations du gène CFTR spécifique a été guidée par des études utilisant mutant transfection du gène CFTR dans hdes systèmes de cellules eterologous, suivie par des études électrophysiologiques dans des chambres d&#39; Ussing 5, 6, 12. En raison d&#39;un manque de modèles animaux de CF adéquates, des études d&#39;efficacité des médicaments dans les cellules épithéliales bronchiques air-liquide-interfaces différenciées dérivées de matériaux explants pulmonaires CF ont été utilisées pour le développement de médicaments 13, 14, 15. Cependant, la disponibilité limitée des tissus d&#39;explants pulmonaires et les procédures invasives pour obtenir des cellules bronchiques de sujets sans maladie en phase terminale d&#39;entraver l&#39;analyse des mutations du gène CFTR moins fréquentes et prévenir le dépistage des drogues d&#39;une manière personnalisée. Pour surmonter ces limitations, les tissus «accès facile», comme organites colorectaux, les cellules des voies respiratoires nasales, et les cellules des voies respiratoires dérivées de cellules souches pluripotentes induites, sont actuellement à l&#39;étude pour les traitements médicamenteux personnalisés. 16, 17. facteurs de croissance pour le côlon / rectum humain, les conditions de culture impliquent définis (épithéliale Growth Factor (EGF), Gastrin, Wnt-3A, R-spondine 3 (Rspo3), et Noggin) combiné avec de petites molécules (nicotinamide, A83-01, et SB202190) dans une matrice de membrane basale. Dans ces conditions, les cellules souches individuelles ou de petits fragments de tissu développent dans fermées, kystique, des structures 3D formées par un épithélium hautement polarisé avec son côté de base orientée vers l&#39;extérieur. Tous les types de cellules apparaissent généralement dans leurs rapports et positions normales. Organites peuvent être étendues sur de longues périodes par rupture mécanique hebdomadaire et re-placage. Ils sont génétiquement et phénotypiquement stables et peuvent être stockés, ce qui permet l&#39; expansion à long terme et de la bio-banking 17. Ils se prêtent àtoutes les manipulations de cellules biologiques standards / génétiques et des techniques analytiques développées pour les lignées cellulaires 2D 18. Nous avons récemment démontré que la fonction CFTR peut être facilement mesurée en organites colorectaux dans une enflure induite par la forskoline (FIS) dosage 19, 20. Lorsqu&#39;il est exposé à la forskoline (FSK) ou, en variante, à la toxine du choléra, organoïdes augmentent rapidement leur adénosine monophosphate cyclique (AMPc) niveaux, ce qui entraîne à son tour l&#39;ouverture du canal CFTR 19. Organites d&#39;individus sains ou de sujets avec des mutations du gène CFTR associées à la fonction résiduelle, seront ensuite gonfler comme une conséquence de l&#39; ion et le transport de l&#39; eau à la lumière organoïdes, l&#39;équivalent in vitro de la diarrhée sécrétoire. La réponse des organites FIS colorectales a été montré précédemment pour être entièrement dépendant de la CFTR, comme indiqué par les organites provenant d&#39;individus CFTR-null, unnd par l&#39;utilisation d&#39;inhibiteurs de CFTR pharmacologiques spécifiques 19. Les grands ensembles de données spécifiques au sujet peuvent être obtenus en quelques semaines après la prise d&#39;une biopsie. Pour le dosage de la FIS décrit en détail ici, organites sont cultivées à partir de biopsies rectales qui peuvent être obtenus à tout âge et avec seulement une gêne limitée 21. Organites sont repiquées chaque semaine par une rupture mécanique dans cryptes simples qui RESEAL facilement et forment de nouveaux organites. Pour exécuter le test FIS, ~ 30-80 de ces petits organites dissociées sont étalées dans chaque puits d&#39;une plaque à 96 puits 19. Le jour de l&#39;essai, les organites sont colorées avec du vert de la calcéine, un colorant fluorescent perméable aux cellules qui est retenu à l&#39;intérieur des cellules vivantes, ce qui facilite l&#39;imagerie en temps réel. Ensuite, FSK, ce qui augmente l&#39;AMPc intracellulaire et active CFTR ainsi, est ajouté afin de stimuler le gonflement organoïde. Potentialisateurs qui agissent sur le CFTR apicale sont ajoutés simultanément wvec la forskoline, alors que les correcteurs qui rétablissent le trafic de CFTR sont ajoutés 24 heures avant l&#39;addition de Fsk. Le gonflement organoide est quantifiée par une analyse d&#39;image automatisé qui calcule l&#39;augmentation relative de la superficie totale de tous les objets fluorescents pour chaque point de temps après l&#39;addition de forskoline. 3D organoide gonflement fournit des avantages et des inconvénients sur les lectures CFTR électrophysiologiques existantes en 2D cellules des voies respiratoires cultivées dans des chambres de Ussing. Un avantage majeur est le débit de l&#39;essai de gonflement. Les cellules sont cultivées et testées en utilisant un seul type de milieu de culture, et un technicien expérimenté peut culture jusqu&#39;à 25 échantillons organoïdes sur une base hebdomadaire tout en quantifiant environ 1200 points de données par semaine dans 12 échantillons de patients. Nous tapons classiquement une seule condition expérimentale par des mesures double ou en triple par plaque et répéter ces mesures en trois points de temps d&#39;incubation indépendants. Au total, environ 300-500 sIngle organoide structures sont ensuite mesurées par condition expérimentale, ce qui conduit à des mesures très précises de la fonction CFTR avec la variabilité technique limitée. Cette précision nous permet de définir clairement les différences de fonction résiduelle et la réponse à des modulateurs de CFTR et nous permet de prendre facilement des effets de fond génétiques entre les patients porteurs de mutations du gène CFTR identiques 19, 22, 23, 24, 25. La qualité des données peut être facilement évaluée à partir d&#39;images de microscope. Alors que la FIS est entièrement dépendant de la CFTR, il est une mesure de résultat indirect pour la fonction CFTR, son hors lecture causé par le couplage du transport d&#39;ions pour le transport des fluides. Cela contraste avec les mesures de la fonction CFTR directe dans des chambres de Ussing, qui mesurent les courants ioniques transépithéliaux 26. chambres Ussing permettent la stimulation de sélection de apical ou basolatéral compartments (dont le test organoide ne permet pas); par perméabilisation membranes basolatérale, la apical anion sécrétion dépendant de la CFTR peut être mesurée de manière sélective 27.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' avancé s Medium modifié Eagles avec mélange nutritif Jambons F-12 (Ad-DF) 500 ml&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific : Invitrogen</td><td>#12634</td><td>stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo Fisher Scientific :&nbsp ; Invitrogen</td><td>#35050</td><td>stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Thermo Fisher Scientific : Invitrogen</td><td># 15630-056</td><td>stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific :&nbsp ; Invitrogen</td><td>#15140-122</td><td>stocké à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Plaque de culture à 96 puits</td><td>Cellstar</td><td>#655180</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture à 24 puits</td><td>Cellstar</td><td>#662160</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture à 6 puits</td><td>Cellstar</td><td>#657160</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS)</td><td>Life Technologies : Gibco</td><td>#14190-094</td><td>stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aigles modifiés Moyen&nbsp ; (DMEM) 500 ml&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific : Invitrogen</td><td>#31966-021</td><td>Pour la production moyenne conditionnée Wnt-3A. Stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Bovogen</td><td>#SFBS LOT#11113</td><td>pour la production moyenne conditionnée Wnt-3A. Stocké à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>L Wnt3A lignée cellulaire</td><td>ATCC</td><td>#CRL-2647</td><td>Pour la production moyenne de conditions Wnt-3A.</td></tr><tr><td>Plasmides TOP/FOP</td><td>Millipore&nbsp ;</td><td>#17-285</td><td>Pour mesurer l’activité Wnt</td></tr><tr><td>pTK-Renilla</td><td>Promega&nbsp ;</td><td>#E2241</td><td>Pour mesurer l’activité Wnt</td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>ATCC</td><td>#CRL-1573</td><td>Pour mesurer l’activité Wnt</td></tr><tr><td>Système d’essai rapporteur à double luciférase</td><td>Promega&nbsp ;</td><td>#E1910</td><td>Pour mesurer l’activité Wnt</td></tr><tr><td>Zeocin&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific : Invitrogen</td><td>#R250-01</td><td>Pour Wnt-3A Sélection de lignées cellulaires</td></tr><tr><td>Supplément B27&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific : Invitrogen</td><td>#17504-044</td><td>stocké à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>N-Acétylcystéine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#A9165-5G</td><td>stockée à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#N0636</td><td>stocké à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Facteur de croissance épithéliale humaine (hEGF)</td><td>PrepoTech</td><td>#AF-100-15</td><td>stocké à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G9145</td><td>stocké à -20 &deg ; </td></tr><tr><td>Inhibiteur du récepteur C TGFb de type I (A83-01)&nbsp ;</td><td>Tocris</td><td>#2939</td><td>stocké à -20 &deg ; </td></tr><tr><td>C Y-27632 dichlorhydrate (RhoKi)</td><td>Selleckchem</td><td>#S1049</td><td>stocké à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>p38 Inhibiteur de MAPK (p38i) (SB202190)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#S7067</td><td>stocké à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>#ant-pm-1</td><td>stocké à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Human Noggin (hNoggin)</td><td>PrepoTech</td><td>#120-10C</td><td>stocké à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>R-spondine humaine 3 (hRspo-3)</td><td>R& D Systems</td><td>#3500-RS/CF</td><td>stocké à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Vancomycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#861987- 250mg</td><td>stocké à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Life Technologies : Gibco</td><td>#15710-049</td><td>stocké à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#431788</td><td>Stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>#354230</td><td>stocké à -80 &deg ; C</td></tr><tr><td>TryplE Express&nbsp ;</td><td>Life Technologies : Gibco</td><td>#12605-010</td><td>pour la trypsinisation d’organoïdes pour la congélation</td></tr><tr><td>Culture cellulaire de récupération Congélation Medium</td><td>Life Technologies : Gibco</td><td>#12648010</td><td>pour la congélation</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Life Technologies : Gibco</td><td>#C3100MP</td><td>stocké à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Forskoline</td><td>R& D Systems</td><td>#1099-50 mg</td><td>stocké à -80 &deg ; C</td></tr><tr><td>Lumacaftor (VX-809)</td><td>Selleckchem</td><td>#s1565</td><td>stocké à -80 &deg ; C</td></tr><tr><td>Ivacaftor (VX-770)</td><td>Selleckchem</td><td>#s1144</td><td>stocké à -80 &deg ; C</td></tr><tr><td>Nom des réactifs/Matériel</td><td>Solvant</td><td>Stock Concentration</strong</td><td>>Concentration finale</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td></td><td>200 mM</td><td>2 mM Hepes</td></tr><tr><td></td><td></td><td>1 M</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td></td><td>10K U/ml 10K &micro ; g/ml</td><td>100 U/ml 100 & micro ; g/ml</td></tr><tr><td>de Zeocin&nbsp ;</td><td></td><td>100 mg/ml&nbsp ;</td><td>125 et micro ; g/ml</td></tr><tr><td>de supplément de B27&nbsp ;</td><td></td><td>100x</td><td>1x</td></tr><tr><td>N-acétylcystéine</td><td>MiliQ H2O</td><td>500 mM</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>DPBS</td><td>1 M</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Facteur de croissance épithéliale humaine (hEGF)</td><td>DPBS 0,1 % BSA</td><td>0,5 mg/ml</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>DPBS</td><td>100 &micro ; Inhibiteur</td> du récepteur M <td>10 nM</td></tr><tr><td>TGFb de type I (A83-01)&nbsp ;</td><td>DMSO</td><td>5 mM</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorhydrate (RhoKi)</td><td>DMSO</td><td>10 mM</td><td>10 &micro ; M</td></tr><tr><td>p38 Inhibiteur de MAPK (p38i) (SB202190)</td><td>DMSO</td><td>30 mM</td><td>10 & micro ; M</td></tr><tr><td>Primocin</td><td></td><td>50 mg/ml&nbsp ;</td><td>100 et micro ; g/ml</td></tr><tr><td>de noggine humaine (hNoggin)</td><td>DPBS 0,1 %BSA</td><td>100 & micro ; g/ml</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>R-spondine humaine 3 (hRspo-3)</td><td></td> <td>varie par lot</td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>Vancomycine</td><td></td><td>10 mg/ml</td><td>50 & micro ; g/ml</td></tr><tr><td>Gentamycine</td><td></td><td>10 mg/ml</td><td>50 & micro ; g/ml</td></tr><tr><td>Acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA)</td><td>MiliQ H2O</td><td>0,5 M</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>DMSO</td><td>10 &micro ; g/ml</td><td>3,3 ng/ml</td></tr><tr><td>Forskoline</td><td>DMSO</td><td>10 mM</td><td>variable</td></tr><tr><td>Lumacaftor (VX-809)</td><td>DMSO</td><td>20 mM</td><td>variable</td></tr><tr><td>Ivacaftor (VX-770)</td><td>DMSO</td><td>20 mM</td><td>variable</td></tr></tbody></table>

forskoline induite par gonflement dans intestinal organites: un<em&gt; in vitro</em&gt; essai pour évaluer la réponse des médicaments dans les patients atteints de fibrose kystique

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Des médicaments modulateurs du régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR) récemment développés corrigent l’expression de surface et/ou la fonction du canal CFTR mutant chez les sujets atteints de mucoviscidose (FK). L’identification des sujets susceptibles de bénéficier de ces médicaments est difficile en raison de la grande hétérogénéité des mutations de CFTR, ainsi que d’autres facteurs inconnus qui contribuent à l’efficacité individuelle des médicaments. Ici, nous décrivons un test simple et relativement rapide pour mesurer la fonction individuelle de CFTR et la réponse aux modulateurs de CFTR in vitro. Les organoïdes épithéliales tridimensionnels (3D) sont cultivés à partir de biopsies rectales dans un milieu organoïde standard. Une fois établis, les organoïdes peuvent être bio-mis en banque pour des analyses futures. Pour le test, 30 à 80 organoïdes sont ensemencés dans des plaques de 96 puits dans une matrice de membrane basale, puis sont exposés à des médicaments. Un jour plus tard, les organoïdes sont colorés au vert calcéine, et le gonflement induit par la forskoline est surveillé par microscopie confocale à cellules vivantes à 37 °C. Le gonflement induit par la forskoline est entièrement dépendant du CFTR et est suffisamment sensible et précis pour permettre de distinguer les réponses médicamenteuses des individus présentant des mutations CFTR différentes et même identiques. Les réponses de gonflement in vitro sont corrélées avec la réponse clinique au traitement. Ce test fournit une approche rentable pour l’identification des individus sensibles aux médicaments, indépendamment de leurs mutations CFTR. Il pourrait également jouer un rôle déterminant dans le développement de futurs modulateurs CFTR.

La figure 1A montre un isolement frais représentatif de cryptes embarqués sur BMM. Les cryptes sont d&#39;une biopsie du côlon d&#39;un sujet CF. Habituellement, un organoïde est généré à partir de chaque crypte (figure 1A - C). En raison du dysfonctionnement du CFTR, la plupart des organites colon des FC ne sont pas kystique, mais sont compacts et avec des projections et des bourgeonnements (Figure 2A - 2B).</st...

Ce protocole décrit un test permettant de mesurer la fonction CFTR et les réponses modulatrices CFTR dans des tissus cultivés de sujets atteints de mucoviscidose (FK). Les organoïdes intestinaux dérivés de la biopsie gonflent de manière induite par l’AMPc, une réponse défectueuse (ou fortement réduite) dans les organoïdes de la mucoviscidose et qui peut être restaurée par l’exposition aux modulateurs de la CFTR.

Forskoline induite par Gonflement dans Intestinal organites: Un<em&gt; In vitro</em&gt; Essai pour évaluer la réponse des médicaments dans les patients atteints de fibrose kystique

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la fonction individuelle du CFTR et l'efficacité des traitements modulant le CFTR à l'aide d'un test de gonflement induit par la forskoline (essai FIS) sur des organoïdes intestinaux générés à partir de patients atteints de mucoviscidose. Cette méthode répond à des questions clés dans le domaine de la mucoviscidose. Elle permet notamment d'identifier les patients susceptibles de bénéficier à long terme de traitements existants ou expérimentaux.Le principal avantage de cette technique est qu'un tissu facilement accessible peut être utilisé pour générer des organoïdes à partir de tout patient atteint de mucoviscidose, indépendamment de l'âge. Les implications de cette technique s'étendent à l'orthothérapie de la mucoviscidose et répondent à un besoin actuel urgent de tester l'efficacité des médicaments de manière rentable et personnalisée. La procédure sera démontrée par Marvin Statia du Hubrecht Organoid Technology et Annelot Vonk du groupe de Jeffrey Beekman.Pour obtenir des données optimales dans le test de gonflement induit par la forskoline, il est essentiel de travailler avec une culture contenant de gros organoïdes présentant

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Ici, un protocole pour récolter, conserver et traiter les souris petits organites intestinaux avec des motifs de pathogènes associés moléculaires (PAMP) et Listeria monocytogenes est décrit, ainsi que l' accent sur ​​l' expression des gènes et des techniques de normalisation appropriées pour la protéine.

le<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture et Pattern Recognition Receptor Stimulation de la souris Intestinal organites

Ce protocole décrit la mesure de la perméabilité de la barrière épithéliale dans en temps réel suite à un traitement pharmacologique en humain organoïdes intestinale à l’aide de la microscopie fluorescente et microscopie des cellules en direct.

Mesure en temps réel de la perméabilité de la barrière épithéliale dans organoïdes intestinale humaine

Nous décrivons ici une méthode pour générer des cultures sphéroïde en trois dimensions des cellules épithéliales nasales humaines. Sphéroïdes sont alors stimulés au lecteur Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR)-ion charge et sécrétion de liquide, quantifier le changement de la taille de luminal sphéroïde comme approximation de fonction CFTR.

Génération de cellules épithéliales nasales humaines sphéroïdes pour mucoviscidose individualisé Transmembrane Conductance Regulator étude

Un protocole détaillé est présenté ici pour décrire un modèle organoïde in vitro à partir de cellules épithéliales nasales humaines. Le protocole propose des options pour les mesures nécessitant un équipement de laboratoire standard, avec des possibilités supplémentaires pour l’équipement et les logiciels spécialisés.

Culture et imagerie des organoïdes épithéliaux nasaux humains

Ce protocole décrit une méthode pour l’étude des protéines membranaires électrogènes en mesurant les changements dans le potentiel membranaire. Ce test fournit une plate-forme pour la lecture fonctionnelle de multiples canaux ioniques exprimés de manière endogène dans des lignées cellulaires épithéliales.

Essai basé sur la fluorescence du potentiel membranaire pour l’étude fonctionnelle à haut débit de deux canaux ioniques endogènes dans deux lignées cellulaires épithéliales

Nous présentons ici un protocole décrivant la culture d’organoïdes intestinaux canins dans un système de soutien perméable à double chambre. L’ensemencement organoïde dans les supports perméables, l’entretien monocouche et les expériences ultérieures de perméabilité aux médicaments sont décrits.

Organoïdes intestinaux canins dans un système de soutien perméable à double chambre

Les organoïdes intestinaux dérivés de la biopsie et les technologies d’organes sur puce sont combinés dans une plate-forme microphysiologique pour récapituler la fonctionnalité intestinale spécifique à la région.

Combinaison d’organoïdes humains et de la technologie Organ-on-a-Chip pour modéliser des fonctionnalités spécifiques à la région intestinale

Ce protocole décrit l’analyse de la morphologie organoïde rectale (ROMA), un nouveau test diagnostique de la fibrose kystique (FK). Les caractéristiques morphologiques, à savoir la rondeur (indice de circularité, IC) et la présence d’une lumière (rapport d’intensité, IR), sont une mesure de la fonction CFTR. L’analyse de 189 sujets a montré une discrimination parfaite entre les FK et les non-FC.

Analyse de la morphologie organoïde rectale (ROMA): un test diagnostique dans la fibrose kystique

Les co-cultures organoïdes-fibroblastes fournissent un modèle pour étudier la niche des cellules souches in vivo . Ici, un protocole pour les co-cultures organoïdes-fibroblastes œsophagiennes est décrit. De plus, l’imagerie de monture entière est utilisée pour visualiser l’interaction fibroblaste-organoïde.

Caractérisation fonctionnelle et visualisation de fibroblastes œsophagiens à l’aide de co-cultures organoïdes

Nous présentons ici un protocole permettant de générer des organoïdes intestinaux de rat et de les utiliser dans plusieurs applications en aval. Les rats sont souvent un modèle préclinique privilégié, et le système organoïde intestinal robuste répond au besoin d’un système in vitro pour accompagner les études in vivo .

Génération et manipulation d’organoïdes intestinaux de rat

Cette étude décrit un protocole pour générer des monocouches 2D d’organoïdes porcins dérivés de l’intestin grêle et du gros intestin. La croissance de ces monocouches est marquée par l’augmentation des valeurs TEER, indiquant une intégrité épithéliale robuste. De plus, ces monocouches présentent des réponses sécrétoires physiologiques dans les expériences en chambre d’Ussing après l’application de forskoline.

Organoïdes intestinaux porcins bidimensionnels reflétant les propriétés physiologiques de l’intestin natif

Découvrez le test de gonflement induit par la forskoline pour évaluer la fonction CFTR dans les organoïdes intestinaux de patients atteints de mucoviscidose. Cette méthode permet d'identifier les patients bénéficiant des modulateurs CFTR.

Forskoline induite par Gonflement dans Intestinal organites: Un In vitro Essai pour évaluer la réponse des médicaments dans les patients atteints de fibrose kystique (Vidéo) | JoVE Journal

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