Forskoline induite par Gonflement dans Intestinal organites: Un In vitro Essai pour évaluer la réponse des médicaments dans les patients atteints de fibrose kystique

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer la fonction individuelle de CFTR dans l’efficacité des traitements modulant CFTR à l’aide d’un gonflement induit par la forskoline, ou test FIS, dans des organoïdes intestinaux générés à partir de patients atteints de mucoviscidose. Cette méthode répond à des questions clés dans le domaine de la mucoviscidose. Plus particulièrement, il aide à identifier les patients qui peuvent bénéficier à long terme de médicaments existants ou expérimentaux.

Le principal avantage de cette technique est que des tissus facilement accessibles peuvent être utilisés pour générer des organoïdes à partir de n’importe quel patient atteint de mucoviscidose, quel que soit son âge. Les implications de cette technique s’étendent à l’orthothérapie de la fibrose kystique et répondent à un besoin urgent actuel de tester l’efficacité des médicaments de manière rentable et individuelle. Marvin Statia de Hubrecht Organoid Technology et Annelot Vonk du groupe Jeffrey Beekman feront la démonstration de la procédure.

Pour obtenir des données optimales sur le gonflement induit par la forskoline, il est essentiel de travailler avec une culture contenant de gros organoïdes à bourgeonnements multiples. Après avoir identifié une telle culture, étiquetez un tube conique de 15 millilitres avec le nom de l’échantillon et un tube comme lavé. Ensuite, utilisez une pipette p1000 pour aspirer soigneusement le milieu des puits de culture organoïdes sans perturber les gouttes de matrice de la membrane basale.

Et ajoutez un millilitre de milieu de base dans chaque puits. Utilisez maintenant la pipette pour briser les gouttes de matrice de la membrane basale dans chaque puits et transférez les suspensions organoïdes résultantes dans le tube de 15 millilitres portant le nom de l’échantillon. Rincez bien chaque avec un autre millimètre de milieu basal et tirez les lavages dans le tube d’échantillon.

Lorsque tous les échantillons ont été prélevés, remplissez le tube d’échantillon jusqu’à un volume final de 12 millilitres avec un milieu basal et utilisez une pipette pré-humide de cinq millilitres pour mélanger la solution. Ensuite, centrafugez les organoïdes, en remettant la pastille en suspension dans un millilitre de milieu de base frais. Couvrez la même pointe de pipette p1000 avec une pointe p10 sans filtre et essayez d’évaluer la suspension 20 fois.

Ensuite, jetez les deux pointes et utilisez une pipette de cinq millilitres pour ajouter quatre millilitres de milieu basal frais à l’échantillon. Inclinez le tube d’environ 70 degrés et mélangez vigoureusement la solution deux à trois fois avec la nouvelle pointe de pipette p1000 pré-humide. Maintenez le tube en position inclinée pendant 10 secondes.

Ensuite, utilisez la même pipette p1000 pour transférer quatre fois le millilitre supérieur de l’échantillon dans les tubes lavés. Une fois le dernier échantillon récolté, prélevez les organoïdes par centrifugation et remettez en suspension la pastille dans 120 microlitres de matrice à membrane basale à 50 %. Placez ensuite une gouttelette de trois microlitres sur une lame de microscope en verre et confirmez la présence d’au moins 30 à 50 organoïdes dans la gouttelette au microscope optique.

Ensuite, plaquez trois gouttelettes oraganoïdes d’un microlitre au milieu de chaque puits d’une plaque de 96 puits et placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes pour solidifier la matrice de la membrane basale. Ajoutez ensuite soit 100 microlitres de milieu pour le côlon complet plus VX809, soit un milieu pour le côlon entier seul dans les puits organoïdes appropriés, et remettez la plaque dans l’incubateur pendant 18 à 24 heures. Le lendemain, utilisez une pipette à répéteur pour ajouter 10 microlitres de solution de calcium dans chaque puits, en remettant les puits en suspension une fois avec une pipette multicanaux pour vous assurer qu’ils se mélangent, et remettez la plaque dans l’incubateur pendant encore 30 minutes.

Pendant que les cellules sont colorées, préréglez l’outil d’imagerie en direct sur le microscope confocal d’imagerie de cellules vivantes à 37 degrés et à cinq pour cent de dioxyde de carbone pour pré-incuber la chambre d’imagerie. À la fin de l’incubation, transférez la plaque sur le support de plaque du microscope confocal et utilisez l’option de configuration intelligente pour sélectionner la piste Alexa floor 488. Ensuite, réglez les cinq ex-objectif et la zone de balayage sur 0,6x pour effectuer un zoom arrière et capturer l’ensemble du puits.

Ajustez la puissance du laser et la sensibilité du détecteur pour permettre une détection optimale des organoïdes marqués en vert de calcium sur l’arrière-plan. Et réglez la profondeur de bits sur huit et la taille de l’image sur 512 x 512 pixels. Utilisez l’option de série chronologique pour définir le temps, la fréquence et les intervalles de mesure.

Et l’option de tuile pour déterminer manuellement les positions individuelles des puits. Ajoutez maintenant 100 microlitres de forskoline fraîchement préparée, et/ou VX770 dans les puits correspondants, en commençant par le premier puits à imager, et commencez la mesure. En raison du dysfonctionnement du régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique, ou CFTR, la plupart des organoïdes de la fibrose kystique du côlon sont de taille compacte et ne gonflent pas ou présentent très peu de gonflement 60 minutes après la stimulation par la forskoline, selon leur génotype.

Cependant, lorsque les organoïdes de la mucoviscidose sont traités avec des modulateurs de CFTR avant la stimulation par la forskoline, les organoïdes présentent une augmentation de l’enflure. Pour quantifier le gonflement, les surfaces totales du vert de calcium peuvent être mesurées à chaque point temporel. Une fois maîtrisées, ces techniques peuvent être complétées en trois ou quatre heures si elles sont exécutées correctement.

Avant de tenter cette procédure, l’étape la plus importante est l’optimisation des conditions de culture des organoïdes intestinaux, car des cultures de bonne qualité détermineront la performance optimale du test FIS. Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez une bonne compréhension de la façon de travailler avec des cultures d’organoïdes intestinaux et de mesurer par la suite l’activité de CFTR et la réponse des modulateurs de CFDR à l’aide d’un test de gonflement induit par la forskoline.