Une méthode de montage polyvalent pour l'imagerie à long terme du développement Zebrafish

L’objectif global de cette méthode est de monter des embryons de poisson-zèbre pour l’imagerie en direct, ce qui permet la croissance normale de la région postérieure du corps. Cette méthode peut être adaptée pour l’imagerie d’autres régions du poisson-zèbre en développement. Cette technique aide à répondre à des questions clés en biologie du développement, telles que la façon dont les comportements cellulaires individuels conduisent à la morphogenèse au niveau des tissus entiers.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet le moment libre du corps postérieur tout en maintenant l’embryon dans la bonne orientation. Pour commencer, ajoutez de l’agarose à bas point de fusion à une concentration finale de 1,5 % au milieu E3 dans un tube de 50 millilitres, et dissolvez l’agarose en le chauffant au micro-ondes. Laissez la solution s’équilibrer à 42 à 45 degrés Celsius dans un bain-marie ou un incubateur de paillasse.

Après avoir tiré les aiguilles de verre selon le protocole de texte. À l’aide d’une paire de pinces, cassez l’aiguille juste au-delà du point où elle fléchit pour créer une aiguille propre et tranchante pour orienter les embryons et enlever l’excès d’agarose. Élevez les embryons jusqu’au stade approprié dans le milieu E3.

Ensuite, à l’aide d’un microscope binoculaire à dissection, utilisez une paire de pinces pointues pour déchorionner les embryons. Incuber les embryons déchotionnés pendant au moins cinq minutes dans une solution de travail de tricaïne. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur en verre, transférez l’embryon déchorionné avec un minimum d’E3 directement dans le tube de 50 millilitres d’agarose à 45 degrés Celsius.

Retirez l’embryon avec environ un millilitre d’agarose de montage et transférez environ 100 microlitres du milieu avec l’embryon au centre d’un micropuits de 10 millimètres au fond d’une boîte de Pétri à fond de verre de 35 millimètres. Pendant que le milieu de montage se durcit, déplacez l’embryon vers le bord du cercle d’agarose, la queue tournée vers l’extérieur. Utilisez l’aiguille capillaire pour orienter l’embryon aussi latéralement que possible afin d’imager le développement postérieur du corps.

Ensuite, avec le capillaire, maintenez l’embryon dans l’orientation latérale souhaitée jusqu’à ce que le gel soit complètement pris. Une fois que la goutte d’agarose a pris, utilisez une solution de travail de tricaïne pour inonder la boîte de Pétri. Ensuite, sous un microscope de dissection avec une base de lumière transmise, ajustez la position du miroir et l’angle de la lumière incidente de sorte que le fort contraste permette de voir clairement les coupes dans l’agarose.

Pour effectuer une coupe, utilisez l’aiguille capillaire ou le micro-scalpel pour couper l’agarose dans un mouvement de sciage de haut en bas, à côté et à mi-chemin le long du jaune, juste derrière les champs cardiaques en formation le long du cinquième somite antérieur, et complètement à travers l’agarose jusqu’au verre. Il est essentiel ici de s’assurer que l’embryon n’est pas endommagé lors de la coupe de l’agarose sur le sac vitellin. Ensuite, faites les deuxième et troisième coupes, en commençant contre l’embryon jusqu’au verre, tangentielle aux cinq premières somites, permettant le déploiement dorsal du corps postérieur.

Ensuite, en commençant à l’intersection des coupes un et trois, faites une coupe diagonale lente vers la fin de la coupe trois tout en soulevant lentement vers le haut pour déloger le carré d’agarose entourant le corps postérieur. À l’aide d’une paire de pinces tranchantes, retirez les blocs d’agarose délogés du milieu embryonnaire en utilisant la paroi de la boîte de Pétri comme support tout en soulevant les morceaux d’agarose. Avant le montage de l’échantillon, utilisez 1 % d’agarose dans E3 pour enduire une parabole en plastique de 100 millimètres à une hauteur de cinq millimètres et laissez-la prendre.

Placez ensuite une goutte d’un millilitre d’agarose à bas point de fusion au centre du plat et laissez-la prendre également. Incorporez les embryons dans de l’agarose à bas point de fusion comme démontré précédemment dans cette vidéo. Cependant, cette fois, retirez l’embryon du tube de 50 millilitres d’agarose avec une plus petite goutte de solution, et placez cette petite goutte sur la goutte d’un millilitre au centre de la boîte.

Utilisez l’aiguille capillaire pour positionner l’embryon au centre de la petite goutte et maintenez sa bonne orientation jusqu’à ce que le gel soit pris. Enfin, utilisez une solution de travail de tricaïne pour inonder le plat et retirer l’excès d’agarose. Un exemple d’embryon de poisson-zèbre injecté avec de l’ARNm codant pour la protéine fluorescente photoconvertible kikumeGR, puis monté au stade 15 somites et soumis à une image en accéléré pendant 12 heures est montré dans cette vidéo animée.

Le corps postérieur est autorisé à se déplacer librement et présente des changements morphologiques similaires à ceux observés chez les embryons qui sont autorisés à se développer sans leur chorion dans des conditions de culture normales. Dans cette vidéo, des embryons ont été injectés au stade 16 cellules avec de l’ARNm codant pour l’histone 2BRFP, qui marque les noyaux, et CAAXGFP, qui marque les membranes cellulaires. Des images ont été prises à l’aide d’un microscope multiphotonique vertical avec un objectif d’immersion dans l’eau 25X à partir de la platine 10 somites pendant trois heures pour visualiser les comportements cellulaires pendant la formation des bourgeons caudals.

On peut voir les cellules générer des protubérances actives et des mouvements directionnels lorsque le bourgeon caudal se forme normalement. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 minutes si elle est bien faite. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de s’assurer que l’embryon est en position latérale pendant que le gel d’agarose se pose.

Sinon, la région d’intérêt se déplacera rapidement hors du champ de vision pendant l’imagerie. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension claire de la façon de monter des embryons de poisson-zèbre pour l’imagerie en direct de l’élongation postérieure du corps.