À long terme direct Imaging Device pour meilleure Manipulation expérimentale des larves de poisson zèbre

L’objectif global de la fabrication de ce dispositif d’imagerie est de créer une plate-forme modifiable pour l’analyse microscopique de la cicatrisation des plaies chez les larves de poisson-zèbre vivantes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la cicatrisation des plaies, telles que la contribution de la réorganisation des fibres de collagène et les réponses cellulaires à la repousse ultérieure des tissus après une blessure. Le principal avantage de cette technique est que la blessure et l’imagerie se produisent dans un seul appareil, tandis que la repousse de la queue n’est pas entravée par l’appareil.

De plus, les multiples compartiments fonctionnels du zWEDGI ont pu être modifiés indépendamment pour s’adapter à différents stades larvaires et à un éventail de protocoles expérimentaux. Pour commencer, modélisez le composant PDMS de l’appareil avec les géométries et les attributs souhaités selon le protocole texte. Après avoir imprimé les moules à l’aide d’une imprimante 3D photopolymère, nettoyez les moules à l’aide d’une brosse fine, d’alcool dénaturé dans un flacon pulvérisateur et d’air comprimé.

Frottez doucement et enlevez la résine non polymérisée, en particulier tout matériau des régions des microcanaux. Ensuite, postpolymérisez les moules dans un appareil de postpolymérisation UV pendant 60 minutes de chaque côté, car la résine non durcie est toxique pour les larves de poisson-zèbre. À l’aide d’un papier de verre de grain 200, poncez le côté de la cavité du moule sur une surface plane jusqu’à ce que toutes les surfaces du plafond soient en contact avec le papier de verre.

Avec du papier de verre de grain 400 et 600, poncez légèrement progressivement pour produire des surfaces lisses et affleurantes sur tous les parements géométriques du moule. Ensuite, à l’aide d’un comparateur, mesurez la profondeur de la cavité après le ponçage afin de vérifier qu’elle est proche de la profondeur de conception. Nettoyez les moules et les disques de couverture en verre en les plaçant dans un nettoyeur à ultrasons rempli d’eau pendant 30 minutes ou en les rinçant à l’eau courante.

Utilisez de l’alcool isopropylique et de l’air comprimé filtré pour nettoyer et sécher les moules et les couvercles. Préparez un banc propre comme lieu de fabrication des appareils afin de minimiser la contamination par les débris en suspension dans l’air. Préparez le PDMS en versant la base et l’activateur dans un rapport de 5:1 dans un gobelet en plastique.

Avec un bâtonnet en bois, mélangez bien pendant deux minutes, en remuant le gel sur lui-même comme si vous pétrissiez du pain. Dégazez le mélange dans un dessiccateur sous vide pendant 25 à 45 minutes jusqu’à ce que toutes les bulles aient disparu. Ensuite, à l’aide d’une seringue de 10 millilitres, remplissez la cavité de chaque moule imprimé en 3D avec environ 0,75 millilitre de PDMS jusqu’à ce que le moule déborde légèrement d’un ménisque.

Dégazez les moules remplis pendant 45 minutes pour éliminer les bulles supplémentaires qui ont pu se former lors du remplissage. Appliquez un disque de couverture en verre sur le moule rempli de PDMS, en appuyant sur le disque à un angle pour éviter que les bulles ne soient piégées. Laissez l’excès de PDMS être expulsé lors de l’application du couvercle du disque en verre.

Ensuite, utilisez une petite pince à cliquet pour maintenir fermement le disque de couverture sur le moule. Pour plus d’efficacité, un dispositif multi-pinces peut être utilisé. Faites durcir le dispositif PDMS et les moules serrés à 100 degrés Celsius dans un four pendant au moins 90 minutes.

Ensuite, sortez les moules du four et laissez-les refroidir jusqu’à ce qu’ils puissent être facilement manipulés. Fixez le moule contenant le dispositif PDMS durci dans un étau d’établi de sorte que les géométries du moule soient orientées vers le haut, parallèlement à l’établi du poste de travail. Commencez à retirer l’appareil PDMS à l’aide d’une pince à épiler à pointe plate pour libérer le robinet PDMS du moule.

Ensuite, faites le tour du périmètre du moule à l’aide de la pince à épiler. Le PDMS doit être durci pendant au moins 90 minutes à 100 degrés Celsius, sinon il restera collant et collera au moule. Une bonne indication que vous avez durci l’appareil assez longtemps est que vous verrez en fait une bulle d’air à l’interface entre le moule et l’appareil PDMS, indiquant qu’il sera facilement retiré.

Utilisez de l’air comprimé filtré et une pince à épiler pour soulever doucement l’appareil hors du moule en tenant la languette et en soufflant de l’air sous l’appareil. Ensuite, placez le dispositif PDMS à l’envers à l’intérieur du couvercle d’un plat à fond en verre de sorte que les cales du tunnel de retenue touchent le plastique. Ensuite, placez le couvercle de la parabole avec le zWEDGI renversé et le plat à fond en verre correspondant dans un nettoyeur plasma avec le verre intérieur vers le haut.

Évacuez la chambre de nettoyage du plasma jusqu’à ce que la pression atteigne 500 millitorr. Réglez la fréquence radio, ou puissance RF, sur élevée et exposez l’appareil et l’antenne à la fréquence RF pendant environ deux minutes. Ensuite, dépressurisez lentement la chambre et remettez l’appareil et le plat dans une hotte de salle blanche.

Retirez le dispositif PDMS du couvercle de la parabole. Ensuite, retournez le PDMS zWEDGI dans l’orientation correcte sur le verre en le positionnant soigneusement sur le puits central de la parabole à fond de verre. Pour assurer l’adhérence du PDMS sur le verre, utilisez l’extrémité arrière de la pince à épiler pour appliquer une pression autour des minuscules géométries des microcanaux, en lissant le PDMS vers les bords.

Appuyez légèrement sur l’appareil PDMS pour vous assurer que des bulles d’air ne sont pas piégées sous l’appareil. Ajoutez 70 % d’éthanol dans le plat et, à l’aide d’une micropipette, rincez les canaux, y compris à travers le tunnel de retenue. Ensuite, retirez l’éthanol et utilisez de l’eau distillée pour rincer l’appareil deux ou trois fois avant de le laisser sécher à l’air.

Remplissez les canaux de lait écrémé et incubez l’appareil pendant 10 minutes à température ambiante pour minimiser l’adhérence des larves à la lamelle en verre du plat. Ensuite, immergez doucement l’appareil plusieurs fois dans de l’eau distillée double pour le rincer et laissez-le sécher à l’air libre. Après avoir anesthésié les larves selon le protocole de texte, utilisez quelques microlitres de tricaïne E3 pour pré-mouiller les canaux de l’appareil.

À l’aide d’une pointe de pipette à large orifice, prélevez une seule larve et déposez-la dans le canal de chargement. Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette ou d’un outil similaire, orientez la larve dans la chambre de chargement, le côté dorsal faisant face au bord le plus droit de la chambre de chargement et la queue faisant face au tunnel de retenue. Retirez soigneusement le liquide de la chambre de blessure, permettant à la larve de s’écouler dans le tunnel de retenue.

Retirez la majeure partie du liquide tout en maintenant l’humidité autour de la larve. La larve doit être correctement orientée dans le tunnel de contention car la majeure partie du liquide est éliminée. Mais il doit rester suffisamment de liquide autour des larves.

L’orientation peut être ajustée après l’ajout d’agarose, mais doit être accomplie avant que l’agarose ne se solidifie. Pipeter 1 % LMP d’agarose dans la tricaïne E3 sur la tête de la larve, en remplissant la chambre de chargement, et laisser l’agarose se solidifier avec la larve dans la bonne position. Ajoutez de la tricaïne E3 dans la chambre de blessure au besoin pour maintenir l’hydratation.

Ensuite, répétez ce processus de chargement pour les deux canaux restants. À l’aide d’une aiguille de seringue, retirez avec précaution toute agarose qui s’est infiltrée par le tunnel de contention dans la chambre de blessure. Pour les plaies, l’imagerie à court terme ou l’isolement du traitement des plaies, ajoutez plus de tricaïne E3 sur l’agarose.

Pour blesser les larves dans la chambre de blessure, utilisez une lame de scalpel stérile pour transecter la nageoire caudale en arrière de la notochorde. Ajoutez de la tricaïne E3 supplémentaire si nécessaire et replacez le couvercle du plat de culture. Installez l’appareil zWEDGI avec des larves anesthésiées sur un microscope inversé dans un insert de platine qui accueillera la parabole à fond de verre de 60 millimètres.

Localisez la queue des larves dans le canal le plus élevé, en tournant la parabole au besoin pour mettre la queue dans la position souhaitée. Imagez la larve au besoin pour l’expérience spécifique. À la fin de l’expérience, retirez l’antenne zWEDGI du microscope.

Après avoir retiré les larves et la gélose conformément au protocole de texte, utilisez de l’éthanol et de l’eau distillée pour nettoyer le zWEDGI comme démontré précédemment, et mettez-le à l’envers pour le faire sécher à l’air. Rangez l’appareil couvert dans un endroit frais et sec. Voici des images utilisant la microscopie multiphotonique pour la seconde harmonique, ou l’imagerie SHG des fibres de collagène dans la nageoire caudale pour illustrer les capacités d’imagerie du zWEDGI.

Avant de blesser, le SHG a détecté des fibres de collagène qui rayonnent vers l’extérieur de la notocorde à l’extrémité de la nageoire. Peu de temps après la blessure, la distance entre l’extrémité de la nageoire contractée et le centre de la nageoire augmente avec le relâchement de la plaie. Le zWEDGI permet de collecter des données tridimensionnelles au fil du temps, offrant une vue plus complète des changements dynamiques qui se produisent dans la structure de la matrice extracellulaire.

La nature 3D de la collecte de données permet une reconstruction spatiale à l’aide d’un logiciel de rendu. Ces reconstructions et les options de rotation ultérieures illustrent que la contraction et le relâchement de la nageoire se produisent non seulement dans le plan XY de la collection d’images, mais aussi dans l’axe Z, lorsque la queue s’aplatit à partir de la boucle ascendante de l’état contracté. Une fois les moules réutilisables imprimés, la technique de fabrication peut être réalisée en trois à quatre heures.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de s’assurer qu’aucune bulle d’air n’est piégée dans le PDMS avant le durcissement et de durcir les appareils suffisamment longtemps avant d’essayer de les retirer des moules. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’application localisée de médicaments, le marquage d’anticorps ou la purification d’ARN et de protéines peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’impact de la présence de médicaments ou d’inhibiteurs sur la cicatrisation des plaies. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la cicatrisation des plaies pour explorer la dynamique du collagène, la réponse des cellules immunitaires et la repousse des tissus chez les larves de poisson-zèbre.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication d’un zWEDGI et de son utilisation pour blesser et imager en direct les larves de poisson-zèbre. N’oubliez pas que les résines d’impression 3D photopolymères sont dangereuses pour l’homme et toxiques pour le poisson-zèbre. Des précautions doivent être prises, telles que le port de gants et l’utilisation d’un masque facial lors de la manipulation de pièces imprimées en 3D non polymérisées, et s’assurer que toute la résine restante sur les impressions est durcie avant d’essayer de remplir les moules avec du PDMS.