Un protocole pour Rapid Post-mortem Culture cellulaire de Diffuse Intrinsic Pontine gliome (DIPG)

L’objectif global de ce protocole de culture cellulaire post-mortem rapide est de générer des cultures cellulaires durables dérivées de patients de gliome pontique intrinsèque diffus afin de faciliter les expériences nécessaires pour comprendre et finalement développer des thérapies efficaces pour le DIPG. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la biologie fondamentale et les stratégies thérapeutiques du gliome pontique intrinsèque diffus, par exemple si certains médicaments fonctionnent dans différentes cultures dérivées de patients. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’étudier directement la biologie des cellules dérivées de patients.

Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie du DIPG, car elle permet de tester différentes stratégies thérapeutiques pour différents sous-types génétiques de la maladie. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du DIPG, elle peut également être appliquée à d’autres maladies, telles que d’autres gliomes pédiatriques de haut grade, des glioblastomes adultes ou d’autres tumeurs du système nerveux central. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette technique auront du mal, car il est difficile de se procurer et de traiter rapidement des échantillons d’autopsie de manière efficace.

Avant la préparation de l’échantillon, stérilisez le capuchon de culture tissulaire, ainsi que les lames de rasoir, les hémostats incurvés et d’autres outils non stériles sous la lumière UV pendant une heure, et effectuez toutes les étapes suivantes dans des conditions stériles. Ensuite, transférez le tissu dans une boîte de culture cellulaire à paroi haute de 100 millimètres sur 20 millimètres. Retirez le milieu restant de l’expédition et remplacez-le par 10 à 15 millilitres de milieu de culture froid.

Ensuite, à l’aide des hémostats incurvés pour saisir une lame de rasoir, hachez finement le tissu tout en retirant les vaisseaux sanguins ou les méninges. Les fragments de tissu finaux doivent être inférieurs à un millimètre. Ensuite, transférez le tissu dans un tube conique propre de 50 millilitres.

Lavez la boîte de culture cellulaire avec cinq millilitres supplémentaires de milieu de culture froid et transférez l’échantillon dans le tube conique. Répétez cette étape de lavage si nécessaire pour transférer le tissu restant. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, triturez doucement l’échantillon quatre à cinq fois.

Laissez les plus gros fragments de tissu se déposer au fond du tube. Si nécessaire, centrifugez brièvement l’échantillon pendant une minute. Pour collecter la fraction dissociée, retirez le surnageant et filtrez à travers un filtre de 100 microns dans un nouveau tube conique de 50 millilitres étiqueté Dissociation mécanique.

Retournez le filtre sur le tube conique d’origine et lavez-le avec un milieu de culture pour récupérer les fragments de tissu. Ensuite, centrifugez la fraction de dissociation mécanique pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le surnageant de la fraction de dissociation mécanique granulée et remettez le tissu en suspension dans un milieu de culture froid.

S’il y a plus de cinq millilitres de tissu dans le tube conique de dissociation mécanique, divisez le tissu en d’autres tubes coniques de 50 millilitres de sorte qu’aucun tube ne contienne plus de cinq millilitres de tissu. Ensuite, stockez la fraction dissociée mécaniquement sur de la glace jusqu’à l’étape de centrifugation par gradient de saccharose. Dans cette procédure, centrifugez le tube conique contenant les fragments de tissu restants pendant cinq minutes.

Après cela, retirez le surnageant et ajoutez la solution de digestion enzymatique préchauffée, de sorte qu’il y ait cinq millilitres de solution de digestion pour chaque millilitre de tissu. Ensuite, scellez le couvercle du tube conique avec un film de laboratoire et incubez la réaction sur un rotateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, triturez doucement les échantillons.

À l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, pipetez l’échantillon de haut en bas six à huit fois et évitez de générer des bulles d’air excessives. Ensuite, ajoutez une pointe de pipette de 1 000 microlitres à l’extrémité de la pipette et triturez l’échantillon six à huit fois supplémentaires. Laissez les morceaux restants se déposer au fond du tube.

Ensuite, retirez et filtrez le surnageant avec les cellules encore en suspension à travers un filtre de 100 microns dans un nouveau tube conique de 50 millilitres étiqueté Dissociation enzymatique et stockez-le sur de la glace. Ensuite, centrifugez le tube de dissociation enzymatique pendant cinq minutes et poursuivez la centrifugation par gradient de saccharose. Si l’échantillon est toujours en suspension dans la solution, centrifugez-le pendant cinq minutes.

Ensuite, retirez le surnageant et remettez le tissu en suspension dans 20 millilitres de HBSS froid sans calcium ni magnésium. Ensuite, portez le volume à 25 millilitres avec du HBSS froid. Ajouter lentement 25 millilitres de solution de saccharose de 1,8 molaire et retourner le tube pour mélanger.

Il en résulte un gradient de saccharose de 0,9 molaire. Ensuite, centrifugez l’échantillon sans pause pendant 10 minutes. Aspirez soigneusement les débris de myéline dans autant de solution de saccharose que possible.

Ensuite, lavez l’échantillon en ajoutant 30 millilitres de HBSS froid sans calcium ni magnésium, et en mélangeant doucement. Après cela, centrifugez-le pendant cinq minutes. Dans cette procédure, retirez le surnageant de lavage.

Ajoutez cinq millilitres de tampon de lyse ACK et remettez doucement la pastille en suspension en faisant tourner le tube pendant une minute à température ambiante. Ensuite, éteignez la lyse en ajoutant 30 millilitres de HBSS froid sans calcium ni magnésium. Ensuite, centrifugez-le pendant cinq minutes.

Remettez en suspension la pastille cellulaire finale dans 10 à 15 millilitres de TSM complet chaud avec des facteurs de croissance, et quantifiez la densité cellulaire viable sur un hémocytomètre, en utilisant l’exclusion du bleu de trypan. Ensuite, transférez la suspension cellulaire finale dans un nouveau flacon de culture T75. Ajoutez des facteurs de croissance supplémentaires tous les deux jours pour maintenir les niveaux globaux de facteurs de croissance et surveillez le développement des neurosphères des cellules tumorales.

Voici divers exemples de la façon dont les échantillons peuvent apparaître, des premiers stades de la culture à une culture durable. Initialement, les cultures en plaques et les cultures précoces ne semblent souvent pas contenir beaucoup de cellules survivantes. De plus, les amas de cellules précoces ne présentent souvent pas le degré de contraste généralement associé aux neurosphères.

Cependant, le passage initial de ces amas de cellules, combiné au filtrage inverse des amas de cellules, peut isoler des cellules tumorales saines capables de former des sphères. Le filtrat contient généralement des débris restants. Ces échantillons dérivés de patients peuvent ensuite être conservés en culture pendant plusieurs passages.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de s’assurer que l’échantillon est maintenu à une température froide à chaque étape, à l’exception de la dissociation enzymatique, et de minimiser la manipulation traumatique de l’échantillon. À la suite de cette procédure, des études supplémentaires peuvent être réalisées, telles que le dépistage de médicaments in vitro ou la xénogreffe orthotopique, pour répondre aux questions ultérieures sur la pathobiologie des DIPG.

Après son développement, cette technique de culture a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la neuro-oncologie pédiatrique pour explorer de nouvelles avenues thérapeutiques pour les enfants atteints de DIPG. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon d’effectuer des protocoles de culture cellulaire post-mortem rapides sur des échantillons de tumeurs cérébrales. N’oubliez pas que travailler avec des tissus humains peut être dangereux et que des précautions, telles que le port d’un équipement de protection individuelle et une technique stérile, doivent toujours être utilisées.