Open Source Analyse unique pour particules super-résolution Microscopie avec VirusMapper

Ce manuscrit utilise le logiciel open-source basée à Fidji VirusMapper d'appliquer une analyse unique particule aux images de microscopie de super-résolution afin de générer des modèles précis de la structure à l'échelle nanométrique.

L’objectif global de cette procédure est de produire des modèles moléculaires de haute précision de virus ou de complexes macromoléculaires en appliquant l’analyse de particules uniques à des images à super-résolution de structures avec des composants marqués par fluorescence. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la virologie, notamment l’architecture protéique de virus complexes et la façon dont elle change au cours de l’infection. Le principal avantage de cette technique est qu’en collectant plusieurs images de la même structure, il devient possible de générer une carte de haute précision de ses composants.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la structure des virus, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que d’autres agents pathogènes et complexes macromoléculaires au sein de cellules de mammifères. Tout d’abord, imagez l’échantillon avec la microscopie à fluorescence à super-résolution. Acquérez des images de plusieurs champs de vision contenant des centaines à des milliers de particules bien séparées sans structures fluorescentes indésirables.

Une fois les images obtenues et traitées, importez et concaténez les images dans une pile avec des canaux intercalés. Si nécessaire, convertissez l’image concaténée d’une hyper-pile en une pile. Ensuite, sélectionnez Extraire les structures virales" dans le sous-menu VirusMapper et définissez le chemin d’accès au fichier pour les particules extraites.

Indiquez le nombre de canaux de fluorescence imagés. Réglez le canal de référence sur le canal de fluorescence dans lequel les particules ont l’aspect le plus cohérent. Si ces particules n’ont pas de maximum central, appliquez un flou gaussien de pré-détection pour induire l’apparition d’un maximum.

Ensuite, estimez le diamètre en pixels des plus grosses particules. Définissez le rayon de retour sur investissement à un peu plus de la moitié de cette valeur. Estimez le nombre de retours sur investissement nécessaires par image.

N’utilisez pas plus de cent retours sur investissement au départ. Définissez le chevauchement maximal de la zone d’intérêt en fonction de la séparation des particules. Prévisualisez les retours sur investissement de ce cadre.

Ajustez le rayon, le nombre de retours sur investissement et le chevauchement maximal afin que chaque particule du cadre soit enfermée dans un seul retour sur investissement. Assurez-vous que les zones d’intérêt sont au moins quelques pixels plus larges que les plus grosses particules. Ensuite, cliquez sur OK pour exécuter la segmentation.

Fermez l’exemple d’image dans le gestionnaire de retour sur investissement après l’extraction. Ne renommez pas les jeux de particules extraits. Sélectionnez Générer des graines" et ouvrez le dossier contenant les données de particules extraites.

Définissez le canal de référence et sélectionnez tous les canaux pour lesquels une graine doit être générée. Si nécessaire pour correspondre aux modèles précédents, faites pivoter les graines de quatre-vingt-dix degrés. Pour les canaux dans lesquels les particules n’ont pas de maximum central, augmentez la valeur du flou gaussien de pré-alignement comme précédemment.

Si les canaux ne sont pas alignés de près, activez la correction de décalage pour les canaux non de référence. Recherchez dans la séquence de particules une structure qui apparaît de manière cohérente. Identifiez une particule représentative et entrez le numéro d’image correspondant dans le champ Images à utiliser.

Examinez les graines résultantes. La sélection des semences est une étape critique de cette procédure. Visualisez attentivement les données brutes pour identifier une ou plusieurs structures à modéliser.

La qualité du modèle dépend fortement du choix de graines qui reflètent fidèlement ces structures. Ajustez le canal de référence, le rayon de flou gaussien et la correction de décalage si nécessaire pour optimiser l’identification d’images supplémentaires avec des valeurs de départ similaires. Continuez à ajouter des images et à ajuster les paramètres de génération jusqu’à ce que la structure moyenne représente le mieux une structure observée dans les données.

Entrez le nom du dossier et le préfixe du fichier pour les graines. Cliquez sur OK pour enregistrer les images de départ pour une modélisation ultérieure. Sélectionnez Générer des modèles basés sur les graines" et ouvrez le dossier des particules extraites.

Chargez les moyennes de départ pour chaque canal. Si vous effectuez une découverte de structure basée sur les références, sélectionnez un canal de référence pour l’alignement. La structure de particule connue dans un canal peut être utilisée comme référence pour aligner un deuxième canal inconnu.

Cela permet une cartographie impartiale de la structure inconnue. Gardez à l’esprit que le décalage chromatique entre les canaux doit être corrigé à l’avance. Si l’analyse recherche de petites différences ou des caractéristiques subtiles dans le modèle, sélectionnez Intensité de l’image carrée lors de la correspondance du modèle.

Définissez la similarité minimale entre soixante et quatre-vingts pour cent et le nombre d’itérations à un. Sélectionnez les modèles et les particules à afficher pendant le calcul et générez les modèles d’aperçu. Inspectez les modèles d’aperçu.

Augmentez la similarité minimale pour n’inclure que les particules ayant la morphologie souhaitée. Optimisez les autres paramètres de calcul du modèle si nécessaire et sélectionnez des éléments supplémentaires lors du processus de génération du modèle à afficher si vous le souhaitez. Une fois que les modèles de prévisualisation sont satisfaisants, augmentez le nombre d’itérations à dix.

Définissez le nom du dossier et le préfixe du fichier. Cliquez sur OK pour enregistrer les piles d’évolution du modèle contenant toutes les itérations du modèle final. Un virus de la vaccine recombinant avec deux protéines marquées avec des protéines fluorescentes vertes et rouges a été imagé par microscopie à illumination structurée et modélisé avec le plug-in VirusMapper.

Les graines ont été générées séparément pour les orientations frontale et sagittale, chacune moyennée à partir de cinq particules représentatives. Selon l’orientation du virus, on peut distinguer un ou deux corps latéraux. Par conséquent, des modèles distincts peuvent être générés pour les deux orientations.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la qualité des modèles dépend en grande partie de la qualité des données brutes acquises. Bien que l’analyse d’une seule particule puisse augmenter la précision, elle ne peut pas compenser les images de mauvaise qualité. Suite à cette procédure, une quantification supplémentaire ou un ajustement de modèle peut être effectué sur ces modèles.

Cela peut aider à répondre à des questions supplémentaires, notamment sur, par exemple, les changements à l’échelle nanométrique de l’architecture virale pendant l’infection. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de l’utilisation du logiciel d’analyse de particules uniques VirusMapper pour générer des modèles d’architecture moléculaire à partir d’images en super-résolution.