Isolation simultanée de cardiomyocytes de haute qualité, de cellules endothéliales et de fibroblastes d'un coeur de rat adulte

L’objectif global de cette procédure est d’isoler simultanément des cardiomyocytes, des cellules endothéliales et des fibroblastes viables du cœur du rat pour leurs analyses individuelles in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine cardiovasculaire sur les mécanismes de signalisation impliqués dans l’hypertrophie cardiaque, les lésions d’ischémie-reperfusion, la fonction endothéliale et la fibrose cardiaque. Le principal avantage de cette technique est que toutes les principales cellules cardiaques peuvent être isolées simultanément, ce qui peut réduire les coûts de recherche associés et le nombre d’animaux expérimentaux.

Après une injection d’eau distillée et une chasse d’eau Powell de 50 millilitres, remplacez le milieu par 80 millilitres de milieu Powell frais et utilisez une pipette Pasteur en verre du cylindre de verre pour perfuser continuellement le milieu avec du carbogène. Ensuite, à l’aide de deux paires de fines pinces incurvées, montez un cœur de rat fraîchement récolté via l’aorte sur le système de perfusion Langendorff, et placez l’extrémité de la canule du système de perfusion entre la première branche aortique et la valve aortique. Fixez l’aorte à l’aide d’une pince crocodile.

Ouvrez la valve de la canule, puis fixez le cœur avec une suture chirurgicale. Laissez 35 millilitres du milieu de perfusion passer à travers le cœur sous forme de goutte à goutte, en éliminant tout sang résiduel. Placez l’entonnoir collecteur sous le cœur et démarrez la pompe péristaltique pour faire recirculer le milieu de perfusion de l’entonnoir collecteur vers le réservoir.

Ajoutez la solution de collagénase au milieu de perfusion et perfusionnez le cœur avec la solution de collagénase en recirculation pendant 30 minutes. À la fin de la digestion, utilisez des ciseaux pour retirer le cœur du système Langendorff et placez-le dans une boîte de Pétri en verre. Maintenant, retirez les oreillettes et tout tissu adipeux restant du cœur.

Pour éviter la contamination des cellules épithéliales, utilisez deux pinces pour retirer soigneusement le péricarde. Coupez le cœur au milieu et placez les moitiés dans le hachoir à tissus. Hachez le cœur deux à trois fois et transférez les morceaux de tissu dans un tube conique de 15 millilitres contenant 12 millilitres de tampon de digestion de la perfusion Langendorff.

Digérez les fragments de tissu dans un bain-marie pendant cinq à 10 minutes, en les mélangeant de temps en temps avec une pipette en plastique jetable de cinq millilitres. Filtrez ensuite la suspension cellulaire à travers un tamis de 100 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres. Rincez le système de perfusion avec un minimum d’un litre d’eau distillée suivi de 100 millilitres d’hydroxyde de sodium normal 0,1 pendant 30 minutes, puis rincez le système avec deux à trois litres d’eau distillée et séchez l’appareil avec de l’air rincé.

Prélevez les cellules filtrées par centrifugation et utilisez une pipette jetable pour transférer soigneusement la cellule endothéliale et le surnageant contenant des fibroblastes dans un nouveau tube de 50 millilitres. Remettez le granulé en suspension dans six millilitres de solution de calcium. Au bout d’une minute, collectez les cellules avec une deuxième centrifugation et remettez la pastille en suspension dans six millilitres de solution de calcium deux.

Au bout d’une minute, diluez la suspension cellulaire avec l’ajout de 12 millilitres de solution de calcium trois, et mélangez bien en l’inclinant doucement. Après une autre centrifugation, remettre la pastille en suspension dans 20 millilitres de milieu CCT préchauffé. Ensuite, aliquotez un millilitre de cellules dans chacune des 20 boîtes de culture cellulaire stériles de 35 millimètres pré-enrobées de laminine, et placez les cellules dans un incubateur de culture cellulaire sans dioxyde de carbone, en remplaçant le milieu par deux millilitres de milieu CCT frais pour éliminer toutes les cellules mortes après deux heures.

Maintenant, centrifugez la cellule endothéliale et le fibroblaste contenant du surnageant, et remettez la pastille en suspension dans 1,5 millilitre de tampon d’isolement des cellules endothéliales. Transférez les cellules dans un tube d’échantillon de deux millilitres et ajoutez l’anticorps CD31 anti-rat de souris dans les cellules pour une incubation de 30 minutes à quatre degrés Celsius avec rotation de bout en bout. À la fin de l’incubation, ajoutez des billes IGG anti-souris Pan pour un 20 en incubation à quatre degrés Celsius, avec rotation de bout en bout.

À la fin de l’incubation des billes, placez les cellules dans un support magnétique pendant deux minutes et utilisez une pipette d’un millilitre pour retirer soigneusement le surnageant contenant principalement des fibroblastes. Observez les fibroblastes sur une boîte de culture de 10 centimètres contenant 10 millilitres de milieu de culture cellulaire de fibroblastes, et placez les cellules dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon de lavage dans le tube de cellules endothéliales et fermez le tube.

Secouez doucement les cellules quatre à cinq fois pour remettre les billes en suspension. Remettez ensuite le tube dans l’aimant et retirez le tampon de lavage au bout d’une minute. Après le dernier lavage, remplacez le tampon de lavage par un millilitre de milieu de culture de cellules endothéliales MV2, et ensemencez les cellules endothéliales dans un seul puits d’une plaque à 12 puits, pour leur culture pendant la nuit dans l’incubateur de culture cellulaire.

À la fin de l’incubation des fibroblastes, lavez deux à trois fois les cellules attachées avec un volume approprié de PBS préchauffé. Ensuite, ajoutez un milieu de culture cellulaire de fibroblastes frais préchauffé aux cellules et retournez les fibroblastes dans l’incubateur de culture cellulaire. Le lendemain matin, remplacez le surnageant sur la culture de cellules endothéliales par un milieu de culture de cellules endothéliales frais, et retournez les cellules dans l’incubateur, en remplaçant le milieu tous les deux à trois jours, jusqu’à ce qu’elles soient semi-confluentes.

Ensuite, lavez la culture de cellules de fibroblastes attachées avec du PBS frais préchauffé comme cela vient d’être démontré, et nourrissez les cellules avec un milieu frais préchauffé. La procédure d’isolement des cardiomyocytes permet d’obtenir une population de cellules cardiaques striées, pures à 70 % et viables, en forme de bâtonnet. L’analyse de l’oscillation calcique intracellulaire de cardiomyocytes isolés chargés de fura AM, en réponse à une répurfusion d’ischémie dans les cardiomyocytes peut alors être effectuée, ainsi que l’analyse des modifications de la signalisation calcique dans les cellules endothéliales isolées par billes magnétiques et les fibroblastes, après l’ajout d’ATP.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de configurer correctement ce système de perfusion et de fixer rapidement le cœur dans le système dès qu’il est prêt. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche cardiovasculaire pour explorer la signalisation impliquée dans différentes physiopathologies cardiovasculaires.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des principes de base de l’isolement et de la culture des cellules cardiaques. N’oubliez pas que travailler avec des instruments chirurgicaux et des réactifs de culture cellulaire peut être extrêmement dangereux, et que des précautions, telles que l’utilisation prudente des instruments et l’utilisation de gants, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.