Isolement et culture simultanés des myocytes auriculaires, des myocytes ventriculaires et des non-myocytes provenant d’un cœur de souris adulte

Une méthode est décrite pour l’isolement simultané des myocytes et des non-myocytes des atria et des ventricules d’un coeur adulte simple de souris. Ce protocole a comme résultat des rendements cohérents des myocytes cardiaques et des non-myocytes fortement viables et détaille les conditions optimales de culture cellule-spécifique pour le phénotypage et l’analyse in vitro.

Bonjour, je m’appelle Chris Glembotski. Je suis professeur de médecine à la faculté de médecine de l’Université de l’Arizona à Phoenix. Et je suis le directeur du Translational Cardiovascular Center, également situé ici à Phoenix.

J’aimerais vous présenter aujourd’hui deux personnes qui vont faire la démonstration de notre nouvelle technique, le Dr Erik Blackwood, mon boursier postdoctoral principal et professeur en formation, et Mlle Alina Bilal, associée de recherche principale. Les protocoles actuels d’isolement des myocytes cardiaques limitent la quantité et la viabilité des cellules en culture, créant une impasse expérimentale pour approfondir notre compréhension de la physiologie et de la physiopathologie cardiaques. Ce protocole vise non seulement à accélérer le processus d’isolement des cellules cardiaques murines adultes, mais aussi à augmenter le rendement cellulaire et la viabilité des cellules cardiaques auriculaires et ventriculaires simultanément à partir d’un seul cœur de souris.

Cette technique a de profondes implications pour la découverte thérapeutique et que des maladies comme la fibrillation auriculaire peuvent être mieux caractérisées à un niveau spécifique au type de cellule, ce qui permet d’identifier des cibles thérapeutiques. Nous recommandons aux personnes sans expérience préalable en microchirurgie de pratiquer intensivement les étapes d’explantation de l’aorte ascendante et de canulation avant de tenter le protocole d’isolement complet. Commencez par utiliser des ciseaux pour faire une incision cutanée médiane afin d’ouvrir rapidement la poitrine d’une souris C57 noire 6J anesthésiée de 10 semaines du milieu de l’abdomen à la mâchoire.

Entrez dans le péritoine et dégagez le diaphragme par dissection contondante. Coupez la cage thoracique avec des incisions le long de la paroi thoracique sur la face latérale des deux côtés et coupez les connexions fibreuses entre le cœur et la paroi thoracique. Après l’ablation complète de la cage thoracique, utilisez de petites pinces et des ciseaux pour soulever doucement le cœur par l’apex en exposant la face postérieure du cœur.

Pour explanter le cœur, disséquez immédiatement l’artère inférieure à l’artère innominée sur l’aorte ascendante et placez immédiatement le cœur dans un milieu de perfusion cardiaque glacé. Disséquez rapidement le tissu restant pour exposer l’aorte ascendante et utilisez des pinces et des ciseaux de microdissection pour dégager la zone entourant l’aorte de l’excès de tissu. À l’aide d’une pince à pointe fine, positionnez l’aorte nettoyée sur deux millimètres sur une canule de perfusion et fixez la canule avec une suture en soie 5-0.

Rincer le cœur canulé avec un milieu de perfusion cardiaque à un débit de trois millilitres par minute pendant quatre minutes avant de passer au tampon de digestion pendant 15 à 17,5 minutes. Au cours des dernières minutes de la perfusion, prélevez huit millilitres du flux tampon de digestion et transférez le cœur de la canule dans une boîte de culture en plastique de 60 millimètres, puis retirez l’excès de tissu et immergez le cœur dans 2,5 millilitres de tampon de digestion. Pour l’isolement des cellules auriculaires, disséquez les oreillettes loin du cœur et placez-les dans une boîte de culture en plastique de 30 millimètres contenant 750 microlitres de tampon de digestion.

À l’aide de ciseaux chirurgicaux à pointe fine, émincez et écartez les oreillettes avant de disséquer davantage le tissu avec des pinces fines sans agiter ni écarter les fibres musculaires. À l’aide d’une pointe de pipette de transfert stérile, continuez à mélanger doucement et à dissocier le tissu pendant 15 minutes. Toutes les cinq minutes, observez la dissociation des myocytes auriculaires sous l’objectif 10X d’un microscope à fond clair.

Au fur et à mesure que le tissu est digéré, continuez à mélanger et à dissocier doucement le tissu à l’aide d’une pointe de pipette de transfert stérile avec une taille de pores plus petite avant de transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation stérile de deux millilitres. Rincez la plaque de 30 millimètres avec 750 microlitres de tampon d’arrêt des myocytes à 37 degrés Celsius et combinez le tampon avec la suspension cellulaire. Laisser les myocytes auriculaires se sédimenter par gravité et agitation douce pendant 10 minutes à température ambiante.

Lorsqu’une pastille visible s’est formée, centrifuger la suspension cellulaire et transférer le surnageant non contenant des myocytes dans un tube conique en polypropylène de 15 millilitres sans perturber la pastille de myocytes auriculaires. Centrifugez la fraction non myocytaire et remettez en suspension la pastille non myocytaire dans 10 millilitres de DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal. Après le comptage, placez les cellules non myocytaires à la densité expérimentale appropriée pour l’analyse en aval, puis remettez en suspension la pastille de myocytes auriculaire isolée à la concentration expérimentale appropriée pour l’ensemencement sur des plaques de culture recouvertes de laminine.

Pour l’isolement des cellules ventriculaires, hachez le tissu cardiaque ventriculaire comme cela vient d’être démontré pour l’échantillon de tissu auriculaire et transférez la suspension cellulaire résultante dans un tube conique en polypropylène de 15 millilitres contenant 2,5 millilitres de tampon d’arrêt des myocytes à 37 degrés Celsius. Rincez la plaque de dissection avec 2,5 millilitres de tampon d’arrêt des myocytes à 37 degrés Celsius et combinez le lavage avec la suspension cellulaire. À l’aide d’une pipette de transfert stérile, continuez à mélanger doucement et à dissocier le tissu pendant quatre minutes.

À la fin de l’incubation, utilisez une aliquote de 10 microlitres des cellules pour vérifier la présence de myocytes en forme de bâtonnet. Faites passer la suspension cellulaire à travers un filtre en nylon stérile de 100 microlitres dans un tube conique en polypropylène de 50 millilitres et utilisez deux millilitres du tampon de digestion précédemment collecté pour laver toutes les cellules restantes du filtre en nylon stérile. Laissez les myocytes ventriculaires se sédimenter par gravité pendant six minutes en agitant doucement jusqu’à ce qu’une pastille visible se forme au fond du tube.

À l’aide d’une pointe de pipette stérile, transférez le surnageant non myocytaire dans un tube conique en polypropylène de 15 millilitres sans perturber la pastille de myocytes ventriculaire et centrifugez la fraction non myocytaire. Remettre en suspension la pastille non myocytaire dans 10 millilitres de DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal pour le comptage et mettre en boîte les cellules à la concentration appropriée pour leur analyse en aval, puis remettre en suspension les myocytes ventriculaires isolés dans deux millilitres de tampon d’arrêt des myocytes deux pour le comptage. Pour mettre en place un paradigme de réintroduction du calcium par étapes, ajoutez 50 microlitres de chlorure de calcium de 10 millimolaires à la suspension de cellules myocytaires ventriculaires avec un mélange minutieux pour une incubation de quatre minutes à température ambiante.

À la fin de l’incubation, ajoutez 50 microlitres supplémentaires de chlorure de calcium de 10 millimolaires aux cellules avec mélange pour une autre incubation de quatre minutes à température ambiante. Ensuite, traitez les cellules avec une incubation de quatre minutes avec 100 microlitres de chlorure de calcium de 10 millimolaires et une incubation de quatre minutes avec 80 microlitres de chlorure de calcium de 10 millimolaires. Après la dernière incubation, remettre en suspension les myocytes ventriculaires traités au calcium dans un volume approprié de milieu de placage de myocytes ventriculaires conformément à leur analyse prévue en aval et ensemencer les cellules sur des plaques de culture recouvertes de laminine.

Après une heure, remplacez le surnageant par un milieu de maintien des myocytes ventriculaire complété par 25 micromolaires de blébbistatine. La troponine T du muscle cardiaque est un marqueur des myocytes cardiaques et est exprimée de manière robuste dans les cultures de myocytes cardiaques auriculaires et ventriculaires. En revanche, le peptide natriurétique auriculaire et la chaîne légère de myosine deux sont exprimés de manière robuste et spécifique dans les cultures de myocytes cardiaques auriculaires et ventriculaires respectivement.

Les marqueurs des fibroblastes sont exprimés exclusivement dans des cultures non myocytaires isolées des chambres auriculaires et ventriculaires. L’immunomarquage des myocytes auriculaires et ventriculaires de souris adultes pour le marqueur des tubules T dihydropyridine et le récepteur de la ryanodine montre que les tubules T sont intacts tout au long de l’isolement et de la culture à long terme. Le modèle de striation sarcomérique peut être utilisé pour évaluer la pureté et la viabilité de myocytes cardiaques isolés en conjonction avec la morphologie en forme de bâtonnet et la coloration nucléaire avec TO-PRO-3.

Comme prévu, les myocytes cardiaques ventriculaires sont grands, présentant une longueur moyenne d’environ 150 micromètres, tandis que les myocytes cardiaques auriculaires mesurent en moyenne environ 75 micromètres. De plus, lors de l’analyse d’immunomarquage, les myocytes cardiaques auriculaires présentent une expression robuste du peptide natriurétique auriculaire dans un motif de coloration caractéristique de la localisation dans le réticulum endoplasmique et les granules sécrétoires. Alors que les myocytes auriculaires sécrètent du peptide natriurétique auriculaire dans des conditions basales, la sécrétion augmente en réponse aux sécrétagogues.

De plus, les myocytes cardiaques auriculaires sécrètent du peptide natriurétique auriculaire et la co-sécrétion ne traite qu’une partie de l’hormone de son état précurseur au peptide produit. Les erreurs évitables les plus courantes comprennent le fait de ne pas garder l’animal calme avant le sacrifice, de ne pas évacuer les bulles d’air du système de perfusion et le fait que le chirurgien lui-même ne reste pas calme. À la suite de cette procédure, toute procédure expérimentale courante peut être effectuée, y compris le dosage des paramètres électrophysiologiques et de manipulation du calcium, l’immunocytochimie, la réponse hypertrophique et les études de signalisation, ainsi que des études de reperfusion d’ischémie simulée.