Isolement des Cardiomyocytes auriculaires d’un modèle de Rat de métaboliques liées Syndrome une insuffisance cardiaque avec Fraction d’éjection préservée

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la fonction individuelle des cardiomyocytes et permet d’étudier l’excitation-contraction-couplage. Le principal avantage de cette technique est qu’un rendement élevé de cardiomyocytes auriculaires viables provenant de cœurs atteints de cardiomyopathie auriculaire peut être isolé et utilisé pour des expériences ultérieures. Commencez par placer une canule avec la pointe longue et pointue retirée sur le dessus de l’appareil de Langendorff et commencez l’écoulement.

Allumez le module de chauffage et ajustez-le de manière à ce que le tampon de perfusion à l’extrémité de l’aiguille maintienne la température souhaitée pour la perfusion. Une fois l’étalonnage de la température terminé, transférez la canule dans une seringue de 10 ml remplie d’un tampon de canulation glacé. Placez deux doubles nœuds plats à l’emploi sur la canule pour une canulation ultérieure rapide de l’aorte.

Retirez le cœur du rat euthanasié et hépariné en pinçant la base du cœur avec une pince et en tirant doucement vers le bas vers la queue de l’animal. Coupez l’aorte tout en maintenant une traction sur le cœur, en laissant un segment de 5 mm de long de l’aorte attaché au cœur. Transférez rapidement le cœur dans 50 ml de tampon de canulation glacé dans un bécher de 50 ml.

Attendez environ 10 s pour que le cœur refroidisse et cesse les contractions. Ensuite, transférez le cœur dans une boîte de Pétri contenant 50 ml de tampon de canulation frais et glacé et retirez soigneusement les tissus adipeux entourant l’aorte à l’aide de pinces et de ciseaux. Insérez la canule modifiée de 3 mm dans l’aorte sans endommager la valve aortique.

Fixez l’aorte sur la canule en faisant l’un des deux nœuds de canulation au niveau de l’indentation proximale à l’extrémité de la canule. Faites le deuxième nœud de canulation au niveau de l’indentation distale à l’extrémité de la canule. Rincer doucement l’aorte avec 5 ml de tampon de canulation glacé à l’aide de la seringue fixée à la canule jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de sang visible dans les artères coronaires.

Ensuite, à l’aide d’une pince, masser doucement l’oreillette gauche tout en injectant les 5 ml restants de tampon de canulation pour évacuer le sang restant. Démontez la canule avec le cœur attaché de la seringue. Montez la canule avec le cœur attaché sur le Langendorff, à l’aide d’un adaptateur approprié.

Démarrer la pompe péristaltique de l’appareil de Langendorff pour initier la perfusion du tissu cardiaque. Faites rapidement un double nœud plat autour de la base du cœur, à l’exclusion de l’aorte. Lorsque l’oreillette droite et gauche et les sinus coronaires se gonflent, percez l’oreillette avec l’aiguille papillon du dispositif de contrôle de la pression et laissez l’oreillette se dégonfler.

Manipulez la pression intraluminale de l’oreillette en ajustant l’élévation du tuyau fixé à l’aiguille papillon. Gardez l’oreillette légèrement gonflée pendant le reste de la procédure. Il est essentiel que l’étape soit effectuée rapidement, car un gonflement prolongé de l’oreillette entraînera la mort des cardiomyocytes.

Placez une sonde de température entre l’oreillette gauche et le ventricule gauche pour mesurer la température approximative de l’oreillette gauche. Ajustez la température du module de chauffage Langendorff en conséquence, en ciblant une température approximative de 37 °C de l’oreillette gauche. Après 3 minutes de perfusion avec le tampon de perfusion, passez au tampon de digestion et perfuser pendant environ 14 à 18 minutes.

Lorsque la structure auriculaire gauche s’effondre et que le tissu acquiert une texture laiteuse, pincez l’oreillette à l’aide d’une pince et d’un léger geste de traction. Retirez l’oreillette gauche à l’aide de ciseaux fins et transférez l’oreillette dans une grande barque contenant 2 ml de tampon d’arrêt, en immergeant complètement le tissu. À l’aide de ciseaux fins, hachez le tissu auriculaire en petits morceaux d’environ 2 mm².

Dispersez le tissu en triturant doucement le tissu à l’aide d’une pipette de transfert pendant environ 5 minutes jusqu’à ce qu’une dissociation macroscopique du tissu puisse être observée. Évitez de générer des bulles d’air, car l’exposition des cellules à l’air entraînera la mort des cardiomyocytes. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml.

Après avoir laissé les morceaux de tissu se déposer pendant 30 secondes, retirez le surnageant et transférez-le dans un autre tube conique de 15 ml. Laissez ensuite les cellules se stabiliser pendant 15 min. Après avoir retiré et jeté le surnageant, ajoutez 2 ml de tampon de l’étape 1 et laissez les cardiomyocytes se stabiliser pendant 10 min.

Après 10 min, retirez et jetez le surnageant final. Ajouter 250 microlitres de Tyrode normal, contenant 1 mM de calcium. Transférez 50 microlitres de suspension de cardiomyocytes auriculaires dans un plat à fond de verre recouvert de laminine et laissez les cardiomyocytes se déposer à température ambiante pendant 10 min.

Après 10 min, ajoutez 500 microlitres de Tyrode normal contenant 1 mM de chlorure de calcium aux cellules. Évaluez la morphologie et la viabilité des cellules au microscope optique. Sélectionnez au hasard environ 100 cellules et classez-les comme viables ou non viables pour estimer la viabilité de la procédure d’isolement cellulaire.

Les cellules viables sont caractérisées par une structure symétrique en sarcomère, l’absence de bulles membranaires et une forme de bâtonnet. Ajoutez 10 micromolaires de Fluo-4-AM à 500 microlitres de Tyrode normal et utilisez-le pour remplacer le Tyrode normal contenant 1 mM de chlorure de calcium dans le plat à fond de verre. Après 20 min, retirez la solution Fluo-4-AM et lavez les cellules deux fois avec 500 microlitres de Tyrode normal.

Transférez la boîte dans un microscope confocal et visualisez l’excitation du calcium, en utilisant un grossissement de 40x. Ensuite, perfuser les cellules avec du Tyrode normal chauffé à 37 °C à l’aide d’un dispositif de superfusion approprié. Stimulez les cardiomyocytes dans un champ électrique à l’aide d’électrodes de stimulation montées sur microscope disponibles dans le commerce à une fréquence de 1 Hz et un courant électrique de 24 ampères.

Après avoir attendu 1 minute pour permettre aux cellules d’atteindre un état stable de manipulation des ions calcium, acquérez des images de balayage linéaire par balayage répétitif. Cette image montre le balayage linéaire transversal d’un seul cardiomyocyte. La modification de la concentration cytosolique de calcium est mise en évidence par l’excitation du colorant fluorescent sensible au calcium, le Fluo-4-AM.

Les flèches indiquent la stimulation électrique effectuée à 1 Hz.Cette image montre les transitoires transversaux de calcium dérivés de cette cellule unique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 3 h. Lors de l’essai de ce protocole, il est important de se rappeler que certaines étapes de la procédure d’isolement sont sensibles au temps.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes d’imagerie subcellulaire peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant le remodelage des cardiomyocytes auriculaires.