Isolement et culture des Cardiomyocytes de Rat adulte

L’objectif global de cette expérience est d’isoler et de cultiver des cardiomyocytes de rats adultes, qui peuvent être utilisés dans diverses expériences pour comprendre leur comportement biologique et physiopathologique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie et de la physiopathologie du cœur, telles que la dédifférenciation cardiaque, l’hypertension cardiaque ou l’insuffisance cardiaque. Le principal avantage de cette technique est que les cardiomyocytes adultes peuvent être étudiés individuellement sans l’influence des cellules adjacentes, telles que les fibroblastes ou les cellules endothéliales.

Les implications de cette technique s’étendent à la compréhension physiopathologique des maladies cardiaques, car les myocytes cardiaques adultes peuvent être étudiés individuellement. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du comportement des cardiomyocytes de rats adultes, elle peut également être appliquée à d’autres modèles, tels que les modèles de reperfusion d’ischémie, les rats spontanément hypertendus ou d’autres espèces. Le système de perfusion Langendorff se compose d’un long tube de verre à double paroi avec un entonnoir en verre en haut et en bas du tube.

L’appareil peut être chauffé à l’eau. Les entonnoirs en verre supérieur et inférieur sont reliés à une pompe qui transporte le milieu de perfusion, qui est fumigé avec 95 % d’oxygène. Pour préparer le système de perfusion, chauffez le milieu de placage et le milieu de lavage à 37 degrés Celsius.

Ensuite, décongelez un tube de 500 microlitres de chlorure de calcium et pesez 25 milligrammes de collagénase. Ensuite, rincez le système de perfusion Langendorff avec de l’eau stérile. Ensuite, laissez Powell faire circuler le système pendant cinq minutes.

Ensuite, préparez un tube avec 40 millilitres de milieu Powell et couvrez-le de Parafilm. Chauffez le tube à 37 degrés Celsius et gazez-le avec 95 % d’oxygène. Retirez le milieu Powell en circulation et remplissez le système de perfusion Langendorff avec 80 millilitres de milieu Powell frais sans aucune bulle d’air, et gazez le milieu avec 95 % d’oxygène.

Ensuite, préparez un fil d’environ 25 centimètres de long pour attacher le cœur retiré à la canule. Dégraissez une lame de rasoir avec de l’alcool et fixez-la au hachoir. Enfin, fixez un disque en plastique dans le hachoir.

Après avoir sacrifié le mâle, les rats Wistar, comme décrit dans le protocole de texte, ouvrent l’abdomen derrière l’arc costal avec un cisaillement abdominal, et avec la même paire de ciseaux, coupent à travers le diaphragme pour ouvrir la cavité thoracique. Retirez le cœur ainsi que le poumon et le thymus en coupant au-dessus du thymus fortement crânien dans la cavité thoracique. Transférez immédiatement le matériau dans une solution saline glacée.

Retirez le poumon et le thymus du cœur à l’aide d’un grand ciseau de dissection. Ensuite, en fixant le matériau à l’aide d’une pince à capsule, transférez le cœur dans une nouvelle solution saline. Les étapes suivantes doivent être effectuées avec précision, mais aussi rapidement, afin de minimiser le temps entre l’extraction du cœur et la fixation au système de perfusion Langendorff.

Ceci est essentiel pour un bon résultat en termes de qualité et de nombre de cardiomyocytes adultes. Retirez l’excès de tissu, comme les résidus de thymus, de trachée, de graisse et de tissu conjonctif du cœur, à l’aide d’une pince à capsule et d’un ciseau de dissection. Découvrez l’aorte et sectionnez-la avec un ciseau de dissection entre le premier et le deuxième arc branchial.

Ensuite, commencez l’égouttement du système de perfusion Langendorff. Placez le cœur sur la canule du système de perfusion Langendorff et fixez-le d’abord avec une pince crocodile, puis avec le fil préparé. Rincez le cœur jusqu’à ce qu’il soit exempt de sang.

Dissoudre 25 milligrammes de collagénase dans cinq à six millilitres de milieu Powell chaud et ajouter 12,5 microlitres de chlorure de calcium. Lorsque le volume des résidus est de 45 millilitres, fermez la circulation en déplaçant un entonnoir en verre, qui est relié au système de perfusion Langendorff sur le cœur qui coule, et couvrez cet entonnoir avec du Parafilm pour la protection du cœur. Ajoutez la collagénase résolue au système de perfusion.

Ajustez le système de perfusion pendant 25 minutes avec une vitesse de chute d’une goutte par seconde. Après 25 minutes de perfusion, le cœur apparaît gonflé et cireux. Arrêtez la perfusion après 25 minutes et retirez le cœur du système de perfusion Langendorff.

Retirez l’aorte, les oreillettes et le tissu conjonctif du cœur, et ouvrez les ventricules droit et gauche. Hachez le cœur deux fois à un angle de 90 degrés, en répétant ce processus manuellement avec deux scalpels pendant 10 secondes de chaque côté. Ensuite, transférez 12 millilitres du milieu de perfusion dans un nouveau tube.

Versez la boue cellulaire dans ce milieu et digérez les cellules pendant encore cinq minutes à 37 degrés Celsius. Mélangez la solution toutes les minutes. Filtrez la solution avec le cœur digéré à travers une maille en nylon de 200 microns dans un nouveau tube.

La recalcification est un processus délicat. Si d’autres modèles de rats ou d’espèces différentes sont utilisés, le protocole démontré peut être trop agressif, ce qui entraînerait un taux de mortalité élevé des cellules. Centrifuger la solution filtrée à 29 g pendant trois minutes.

Jetez le surnageant et ajoutez six millilitres de milieu Powell chaud, dont 12,5 microlitres de chlorure de calcium à la pastille de cellule. Remettez le granulé en suspension par des mouvements d’agitation doux. Ensuite, centrifugez à nouveau à 29 g pendant deux minutes.

Jetez le surnageant et ajoutez six millilitres de milieu Powell chaud, remplacé par 25 microlitres de chlorure de calcium. Dissoudre la pastille cellulaire en secouant doucement et ajouter 12 millilitres de milieu Powell chaud, dont 120 microlitres de chlorure de calcium. Après une troisième centrifugation à 16 g pendant une minute, retirez le surnageant.

Ensuite, mélangez la pastille de cellule avec le milieu de placage préchauffé. Retirez le milieu de pré-placage des plaques de culture. Ensuite, transférez un millilitre de milieu de placage, y compris les cardiomyocytes isolés, dans chaque plaque de culture.

Incuber les cardiomyocytes frais isolés à 37 degrés Celsius pendant une heure. Retirez le milieu de placage des plaques de culture. Enfin, ajoutez un millilitre de milieu de lavage dans chaque plaque de culture.

Conservez les plaques à 37 degrés Celsius jusqu’à six jours sans changer de support. Les ARVC fraîchement isolés présentent une morphologie typique en forme de bâtonnet. On peut supposer qu’un ARVC à surface irrégulière et sans membrane cellulaire intacte détectable n’est pas viable.

Cette morphologie change au cours de la période de culture dans un milieu contenant des FCS ou de l’oncostatine M. Les ARVCs s’arrondissent et forment des structures semblables à des pseudopodes, un processus également appelé étalement. Grâce à la coloration fluorescente avec Phalloidin TRITC, l’altération de l’appareil contractile de l’ARVC peut être étudiée pendant la culture. Les cardiomyocytes fraîchement isolés présentent une striation transversale bien visible.

Au cours des premiers jours de la cultivation, les ARVC ont perdu tous leurs éléments contractiles. Celle-ci a été suivie d’une réforme, impliquant une sarcomérogenèse de novo avec des fibres de stress d’actine et des faisceaux d’actine dans la région périnucléaire. Cette réforme a été précédée par la formation de structures semblables à celles des pseudopodes.

À la fin de la culture, une striation croisée typique des sarcomères nouvellement assemblés dans la propagation de l’ARVC a été observée. À la fin de la période de culture, 14,7 % plus ou moins 1,39 % de tous les ARVC comptés présentaient des structures semblables à celles des pseudopodes. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure à une heure et demie si elle est exécutée correctement.

Lorsque vous essayez la procédure, n’oubliez pas de travailler aussi rapidement et précisément que possible. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et de cultiver les cardiomyocytes adultes. N’oubliez pas que travailler avec des matières biologiques et des produits chimiques peut être dangereux.

Après son développement, cette méthode a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la cardiologie pour explorer la physiologie de base des myocytes cardiaques adultes. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la séparation des cardiomyocytes du ventricule gauche et droit ou d’autres espèces modèles peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que des différences anatomiques ou liées à l’espèce.