Protocole pour la différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l'homme dans des cultures mixtes de neurones et Glia pour des tests de neurotoxicité

L’objectif général de cette procédure est de différencier les cellules souches neurales dérivées de colonies de cellules souches pluripotentes induites humaines en cultures mixtes de cellules neuronales et gliales. Ce modèle est adapté au dépistage de la toxicité des drogues et des produits chimiques. Ce modèle in vitro peut être appliqué pour évaluer les perturbations induites par les produits chimiques des voies de signalisation qui sont activées pendant le processus de différenciation neuronale et gliale.

Le principal avantage de ce système est d’utiliser un modèle humain dérivé de cellules souches pluripotentes induites qui représente une alternative aux cellules cancéreuses traditionnellement utilisées et aux cultures primaires animales et permet d’étudier la neurotoxicité dans une population mixte de cellules neuronales et gliales. La procédure sera démontrée par Francesca Pistollato, notre post-doc, et Carolina Nunes, une étudiante de troisième cycle de notre laboratoire. Commencez par passer les colonies hiPSC.

En travaillant sous un microscope stéréoscopique à un grossissement de quatre X dans une armoire à flux laminaire, utilisez une seringue d’un millilitre avec une aiguille de calibre 30. Coupez les colonies de cellules souches en carrés d’environ 200 microns par 200 microns. Le découpage des colonies nécessite de bonnes compétences manuelles pour obtenir des fragments de taille égale.

L’utilisation d’outils de coupe disponibles dans le commerce peut aider. Ensuite, à l’aide d’une pipette de 200 microlitres, détachez les fragments de colonie de la surface de la boîte en pipetant doucement le milieu en dessous pour soulever les morceaux. Transférez environ 100 fragments de colonie dans une boîte de 60 millimètres à matrice qualifiée recouverte de DMEM F12 remplie de quatre millilitres de milieu hiPSC complet.

Ensuite, incubez le nouveau plat à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Effectuez un changement total de milieu chaque jour et inspectez la morphologie des colonies à l’aide d’un microscope à contraste de phase à quatre grossissements X et 10X. Au jour zéro de la procédure de différenciation, rafraîchissez le milieu hiPSC en ajoutant trois millilitres de milieu par boîte de Pétri de 60 millimètres.

Ensuite, coupez et détachez les fragments de 200 microns comme précédemment. Pipeter les fragments détachés et le milieu dans un tube de 15 millilitres. Rincez le plat avec deux millilitres de milieu hiPSC complet et récupérez tous les fragments.

Puis centrifuger à 112 fois G pendant une minute. Après la centrifugation, aspirer le surnageant et remettre doucement les fragments en suspension dans cinq millilitres de milieu hiPSC EB complet. Plaquez le volume complet dans une boîte de culture tissulaire de 60 millimètres à très faible attachement.

Incuber le plat pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, vérifiez les cellules avec le microscope inversé. Le premier jour, les corps embryoïdes doivent apparaître arrondis et distincts les uns des autres, comme on le voit ici.

Ensuite, pipetez les corps embryoïdes et le milieu de la boîte et transférez-les dans un tube de 15 millilitres. Centrifugez les corps embryoïdes à 112 fois G pendant une minute. Le deuxième jour, aspirez la solution de revêtement matriciel standard d’une boîte de 60 millimètres préalablement préparée et ajoutez cinq millilitres de milieu d’induction neuroépithéliale complet, ou NRI, dans la boîte.

En travaillant sous le microscope stéréoscopique à un grossissement de quatre X et à l’aide d’une pipette de 200 microlitres, collectez environ 50 corps embryoïdes flottants et transférez-les dans une boîte revêtue. Ensuite, incubez le plat à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, troisième jour de la procédure de différenciation, vérifiez la boîte au microscope à un grossissement de 10X pour vous assurer que les corps embryoïdes sont tous attachés.

Ensuite, effectuez doucement un changement total de milieu avec un milieu NRI complet. Changez le milieu NRI tous les deux jours jusqu’au septième jour où les agrégats neuroépithéliales en forme de rosette devraient être visibles. Le septième jour, enduisez une plaque de 96 puits en pipetant 100 microlitres de matrice standard diluée dans un milieu de culture dans chaque puits.

Le huitième jour, coupez les agrégats en forme de rosette en fragments sous un microscope stéréoscopique à un grossissement de 10X dans des conditions stériles. Notez que les rosaces ont tendance à se détacher facilement du plat lorsqu’elles sont touchées avec l’aiguille. Dans ce cas, désagréger partiellement la rosette détachée avec la pointe de l’aiguille.

Si les rosettes restent partiellement attachées, utilisez une pipette de 200 microlitres pour compléter le détachement des fragments de rosette. Le bouturage de rosette nécessite de bonnes compétences manuelles et de la précision afin d’éviter de couper aucun dérivé neurexidermal. Ensuite, collectez les fragments de rosette et leur milieu dans un tube conique de 15 millilitres.

Rincez le plat avec deux millilitres de milieu NRI pour récupérer tous les fragments. Ensuite, faites tourner les fragments de rosette à 112 fois G pendant une ou deux minutes. Après avoir aspiré le surnageant, remettez doucement la pastille en suspension dans un millilitre d’un X DPBS préchauffé sans calcium ni magnésium.

Pipetez doucement les fragments de rosette de haut en bas pour les dissocier partiellement. Ajoutez ensuite quatre millilitres de milieu NRI complet et comptez les cellules à l’aide de bleu trypan et d’un compteur de cellules automatisé. Ensuite, aspirez la solution de revêtement matriciel standard de la plaque à 96 puits et déposez les cellules dans les puits à une densité d’environ 15 000 cellules par centimètre carré dans un milieu NRI.

Incuber l’assiette pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le 10e jour, effectuez un changement total du milieu en utilisant le milieu de différenciation neuronale complète. Cette image représentative montre des rosettes après 12 jours in vitro colorées pour la nestine en vert et la tubuline bêta trois en rouge.

Ici, des cellules qui ont été cultivées pendant 28 jours in vitro ont été colorées pour la tubuline bêta trois en rouge et la NF200 en vert. Cette image représentative montre des cellules neuronales différenciées des CSN après 21 jours de coloration in vitro pour NF200 en rouge et deux en vert. Ici, les cellules gliales de la même culture sont colorées pour le GFAP en rouge.

Cet histogramme compare la quantification de la nestine, du MAP deux, du GFAP, de l’acide gamma-aminobutyrique, du transporteur vésiculaire du glutamate un et de la tyrosine hydroxylase positive dans les dérivés de hiPSC IMR90 et des cellules différenciées des NSC dérivées de hiPSC IMR90. Ces images en contraste de phase prises à l’aide d’un objectif 10X montrent que les cellules souches neuronales subissent une différenciation pendant 21 jours. En suivant ces procédures, d’autres lectures telles que la PCR quantitative en temps réel et la réanalyse multilatérale peuvent être effectuées afin d’évaluer la physiologie et le phénotype des cellules neuronales et gliales et d’évaluer l’effet des produits chimiques.

N’oubliez pas que le travail avec des composés chimiques peut être extrêmement dangereux. C’est pourquoi vos précautions pertinentes doivent toujours être prises à l’aide de lunettes, de gants ou d’un masque sous la cagoule d’évacuation, en particulier lors de l’exécution de traitements chimiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir une population différenciée mixte de neurones et de cellules gliales à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines, ce qui représente un modèle approprié, un modèle in vitro, pour le développement de tests de neurotoxicité.