Échantillonnage non invasive de muqueuse liquide pour la Quantification des niveaux d’immunitaire-médiateur In Vivo des voies respiratoires supérieures

Ce protocole décrit une technique non invasive pour l’échantillonnage des liquides de muqueuse intacte les voies aériennes supérieures. Il peut être utilisé pour effectuer la quantification des niveaux de in vivo des médiateurs de protéines, tels que les cytokines et chimiokines, chez les sujets de tous âges.

L’objectif global de cette méthode d’échantillonnage du liquide de la muqueuse est d’étudier la signature immunitaire locale des voies respiratoires sans avoir besoin de procédures de stimulation. Cette méthode vous permet d’étudier des questions clés dans le domaine des maladies respiratoires pédiatriques telles que les infections, l’asthme et les allergies. Les avantages de la méthode sont que vous pouvez mesurer de très faibles niveaux de médiateurs immunitaires dans la muqueuse des voies respiratoires non stimulée in vivo.

La démonstration de la procédure sera faite par le Dr Wolsk. Pour le prélèvement d’échantillons de nouveau-nés, coupez d’abord au moins deux bandes de trois par 15 millimètres dans des feuilles filtrantes en polyester hydroxylé fibreux. Ensuite, placez le nouveau-né sur un lit et notez tout symptôme d’infection des voies respiratoires.

Ensuite, à l’aide d’une pince, insérez un morceau de papier filtre d’environ un centimètre dans la partie antérieure du cornet inférieur de chaque narine du nourrisson et administrez de l’eau sucrée au nouveau-né pour plus de confort au besoin. Prenez note des éternuements, des pleurs persistants ou de l’épistaxis qui se produisent pendant la période d’échantillonnage. Après deux minutes d’absorption, transférez les papiers filtres dans un tube étiqueté pour un stockage immédiat à moins 80 degrés Celsius.

La démonstration de la procédure expérimentale sera assurée par Lisbeth Rosholm, technicienne dans mon laboratoire. Pour la quantification des médiateurs immunitaires des voies respiratoires, placez jusqu’à 10 échantillons de stockage à moins 80 degrés Celsius sur de la glace et notez leurs numéros d’identification. Lorsque les échantillons ont été décongelés, plongez les deux papiers filtres par sujet dans 150 microlitres de tampon fraîchement préparé par papier filtre, complété par un comprimé complet d’inhibiteur de protéase pour 25 millilitres de solution mère tampon.

Transférez les échantillons dans un agitateur à plaques à 400 tr/min pendant cinq minutes. Transférez le tampon et les papiers filtres dans les gobelets des filtres tubulaires en acétate de cellulose. Centrifuger les échantillons pour recueillir l’extrait nasal filtré au fond des tubes de la microcentrifugation.

Ensuite, retirez les gobelets et placez les tubes sur de la glace. Ensuite, transférez 150 microlitres d’aliquotes de l’extrait nasal dans des puits individuels de plaques de stockage à faible liaison protéique et stockez les plaques à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’analyse. Ensuite, mesurez la concentration des médiateurs immunitaires nasaux d’intérêt par un réseau multiplexé basé sur l’électrochimiluminescence à haute sensibilité selon les protocoles de test standard.

Dans cette analyse représentative de 620 nouveau-nés, la plupart des médiateurs immunitaires mesurés ont montré un faible niveau de détection. Les niveaux gamma d’IFN étaient inférieurs à la limite inférieure de détection dans près de la moitié des échantillons, tandis que les niveaux de TNF alpha, de CCL4 et de TGF bêta étaient inférieurs à la limite inférieure de détection dans moins de 1 % des échantillons. Une forte multicolinéarité était évidente pour les 20 niveaux médiateurs détectés, comme l’illustre la carte thermique.

Chez les nouveau-nés asymptomatiques infectés par le picornavirus, un profil régulé à la hausse compromis principalement par des médiateurs immunitaires de type 1 a été observé, suggérant un rôle de déclenchement immunitaire des bactéries et des virus colonisateurs dans la première partie de la vie. Une association entre la présence de frères et sœurs dans le ménage à la naissance et une réponse immunitaire muqueuse spécifique de type 1 ou de type 17 dirigée a également été déterminée avec des preuves de corrélation de ce phénomène avec un effet d’amorçage immunitaire in utero qui est inversement corrélé au temps écoulé depuis le dernier accouchement. De plus, les enfants nés de mères recevant des suppléments élevés par rapport à un placebo étaient caractérisés par une régulation à la hausse de médiateurs immunitaires spécifiques, suggérant que la vitamine D favorise une réponse immunitaire antibactérienne indépendante de celle induite par le virus, les bactéries, les frères et sœurs ou l’atopie maternelle.

Cette méthode de microprélèvement peut également être utilisée à l’aide d’un bronchoscope, permettant d’étudier les médiateurs immunitaires dans les voies respiratoires inférieures. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer les médiateurs dans la muqueuse des voies respiratoires non stimulée in vivo chez les nouveau-nés et les enfants plus âgés.