Échantillonnage non invasive de muqueuse liquide pour la Quantification des niveaux d’immunitaire-médiateur In Vivo des voies respiratoires supérieures
7 août 2017
Ce protocole décrit une technique non invasive pour l’échantillonnage des liquides de muqueuse intacte les voies aériennes supérieures. Il peut être utilisé pour effectuer la quantification des niveaux de in vivo des médiateurs de protéines, tels que les cytokines et chimiokines, chez les sujets de tous âges.
L'objectif général de cette méthode d'échantillonnage du liquide de revêtement muqueux est d'étudier la signature immunitaire locale des voies respiratoires sans avoir recours à des procédures de stimulation. Cette méthode permet d'étudier des questions clés dans le domaine des maladies respiratoires pédiatriques telles que les infections, l'asthme et les allergies. Les avantages de cette méthode sont qu'elle permet de mesurer des concentrations très faibles de médiateurs immunitaires dans la muqueuse des voies respiratoires non stimulée in vivo.
Le Dr. Wolsk démontrera la procédure. Pour la collecte d'échantillons de nouveau-nés, découpez d'abord au moins deux bandes de trois par 15 millimètres à partir de feuilles de filtre en polyester hydroxylé fibreux. Ensuite, placez le nouveau-né sur un lit et notez tout symptôme d'infection des voies respiratoires.
Ensuite, utilisez une pince pour insérer un morceau de papier filtre d’environ un centimètre dans la partie antérieure du cornet inférieur de chaque narine du nourrisson, et administrez de l’eau sucrée au nouveau-né au besoin pour le confort. Notez toute éternuement, tout pleur persistant ou toute épistaxis survenant pendant la période d’échantillonnage. Après deux minutes d’absorption, transférez les papiers filtres dans un tube étiqueté pour un stockage immédiat à moins 80 degrés Celsius.
La procédure expérimentale sera démontrée par Lisbeth Rosholm, technicienne dans mon laboratoire. Pour la quantification des médiateurs immunitaires des voies respiratoires, placez jusqu'à 10 échantillons provenant d'un stockage à moins 80 degrés Celsius sur de la glace et enregistrez leurs numéros d'identification. Une fois les échantillons décongelés, immergez les deux papiers filtres par sujet dans 150 microlitres de tampon fraîchement préparé par papier filtre, supplémenté d'un comprimé complet d'inhibiteur de protéase par 25 millilitres de solution mère de tampon.
Transférez les échantillons sur un agitateur de plaque à 400 tr/min pendant cinq minutes. Transférez le tampon et les papiers filtres dans les cupules de filtres en tubes d'acétate de cellulose individuels. Centrifugez les échantillons pour recueillir l'extrait nasal filtré au fond des tubes de microcentrifugation.
Ensuite, retirez les godets et placez les tubes sur de la glace. Puis, transférez des aliquotes de 150 microlitres de l'extrait nasal dans des puits individuels de plaques de stockage à faible liaison aux protéines et conservez les plaques à moins 80 degrés Celsius jusqu'à l'analyse. Ensuite, mesurez la concentration des médiateurs immunitaires nasaux d'intérêt à l'aide d'un dosage multiplexé basé sur une électrochimiluminescence à haute sensibilité, conformément aux protocoles standards de dosage.
Dans cette analyse représentative de 620 nouveau-nés, la plupart des médiateurs immunitaires mesurés ont montré un faible taux de détection. Les concentrations en IFN gamma étaient inférieures à la limite de détection basse dans près de la moitié des échantillons, tandis que les concentrations en TNF alpha, CCL4 et TGF beta étaient inférieures à la limite de détection basse dans moins de 1 % des échantillons. Une forte multicolinéarité était évidente parmi les 20 niveaux de médiateurs détectés, comme illustré par la carte thermique.
Chez les nouveau-nés asymptomatiques infectés par des picornavirus, un profil surexprimé composé principalement de médiateurs immunitaires de type 1 a été observé, suggérant un rôle déclencheur sur le système immunitaire des bactéries et virus colonisateurs au tout début de la vie. Une association entre la présence de frères et sœurs au foyer à la naissance et une réponse immunitaire muqueuse spécifique orientée vers les types 1 et 17 a également été établie, avec des preuves d'une corrélation de ce phénomène avec un effet de préparation immunitaire in utero, inversement corrélé au temps écoulé depuis le dernier accouchement. De plus, les enfants nés de mères ayant reçu des suppléments élevés par rapport à un placebo se sont caractérisés par une surexpression de médiateurs immunitaires spécifiques, suggérant que la vitamine D favorise une réponse immunitaire antibactérienne indépendante de celle induite par les virus, les bactéries, les frères et sœurs ou l'atopie maternelle.
Cette méthode d'échantillonnage microscopique peut également être utilisée par voie bronchoscopique, permettant d'étudier les médiateurs immunitaires dans les voies respiratoires inférieures. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mesurer les médiateurs dans la muqueuse respiratoire non stimulée in vivo chez les nouveau-nés et les enfants plus âgés.
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Aperçu
Ce protocole décrit une technique non invasive permettant de prélever un échantillon de liquide de revêtement muqueux non perturbé provenant des voies respiratoires supérieures. Elle permet la quantification des niveaux in vivo de médiateurs protéiques, tels que les cytokines et les chimioattractants, chez des sujets de tous âges.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Maladies respiratoires
- Immunologie
- Pédiatrie
Contexte
- Cette méthode étudie la signature immunitaire locale des voies respiratoires sans procédure de stimulation.
- Elle s'applique aux maladies respiratoires pédiatriques telles que les infections, l'asthme et les allergies.
- La technique permet la mesure de faibles concentrations de médiateurs immunitaires dans la muqueuse des voies respiratoires non stimulée in vivo.
- La démonstration de la procédure est réalisée par le Dr Wolsk.
Objectif de l'étude
- Étudier la réponse immunitaire dans la muqueuse des voies respiratoires.
- Fournir des informations sur les affections respiratoires pédiatriques.
- Faciliter les techniques d'échantillonnage non invasives à des fins de recherche.
Méthodes utilisées
- Prélèvement du liquide de revêtement muqueux des voies respiratoires supérieures.
- Utilisation de feuilles filtrantes en polyester hydroxylé fibreux pour le prélèvement des échantillons.
- Observation des symptômes d'infection des voies respiratoires chez les nouveau-nés.
- Quantification des cytokines et chimioquines dans les échantillons recueillis.
Résultats principaux
- Prélèvement réussi de fluide de revêtement muqueux sans procédure invasive.
- Capacité à mesurer les médiateurs immunitaires in vivo.
- Apercus sur le profil immunitaire des patients pédiatriques.
- Applications potentielles dans la compréhension des maladies respiratoires.
Conclusions
- La méthode d'échantillonnage non invasive est efficace pour l'étude de l'immunité des voies respiratoires.
- Cette technique peut améliorer la recherche sur la santé respiratoire pédiatrique.
- Des études futures pourraient approfondir les découvertes relatives aux médiateurs immunitaires.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
Cette méthode d'échantillonnage non invasive du liquide de revêtement muqueux permet une quantification directe des médiateurs immunitaires in vivo dans la muqueuse des voies respiratoires supérieures sans stimulation, fournissant ainsi un indicateur physiologiquement pertinent de l'activité immunitaire des voies respiratoires. La technique permet le profilage immunitaire en début de vie et le suivi longitudinal, facilitant l'identification mécanistique des facteurs de risque dans le développement de thérapeutiques respiratoires en reliant les expositions génétiques et environnementales aux phénotypes immunitaires. Son application chez des cohortes néonatales et pédiatriques présente une valeur prédictive pour l'endotypage et le suivi de l'évolution de la maladie, notamment dans les contextes d'asthme, d'allergie et de maladies infectieuses.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en mesurant les niveaux de base et induits de médiateurs immunitaires dans un tissu muqueux non stimulé.
- Valeur opérationnelle : Fournit une matrice reproductible et peu invasive pour la validation fonctionnelle de cibles chez les populations pédiatriques.
- Valeur prédictive : Contribue à la dé-risquisation biologique en établissant des corrélations entre les profils de médiateurs et les phénotypes cliniques, tels que l'infection virale asymptomatique et les effets liés à l'exposition entre frères et sœurs.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-analyser : Génère des échantillons de protéines élutées compatibles avec des puces multiplexes électrochimiluminescentes à haute sensibilité pour le profilage immunitaire quantitatif.
- Standardisation : Utilise des protocoles cohérents d'absorption et d'élution sur papier filtre pour assurer une récupération reproductible des analytes entre les sujets et les points temporels.
- Extensibilité : Démontre la faisabilité dans de grandes cohortes de nouveau-nés (n = 620), soutenant des applications de dépistage à haut débit dans les études épidémiologiques et interventionnelles.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet un échantillonnage longitudinal depuis la naissance jusqu'à l'enfance, reliant les signatures immunitaires précoces aux issues ultérieures de maladies respiratoires.
- Alignement des biomarqueurs : Détecte une surexpression des médiateurs immunitaires de type 1 et de type 17 chez les nouveau-nés asymptomatiques infectés par le picornavirus, suggérant une utilité dans l'identification des endotypes immunitaires.
- Réduction des risques mécanistiques : Révèle des associations entre la supplémentation maternelle en vitamine D et les réponses immunitaires antibactériennes, appuyant la priorisation des cibles pour les interventions immunomodulatrices.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans la phase de biologie de la découverte en permettant la mesure directe des médiateurs immunitaires in vivo, ce qui éclaire le choix des cibles et l'élucidation des voies avant l'identification du composé leader.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses sur l'activation des voies immunitaires dans les tissus muqueux, sans manipulation ex vivo ni artefacts de stimulation.
- Écrantage : Produit des éluats standardisés adaptés à des lectures par immunoessais multiplexes, facilitant l'analyse comparative entre groupes soumis à différents traitements ou expositions.
- Analytique : Génère des niveaux quantitatifs de médiateurs permettant une évaluation statistique de la colinéarité, de l'activité des réseaux immunitaires et des associations avec des phénotypes.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les profils immunitaires néonatals et les symptômes respiratoires de l'enfance ainsi que les expositions environnementales, soutenant des décisions d'avancement fondées sur la stratification des risques.
- Réutilisation en entreprise : Représente une technique d'échantillonnage compatible avec les plateformes, applicable à divers modèles de maladies respiratoires et modalités thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit une confiance prédictive dans la validation des cibles en capturant l'activité immunitaire endogène dans le microenvironnement muqueux natif.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à des procédures standardisées de collecte, d'élution et de stockage, réduisant ainsi la variabilité pré-analytique.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en reliant les mécanismes immunomodulateurs à des signatures immunitaires précoces, réduisant les risques biologiques en phase avancée dans les programmes respiratoires.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats en fonction de leurs effets démontrés sur les voies immunitaires muqueuses dans des modèles humains pertinents et longitudinaux.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une formation en anatomie des voies respiratoires du nouveau-né et en technique d'échantillonnage douce pour assurer le confort du sujet et l'intégrité de l'échantillon.
- Dépend de l'accès à des tubes à ultrafiltration, à des agitateurs de plaques et à une infrastructure de dosage immunoanalytique par électrochimiluminescence pour la détection des analytes.
- Exige une préparation standardisée du tampon avec des inhibiteurs de protéases afin d'empêcher la dégradation des médiateurs pendant l'extraction.
- Requiert une adaptation de la durée d'échantillonnage ou de la taille du filtre lorsqu'elle est appliquée à des enfants plus âgés ou à d'autres sites muqueux.
- Limitée par l'abondance des analytes, certains médiateurs se situant fréquemment en dessous de la limite de détection, ce qui nécessite une optimisation de la sensibilité du dosage pour les cibles faiblement exprimées.
