Absorption de liquides nasales et bronchiques : échantillonnage Precision de la muqueuse respiratoire humaine et traitement des échantillons en laboratoire

Ce manuscrit décrit l’utilisation de techniques d’absorption nasal et bronchique, spécifiquement à l’aide de matrices d’absorption synthétiques (SAM) pour goûter le liquide de la muqueuse (MLF) des voies respiratoires supérieures et inférieures. Ces méthodes offrent la meilleure standardisation et la tolérance que les techniques d’échantillonnage respiratoires existants.

Aujourd’hui, nous allons faire la démonstration de la technique de nasosorption, une forme d’échantillonnage de précision de la muqueuse utilisant une matrice absorbante synthétique pour absorber le liquide de la muqueuse. L’échantillonneur de nasosorption se compose d’une poignée et d’un SAM dans un cryotube stérile. Le SAM est constitué de polymères, soit de fibres, soit de mousse, et est spécialement sélectionné pour être doux et absorbant, avec une mèche rapide pour la collecte d’échantillons.

Les SAM ont également une liaison protéique minimale, pour permettre l’élution efficace des sécrétions absorbées. La nasosorption est une technique très douce et non invasive qui peut être pratiquée sur des patients de tous âges, y compris des bébés. De plus, un échantillonnage en série, même toutes les quelques minutes, est possible.

Lors de la nasosorption, vous devez d’abord vous laver les mains et mettre des gants, de préférence devant le patient. Tout d’abord, la cavité nasale est inspectée. Nous recommandons l’utilisation d’une lampe frontale et l’utilisation du pouce non dominant par le clinicien pour rétracter le nez du patient afin de visualiser la cavité nasale.

Un spéculum nasal n’est généralement pas nécessaire. Si vous regardez dans la cavité nasale, les narines, ou narines, ne sont pas rondes en section transversale et elles vont tout droit vers l’arrière. Vous voyez généralement le cornet inférieur comme un renflement, une échancrure sur la paroi latérale de la narine, avec la cloison nasale formant la paroi médiale lisse et plate.

Nous voulons prélever un échantillon de ce cornet inférieur, car l’épithélium sous-jacent est un épithélium cilié simple des voies respiratoires. Lors de l’échantillonnage, la SAM de la nasosorption est transmise doucement dans la lumière, l’orientant pour qu’elle soit à plat contre le cornet inférieur. Utilisez ensuite l’index pour appuyer le SAM sur la muqueuse nasale.

Cela peut provoquer un léger chatouillement avec un larmoiement possible lorsque le FML est absorbé. Nous utilisons généralement une absorption chronométrée de 60 secondes. Le dispositif de nasosorption est ensuite retiré de la narine, remis dans le cryotube et peut être immédiatement stocké sur de la glace, puis congelé.

Alternativement, vous pouvez procéder immédiatement à l’éluation de la FML. La nasosorption est étudiée dans une variété de modèles de provocation de la muqueuse nasale et également dans différentes maladies des voies respiratoires. Cependant, cette méthode relativement nouvelle doit encore être validée formellement par rapport à d’autres méthodes d’échantillonnage respiratoire.

La technique de bronchosorption utilise une matrice absorbante synthétique pour échantillonner le liquide de la muqueuse de la bronche. La méthode est réalisée par du personnel spécialisé via un bronchoscope à fibre optique. Le dispositif de bronchosorption se compose d’un cathéter creux externe avec un fil-guide central en plastique.

Celui-ci a un SAM à l’extrémité qui peut être extrudé lors de l’activation de la pièce à main. Comme la nasosorption, la bandelette SAM est douce et absorbante, avec une mèche rapide pour le prélèvement d’échantillons. Il a également une liaison protéique minimale pour permettre l’élution efficace des sécrétions absorbées.

Avant de placer le dispositif de bronchosorption dans le bronchoscope, il est habituel de vérifier que le SAM s’extrude et se retire facilement dans le cathéter. Nous allons maintenant démontrer la méthode de bronchosorption à l’aide d’un simulateur de bronchoscopie. Tout d’abord, une bronchoscopie standard est effectuée, en passant le bronchoscope le long de la trachée, dans la bronche principale droite et au niveau de la bronche intermédiaire juste à proximité de la division des lobes inférieur droit et moyen droit.

Une fois inséré à ce niveau, cinq étapes sont suivies. L’un, le cathéter baissé. Insérez le cathéter de bronchosorption dans le canal opératoire du bronchoscope jusqu’à ce que la pointe blanche soit visible dans les voies respiratoires jusqu’à un maximum d’un centimètre distal de l’extrémité du bronchoscope.

Gardez le bronchoscope et l’embout du cathéter au centre de la lumière des voies respiratoires. Veillez à minimiser le contact entre l’extrémité du cathéter et la muqueuse bronchique pour réduire le risque de lésions de la muqueuse. Deux, SAM dehors.

Appuyez sur la poignée de l’appareil de bronchosorption de manière à ce que la bande SAM soit extrudée dans la lumière des voies respiratoires du lobe inférieur droit ou moyen. En vision directe, pliez l’extrémité du bronchoscope pour vous assurer que le SAM entre en contact avec le liquide de la muqueuse sur la paroi des voies respiratoires. Laissez la bandelette SAM dans les voies respiratoires, à plat sur la paroi de la muqueuse pendant 30 secondes.

Trois, SAM dedans. En vision directe, rétractez le SAM directement dans le cathéter. Lorsque vous vous rétractez, assurez-vous que la sonde SAM humide est droite.

Si nécessaire, le cathéter et l’embout du bronchoscope peuvent être ramenés pour redresser le SAM. S’il est difficile de rétracter le SAM, retirez l’ensemble de l’appareil avec le SAM expulsé des voies respiratoires. Quatre, cathéter vers le haut.

Retirez tout le cathéter du canal opératoire du bronchoscope. Cinq, coupez SAM. Le SAM est coupé avec des ciseaux stériles, placé dans un cryotube et doit être immédiatement placé sur de la glace avant d’être congelé ou élué directement.

Le clip vidéo suivant montre l’extrusion d’une MAS dans les voies respiratoires d’un patient subissant une bronchoscopie de recherche. La bronchosorption est actuellement étudiée dans une variété de maladies pulmonaires différentes. Nous espérons que cette méthode d’échantillonnage précis des muqueuses s’avérera utile dans le bilan diagnostique et la stratification et le suivi des patients.

Traitement en laboratoire après la nasosorption et la bronchosorption. L’élution du liquide de la muqueuse à partir de la matrice absorbante synthétique. Aujourd’hui, nous allons démontrer les principes généraux du traitement des échantillons de laboratoire après les techniques non invasives d’échantillonnage de la muqueuse de la nasosorption et de la bronchosorption.

En particulier, nous montrerons comment éluer l’échantillon de liquide de la muqueuse à partir de la matrice absorbante synthétique. Au point de prélèvement, les échantillons doivent être placés sur de la glace pour être transportés au laboratoire. Les échantillons peuvent être traités immédiatement ou placés directement dans la congélation dans leur tube d’échantillon d’origine pour une élution ultérieure.

Si un traitement immédiat est effectué, l’échantillon peut être transféré sur de la glace au laboratoire dans son tube d’échantillon d’origine. Ou bien, le SAM peut être détaché et placé dans un tampon d’élution au point de collecte, puis transféré sur de la glace au laboratoire. Les échantillons peuvent rester sur de la glace dans un tampon ou dans leur tube d’échantillon pendant plusieurs heures avant d’être traités.

Une étape de lavage préalable à la centrifugation et à l’élution par centrifugation du SAM vise à optimiser le rendement de l’échantillon. Pour ce faire, le SAM est inséré dans un tube Eppendorf avec le bougre d’extraction souhaité. L’échantillon est ensuite mélangé sur un mélangeur vortex pendant 30 secondes pour laver le SAM des fluides et des biomolécules faiblement attachés.

Pour assurer une récupération complète de l’échantillon, l’élution par essorage est ensuite effectuée en ajoutant le SAM humide à un insert d’essorage à l’intérieur du même tube Eppendorf utilisé pour le lavage. Des pinces propres doivent être utilisées pour cette procédure et doivent être changées entre les échantillons pour éviter toute contamination. Cette méthode utilise la centrifugation pour extraire le fluide du SAM.

Nous centrifugons des échantillons pendant 20 minutes à 16 000 g dans une centrifugeuse refroidie à quatre degrés Celsius. Le bougre d’élution utilisé sera déterminé par l’application souhaitée. Nous utilisons couramment un tampon d’analyse aminologique contenant des protéines ou un tampon de lyse de l’ARN.

Deux types de filtres d’essorage peuvent être utilisés. Le premier ne contient qu’un treillis en plastique qui maintient le SAM en place, permettant une élution complète des fluides. Alternativement, si vous travaillez avec des matériaux infectieux, des filtres de spin avec une taille de pores de 0,2 micromètre peuvent être utilisés.

Ces filtres décontaminent les échantillons infectés et conviennent aux échantillons suspectés d’infection microbactérienne. Si de tels filtres sont nécessaires, il est important d’inclure une étape de pré-incubation où le tampon protéique est laissé tremper à travers le filtre avant l’ajout de l’échantillon. Cette étape minimise la liaison des médiateurs au filtre par l’absorption de protéines non spécifiques.

Voici un exemple de méthode utilisée par notre laboratoire pour le traitement de la nasosorption et de la bronchosorption d’échantillons ne nécessitant pas d’étape de décontamination, y compris les agents pathogènes de classe deux. Première étape, le SAM est placé dans un Eppendorf contenant le tampon et le vortex appropriés pendant 30 secondes. Pour la nasosorption, nous utilisons généralement 300 microlitres de tampon et pour la bronchosorption 100 microlitres.

Deuxième étape, le SAM est retiré à l’aide d’une pince et placé dans un gobelet filtrant en maille plastique avec le tampon utilisé pour laver le SAM. Troisième étape, le gobelet filtrant en maille plastique contenant le SAM est renvoyé à l’Eppendorf d’origine. À la quatrième étape, la coupelle filtrante d’Eppendorf, le tampon et le SAM est centrifugé pendant 20 minutes à 16 000 g à quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, la coupelle du filtre contenant le SAM est retirée et éliminée. L’élu peut ensuite être aliquote et congelé pour une analyse ultérieure. L’échantillonnage par nasosorption a été appliqué à un certain nombre de contextes de recherche clinique en pneumologie.

Cela comprend des mesures des médiateurs inflammatoires lors de la provocation nasale des allergènes, tels que la prostaglandine D2 et l’interleukine 5. Il est important de noter que dans ces contextes de modèles de défi, l’échantillonnage par nasosorption permet un profilage cinétique fréquent des niveaux de médiateurs, où l’échantillonnage peut être répété toutes les quelques minutes. La nasosorption a également été utilisée lors d’une provocation d’infection à rhinovirus chez des sujets sains et des asthmatiques allergiques où la nasosorption a été répétée quotidiennement au cours de la période d’étude.

L’utilisation de la nasosorption dans l’étude a permis une caractérisation sensible des réponses de l’interféron à l’infection par le rhinovirus. Enfin, nous avons utilisé l’échantillonnage par nasosorption pour étudier les nourrissons atteints de bronchiolite. Dans cette étude, l’infection par le virus respiratoire syncytial était associée à des niveaux plus élevés de médiateurs inflammatoires, tels que l’interféron gamma.

Il est important de noter que l’échantillonnage par nasosorption permet d’inclure un groupe témoin sain dans les études chez les nourrissons. La bronchosorption a également été utilisée dans l’étude de provocation du rhinovirus chez des sujets sains et des asthmatiques allergiques. Cette étude a démontré des augmentations significatives des médiateurs inflammatoires de l’interféron gamma, de l’ITAC, de l’IL-10 et de l’IL-5 dans les voies respiratoires inférieures pendant l’infection par le rhinovirus.

L’inclusion de cette technique dans l’étude des voies respiratoires inférieures crée la possibilité de mesurer les niveaux de médiateurs, qui pourraient être indétectables par les méthodes conventionnelles telles que le lavage broncho-alvéolaire. En conclusion, le liquide de la muqueuse peut être obtenu de manière non invasive et a un potentiel intéressant pour mesurer les réponses inflammatoires dans l’infection et l’inflammation. Les méthodes d’élution doivent être adaptées en fonction de la nature des échantillons et des paramètres à mesurer.

En particulier, la FML peut être utilisée pour mesurer les cytokines et les chimiokines de la muqueuse, les infections virales, la charge virale, les infections bactériennes et fongiques, le microbiome et les anticorps de la muqueuse. Enfin, les méthodes d’échantillonnage et d’élution de la muqueuse nécessiteront un développement sur mesure et une validation minutieuse pour les projets individuels.