Méthodes d'extraction des endosymbionts de la mouche blanche Bemisia tabaci

L’objectif global de cette expérience est d’extraire des endosymbiontes de minuscules insectes pour d’autres expériences. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés du point de vue de l’entomologie et de la macrobiologie, car la plupart des endosymbiotes ne peuvent pas être cultivés in vitro. La méthode montre qu’il est très important d’isoler des quantités suffisantes de bactéries pour des expériences ultérieures.

Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons facilement isoler les endosymbiotes bactériens d’aleurodes. Cela peut également s’appliquer à l’isolement des endosymbiotes d’autres insectes tels que les pucerons, les cicadelles et les thrips. Pour commencer, prélevez une aleurode adulte individuelle et homogénéisez-la dans 30 microlitres de tampon de lyse.

Incuber l’homogénat à 65 degrés Celsius pendant une heure. Puis 100 degrés Celsius pendant 10 minutes. À l’aide d’ADN d’aleurode et d’amorces de cytochrome oxydase 1 mitochondiale, préparez des réactions PCR de 25 microlitres à l’aide des réactifs suivants.

Ensuite, exécutez les réactions PCR à l’aide du programme présenté ici. Ensuite, utilisez un kit d’extraction de gel d’ADN suivant le protocole recommandé pour nettoyer le produit PCR. Ensuite, effectuez une analyse séquentielle selon le protocole texte.

Pour amplifier des gènes spécifiques de chaque endosymbiote au sein de l’aleurode, effectuez une PCR sur l’ADN de l’aleurode. Selon un protocole précédemment publié, soumettez l’échantillon amplifié à l’électrophorèse et au séquençage sur gel d’agarose afin de déterminer l’espèce bactérienne au sein de l’aleurode et d’identifier le gène spécifique de chaque bactérie. Pour disséquer et purifier la bactériome de l’aleurode, ajoutez 100 microlitres de 1 solution PBS sur une lame de microscope.

Ensuite, cueillez les nymphes du troisième ou du quatrième stade sur les feuilles de coton. Et les immerger dans le PBS. Au microscope, utilisez de fines aiguilles entomologiques pour extraire les bactériomes du corps de l’aleurode.

Soyez prudent lorsque vous isolez le bactériome car il est petit et fragile. Découpez doucement un trou d’un côté de la nymphe et appuyez légèrement sur l’autre côté pour laisser sortir les bactériomes. Ensuite, montez un microchargeur de 20 microlitres sur une pipette de 0,5 à 10 microlitres et extrayez le bactériome individuel du PBS dans le microchargeur.

Lavez le bactériome pour éliminer la contamination des autres tissus des aleurodes en l’envoyant dans le PBS et en l’extrayant. Répétez le lavage trois fois. Il est fortement recommandé de répéter le lavage pour éliminer autant de contamination que possible.

Pipetez immédiatement le bactériome lavé dans un tube à centrifuger contenant 60 microlitres de PBS. La seringue filtre le bactériome assemblé à travers une membrane filtrante de cinq micromètres. Répétez la filtration plusieurs fois pour bien déplacer le liquide mélangé à travers la membrane.

Pour amplifier le filtrat, préparez le tampon D2 à utiliser avec le protocole recommandé pour l’amplification de l’ADN génomique du sang ou des cellules avec quelques modifications. Ajouter directement 1,5 microlitre de filtrat dans un tube de centrifugation suivi de 1,5 microlitre de tampon D2. Mélangez bien et incubez l’échantillon sur de la glace pendant 10 minutes. Ajoutez ensuite 1,5 microlitres de solution d’arrêt.

Ajoutez 15 microlitres de tampon de réaction et un microlitre d’ADN polymérase et mélangez délicatement. Incuber le mélange à 30 degrés Celsius pendant 16 heures, puis à 65 degrés Celsius pendant trois minutes. Effectuer une PCR directement sur le filtrat amplifié à l’aide d’amorces spécifiques conçues pour les bactéries afin de confirmer l’espèce bactérienne.

Effectuez également une PCR pour confirmer s’il y a contamination du génome de l’hôte en utilisant des amorces pour les gènes de l’aleurode bêta-actine et EF1 selon la méthode précédemment publiée. Enfin, effectuez le séquençage du méta-génome selon le protocole de texte. Dans cette figure, le coton pour l’élevage des aleurodes et plusieurs stades de développement des aleurodes sont représentés.

Y compris un adulte et des nymphes du premier, deuxième et quatrième stade. L’analyse FISH des endosymbiotes Portiera et Hamiltonella au sein de la nymphe du quatrième stade de MEAM1 est présentée ici. Un chevauchement des deux bactéries est observé et les deux sont confinées aux bactériocytes de l’aleurode.

Voici les images de microscopie électronique à transmission de l’endosymbiote Portiera de l’aleurode, indiquant que Portiera peut perdre sa paroi cellulaire. Après le séquençage et le nettoyage des données de contamination pour les adaptateurs et les duplications, le génome complet du symbiote obligatoire Portiera a été acquis. Il en résulte un génome circulaire de 358 232 paires de bases.

De plus, une ébauche du génome d’Hamiltonella a été obtenue qui comprenait 138 contigs qui ont été assemblés en 89 échafaudages basés sur des relations d’extrémité appariées. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 heures si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de protéger les échantillons de la contamination par les bactéries environnementales.

Après cette procédure, d’autres analyses telles que la séquence RA et le bactériome de masse peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’expression des gènes endosymbiotes et le métabolisme. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’entomologie et de la microbiologie pour explorer la fonction des endosymbiotes chez les insectes ou les arthropodes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’extraire les symbiotes des bactériomes d’insectes.

N’oubliez pas que travailler avec certains réactifs peut être dangereux et que des précautions telles que le port de gants doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.