Protocole de numérisation de l'horloge pour l'analyse d'image: Plugins ImageJ

L'objectif général de ces protocoles de balayage horaire est de permettre la caractérisation rapide de l'intensité moyenne des pixels à l'intérieur, le long de la bordure, et/ou à l'extérieur de régions d'intérêt sélectionnées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés et à former les analystes d'images sur l'intensité moyenne des pixels dans des régions d'intérêt spécifiques. Les principaux avantages de la technique de balayage horaire résident dans sa capacité à caractériser rapidement l'intensité moyenne des pixels depuis une orbite, dans une ou plusieurs régions d'intérêt.

Pour l'analyse standard par balayage horloge, dans le menu Fichier, du programme ImageJ approprié, sélectionnez Ouvrir pour ouvrir un fichier image d'intérêt. Par exemple, ici, une section de tissu contenant des neurones marqués pour une protéine d'intérêt sera analysée. Sélectionnez un outil de dessin approprié et délimitez la région d'intérêt.

Sélectionnez Plugins et Clock Scan dans le menu Fichier pour ouvrir le protocole standard de balayage horloge, ainsi que la fenêtre d'options contextuelle. La fenêtre du gestionnaire de zones d'intérêt s'ouvrira également, avec le contour ajouté automatiquement. Dans la fenêtre d'options du plugin, utilisez les barres de défilement pour modifier les coordonnées x et y au centre de la zone d'intérêt, selon les besoins.

En fonction de la quantité de région d'arrière-plan située à l'extérieur de l'objet qui doit être couverte par l'analyse, utilisez la barre de défilement de limite d'analyse pour ajuster les limites d'analyse. Sélectionnez les cases à cocher correspondant au rayon réel, à la soustraction du fond, à la transformation polaire et/ou au tracé avec l'écart type selon les besoins expérimentaux. Ensuite, cliquez sur OK pour exécuter le module complémentaire.

Une fois l'analyse terminée, utilisez la commande liste pour accéder aux données numériques en vue d'une analyse supplémentaire. Pour l'analyse de balayage horaire de plusieurs régions, ouvrez un fichier image contenant plusieurs régions d'intérêt. Par exemple, ici, un ensemble de trames capturées dans la même section de tissu, comme vient de l'être démontré, sera analysé.

Cliquez sur Analyser, puis sur Outils, puis sur Gestionnaire de zone d’intérêt et utilisez l’outil de dessin approprié pour délimiter chaque zone d’intérêt. L’outil de ligne segmentée est utile pour sélectionner des zones d’intérêt asymétriques et pour exclure l’étiquetage du fond. Cliquez sur Ajouter dans la fenêtre du Gestionnaire de zone d’intérêt pour ajouter chaque zone d’intérêt au gestionnaire dès qu’elle est sélectionnée.

Dans le menu Plugins, sélectionnez Multi Clock Scan pour ouvrir la fenêtre contextuelle des options de protocole et réinitialisez la limite de balayage, si nécessaire. Vérifiez le tracé avec l'écart type et/ou soustrayez la case du fond, selon les besoins expérimentaux. Ensuite, cliquez sur OK pour exécuter le protocole, ce qui générera deux fenêtres de tracés en sortie.

Pour l'analyse par balayage horaire d'une pile d'images, ouvrez une pile d'images d'intérêt. Ici, une pile d'images d'un ganglion de la racine dorsale isolé, marqué avec une fluorescence sensible au calcium et imagé avant et après une stimulation par électrode intracellulaire, sera analysée. Délimitez la région d'intérêt dans la pile d'images.

Ajoutez la pile d'images sélectionnée au gestionnaire de régions d'intérêt, comme vient de l'être démontré, puis sélectionnez Multi Clock Scan pour ouvrir la fenêtre contextuelle des options de protocole. Réinitialisez la limite de balayage si nécessaire, activez l'option d'affichage de l'écart type et/ou la soustraction du fond, selon les besoins expérimentaux. Cliquez ensuite sur OK pour exécuter le protocole, ce qui générera deux fenêtres de tracés en sortie.

Dans cette analyse représentative d'une section tissulaire de neurones marqués de façon fluorescente, une région d'intérêt a été dessinée à travers le signal intense pour la protéine d'intérêt, et une analyse standard de balayage horaire a été effectuée afin de recueillir des profils radiaux d'intensité des pixels depuis le centre de la région d'intérêt jusqu'à la limite de balayage définie. Les balayages radiaux ont été normalisés par rapport au rayon de la région d'intérêt dans la direction du balayage. Une moyenne a été calculée pour produire un profil intégré d'intensité radiale des pixels, révélant que la majeure partie de la protéine d'intérêt était localisée au niveau de la membrane plasmique de la cellule.

Étant donné qu'une courbe avec écart type a été sélectionnée pour cette analyse, les lignes verticales d'écart type indiquaient les variations d'intensité entre les pixels des profils de balayage radial individuels à une distance donnée par rapport à l'origine du balayage. Dans cette analyse, plusieurs régions d'intérêt au sein de l'échantillon de tissu neuronal ont été balayées, comme vient d'être démontré, générant un profil d'intensité intégrale des pixels pour chaque objet balayé, selon l'ordre dans lequel ils ont été ajoutés au gestionnaire de régions d'intérêt, ainsi qu'un profil d'intensité moyenne des pixels pour chaque région d'intérêt sélectionnée.

Par conséquent, ces barres d'écart-type représentent la variabilité entre les balayages intégraux d'objets individuels, plutôt que les balayages radiaux individuels. Ici, une analyse par pile d'images d'un neurone isolé du ganglion de la racine dorsale, capturée à différents moments avant et après stimulation par électrode intracellulaire, a été réalisée. À la fin de l'analyse, un profil d'intensité intégrale des pixels pour chaque occurrence de l'objet d'intérêt sur différentes images de la pile, ainsi qu'un profil d'intensité moyen des pixels pour toutes les occurrences de l'objet ont été affichés.

En outre, l'analyse de l'écart type d'une pile d'images numérisées par horloge montre la variabilité des données entre les balayages intégraux au sein de l'ensemble de la pile d'images. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mesurer les intensités des pixels à l'aide de greffons de numérisation horloge. Notre objectif en développant ces greffons était de rendre ce type d'analyse d'image librement accessible à tous les chercheurs.

Nous pensons que le protocole d'analyse horaire sera utilisé dans de nombreux domaines de recherche, notamment, mais sans s'y limiter, les applications d'imagerie biologique, chimique et physique. Alors que nous continuons à développer et à exploiter ces greffons d'analyse horaire, nous apprécierons tout retour et toute suggestion des parties intéressées sur la manière d'améliorer ces outils.