Protocole de numérisation de l'horloge pour l'analyse d'image: Plugins ImageJ

L’objectif global de ces protocoles de balayage d’horloge est de permettre la caractérisation rapide de l’intensité moyenne des pixels à l’intérieur, le long de la bordure et/ou à l’extérieur de régions d’intérêt sélectionnées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés et à enseigner aux analystes d’images l’intensité moyenne des pixels dans des régions d’intérêt spécifiques. Les principaux avantages de la technique de balayage de l’horloge sont qu’elle peut être utilisée pour caractériser rapidement l’intensité moyenne des pixels depuis l’orbite dans une ou plusieurs régions d’intérêt.

Pour l’analyse de balayage d’horloge standard, sous le menu Fichier, dans le programme ImageJ approprié, sélectionnez Ouvrir pour ouvrir un fichier image qui vous intéresse. Par exemple, ici, une section de tissu avec des neurones marqués pour une protéine d’intérêt sera analysée. Sélectionnez un outil de dessin approprié et tracez le contour de la région qui vous intéresse.

Sélectionnez Plugins et Clock Scan dans le menu Fichier pour ouvrir le protocole de balayage d’horloge standard, fenêtre contextuelle. La fenêtre du gestionnaire de régions d’intérêt, avec le contour ajouté automatiquement, s’ouvrira également. Dans la fenêtre d’options du plug-in, utilisez les barres de défilement pour modifier les coordonnées x et y au centre de la région d’intérêt, le cas échéant.

En fonction de la quantité de la zone d’arrière-plan à l’extérieur de l’objet qui doit être couverte par le balayage, utilisez la barre de défilement des limites de balayage pour ajuster les limites de balayage. Cochez les cases Rayon réel, Soustraire l’arrière-plan, Transformée polaire et/ou Tracer avec écart-type, selon l’expérience appropriée. Ensuite, cliquez sur OK pour exécuter le plugin.

Une fois l’analyse terminée, utilisez la commande list pour accéder aux données numériques afin une analyse plus approfondie. Pour l’analyse par balayage d’horloge de plusieurs régions, ouvrez un fichier image contenant plusieurs régions d’intérêt. Par exemple, ici, un panel d’images capturées dans la même section de tissu, comme nous venons de le démontrer, sera analysé.

Cliquez sur Analyser, puis sur Outils, puis sur Gestionnaire de régions d’intérêt et utilisez l’outil de dessin approprié pour délimiter chaque région d’intérêt. L’outil Ligne segmentée est utile pour sélectionner des régions d’intérêt asymétriques et pour exclure l’étiquetage d’arrière-plan. Cliquez sur Ajouter dans la fenêtre Gestionnaire de régions d’intérêt pour ajouter chaque région d’intérêt au gestionnaire au fur et à mesure qu’elle est sélectionnée.

dans le menu Plugins, sélectionnez Multi Clock Scan pour ouvrir la fenêtre contextuelle des options de protocole et réinitialiser la limite de balayage, si nécessaire. Vérifiez le graphique avec l’écart-type et/ou soustrayez les cases d’arrière-plan, selon les besoins expérimentaux. Ensuite, cliquez sur OK pour exécuter le protocole, ce qui générera deux fenêtres de tracé de sortie.

Pour l’analyse par balayage d’horloge d’une pile d’images, ouvrez une pile d’images d’intérêt. Ici, une pile d’images d’un ganglion racinaire dorsal isolé, marqué avec un fluorescent sensible au calcium qui a été imagé avant et après la stimulation d’électrodes intracellulaires, sera analysée. Décrivez la région d’intérêt dans la pile d’images.

Ajoutez la pile d’images sélectionnée au gestionnaire de régions d’intérêt, comme cela vient d’être démontré, et sélectionnez Multi Clock Scan pour ouvrir la fenêtre contextuelle des options de protocole. Réinitialisez la limite de balayage si nécessaire et vérifiez le tracé avec l’écart-type et/ou soustrayez les cases d’arrière-plan, selon le cas expérimental. Cliquez ensuite sur OK pour exécuter le protocole, en générant deux fenêtres de tracé de sortie.

Dans cette analyse représentative d’une section tissulaire de neurones marqués par fluorescence, une région d’intérêt a été dessinée à travers le signal brillant pour la protéine d’intérêt, et une analyse de balayage d’horloge standard a été effectuée pour collecter des balayages d’intensité de pixel radiale du centre de la région d’intérêt à la limite de balayage décrite. Les balayages radiaux ont été normalisés en fonction du rayon de la région d’intérêt dans la direction du balayage. Une moyenne, pour produire un profil d’intensité de pixel radio intégral, révélant que la plupart des protéines d’intérêt ont été mesurées au niveau de la membrane plasmique de la cellule.

Comme le tracé avec écart-type a été sélectionné pour cette analyse, les lignes verticales de l’écart-type indiquaient les intensités entre les pixels des profils de balayage radial individuels à une distance donnée de l’origine du balayage. Dans cette analyse, plusieurs régions d’intérêt dans l’échantillon de tissu neuronal ont été balayées, comme nous venons de le démontrer, générant un profil d’intensité de pixel intégral pour chaque objet numérisé dans la séquence où ils ont été ajoutés au gestionnaire de région d’intérêt. Et, un profil d’intensité de pixel moyen pour chaque région d’intérêt sélectionnée.

Ces barres d’écart-type représentent donc la variabilité entre les balayages intégraux d’objets individuels, plutôt que les balayages radiaux individuels. Ici, une analyse de la pile d’images d’un neurone ganglionnaire de la racine dorsale isolé capturé à différents moments, avant et après la stimulation, via une électrode intracellulaire, a été effectuée. À la fin de l’analyse, un profil d’intensité de pixel intégral des instances individuelles de l’objet d’intérêt sur différentes images de la pile et un profil d’intensité de pixel moyen pour toutes les instances de l’objet ont été affichés.

De plus, l’analyse de l’écart-type d’une pile d’images numérisées au cadran démontre la variabilité des données entre les balayages intégraux tout au long de la pile d’images. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer l’intensité des pixels à l’aide de plugins de balayage d’horloge. Notre objectif en développant ces plugins était de rendre ces types d’analyse d’images librement accessibles à tous les enquêteurs.

Nous pensons que le protocole de balayage de l’horloge sera utilisé pour les nombreux domaines de recherche, y compris, mais sans s’y limiter, les applications d’imagerie biologique, chimique et physique. Au fur et à mesure que nous continuons à développer et à exploiter ces plugins de balayage d’horloge, nous apprécierons tous les commentaires et toutes les suggestions des parties intéressées sur la façon d’améliorer ces outils.