Name: Automated Quantification et analyse des procédures de comptage cellulaire Utilisation ImageJ Plugins (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Découvrez la quantification automatisée des cellules en suspension et dans les essais de migration en utilisant les plugins ImageJ CCC et TC. Ces outils open-source offrent un comptage rapide et précis pour la biologie cellulaire.

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Ce travail a été soutenu par les Instituts de recherche en santé du Canada à CP (OR 142730 et OR 89931). Nous tenons à remercier Jelena Brkic pour son idée initiale de l’analyse binaire des particules dans ImageJ.

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<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Count+objects+in+an+image+in+Adobe+Photoshop%5BTitle%5D)+AND+%22Helpx.adobe.com%22%5BJournal%5D)">Count objects in an image in Adobe Photoshop.</a> Helpx.adobe.com. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://helpx.adobe.com/photoshop/using/counting-objects-image.html">https://helpx.adobe.com/photoshop/using/counting-objects-image.html</a> (2016).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les étapes critiques, le dépannage et Limitations La nature même des méthodes de calcul automatiques, en particulier celles de l&#39;analyse des particules, nécessite la capacité mathématique pour définir ces particules. Par conséquent, la précision de la fois Calculatrice cellule de concentration et de détermination de la migration compteur est majorly dépend fidélité d&#39;image, qui est, à quel point l&#39;image capturée ressemble à la membrane échantillon de cellules ou de test de migration...

Dans le comptage des cellules in vitro est une technique de base importante dans une large gamme d&#39;expériences de culture tissulaire. Déterminer avec précision le nombre de cellules dans une culture est essentielle pour la reproductibilité expérimentale et la normalisation 1,2. Le comptage des cellules peut être effectuée manuellement en utilisant un hémocytomètre ainsi que l&#39; utilisation d&#39; une variété de méthodes automatisées, chacun avec leurs propres avantages et inconvénients 3,4,5. La plupart des méthodes automatisées pour le comptage des cellules appartiennent à l&#39;une des deux classes, ceux qui utilisent le principe de Coulter ou de cytométrie de flux. compteurs Coulter profitent de cellules résistance électrique afin de déterminer le nombre de cellules et la taille. Ils sont rapides, précis et moins coûteux que les cytomètres de flux. Cependant, ils sont rarement utilisés que pour le comptage des cellules en raison de leur coût considérable par rapport au comptage manuel 3. Cytomètres de flux, d&#39;autre part, sont chers, mais ils ont de nombreuses applications telles que le comptage des cellules, l&#39;analyse de la forme des cellules, de structure et la cellule de mesure interne marqueurs de 4,5. Les machines qui utilisent l&#39;une de ces deux principes sont disponibles auprès de nombreux fabricants. Comptage manuel est abordable , mais beaucoup de temps et sujettes à des biais tandis que les méthodes automatisées viennent avec une fraction du temps nécessaire pour le comptage manuel , mais en utilisant des machines coûteuses 6. D&#39; autres procédés de culture de cellules communes sont tests in vitro de la motilité cellulaire, à savoir, la migration cellulaire et l&#39; invasion 7. Migration et l&#39;invasion des tests sont communément utilisées pour étudier la motilité cellulaire et l&#39;invasivité en réponse à une réponse chimiotactique. En outre, ils sont largement utilisés pour étudier le développement embryonnaire, la différenciation, la réponse inflammatoire, et les métastases de plusieurs types de cellules 7-11. Les cellules qui ont migré ou envahies à travers la membrane poreuse d&#39;un test de migration peuvent être quantifiés de deux façons différentes. En premier lieu, par coloration des cellules avec un colorant fluorescent, de la dissociation from la membrane et la quantification en utilisant un lecteur de fluorescence 12. Une limitation de cette méthode de quantification est qu&#39;aucun enregistrement peut être retenu des membranes et il n&#39;y a aucune possibilité pour une analyse ultérieure 13. La deuxième méthode de quantification est pour la migration / cellules à fixées et colorées par un colorant fluorescent ou plus communément, avec des colorants cytologiques tels que le cristal violet, toluidine colorant bleu ou hématoxyline envahi; puis les cellules sont quantifiées manuellement à l&#39; aide des images microscopiques inversées de ces membranes qui est une tâche de longue haleine très 12,13. Pour pallier les inconvénients de comptage manuel des cellules, deux marqueurs fiables et précises cellules automatisées pour la concentration des cellules et pour l&#39;essai de migration ont été développés. Ces contre algorithmes cellulaires automatisés ont été développés pour ImageJ comme un plugin Java en utilisant l&#39;ordinateur de la langue d&#39;Oracle. ImageJ est un outil de traitement d&#39;image publique et largement utilisé développé par l&#39;Institut national de Heanté (NIH) 14,15; ainsi, l&#39;écriture de ces plugins pour ImageJ facilite l&#39;intégration dans la communauté biologique. L&#39;automatisation de comptage de cellules assure un débit élevé et la reproductibilité par rapport à un comptage manuel. Bien que d&#39; autres logiciels et plugins disponibles peuvent être utilisées pour calculer la concentration de cellules par analyse d&#39;image 5,16,17, Concentration cellulaire Calculatrice plug - in est rapide et peut également gérer des dilutions de cellules et de traitements. En outre, tous les résultats et les calculs de ces deux compteurs peuvent être enregistrés et exportés. Les deux plugins décrits dans le présent document sont optimisés pour l&#39;utilisation d&#39;un microscope à contraste de phase pour l&#39;imagerie des cellules vivantes et un grand champ de vision (ensemble de capture de la membrane) imagerie pour les membranes d&#39;essai de migration à travers l&#39;utilisation d&#39;un champ de dissection. Les plugins sont disponibles gratuitement en téléchargement avec des instructions d&#39;installation à partir de: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

<table><tbody><tr><td>Milieu liquide classique HyClone : RPMI 1640 - Avec L-Glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002702</td><td>Milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovien (FBS)</td><td>GIBCO BRL</td><td>P00015</td><td>Supplication médiatique</td></tr><tr><td>Lignée cellulaire HTR8/SVneo trophoblaste</td><td>Les cellules ont été obtenues auprès du Dr Charles Graham (Queen' Le</td><td></td> <td>logiciel est conçu pour fonctionner avec n’importe quelle lignée cellulaire.</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>GIBCO BRL</td><td>27250-018</td><td>Préparée à 0,20 % (p/v) en 10 & micro ; M EDTA 1x PBS</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire de 10 cm</td><td>SARSTEDT</td><td>833902</td><td>Toutes les plaques traitées pour la culture tissulaire seront appropriées</td></tr><tr><td>Inserts de membrane en polyester Transwell - 8.0&nbsp ; et micro ; m Taille des pores</td><td>Costar 3422 commandée à Fisher Scientific</td><td>7200150</td><td>Pour plaques à 24 puits ; Taille des pores : 8,0 & micro ; m; 6,5 mm de diamètre ; 0,33 cm2 surface</td></tr><tr><td>de croissance HARLECO Hématologie Colorants et réactifs, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3</td><td>EMD Millipore et commandé auprès de VWR</td><td>65044A, B, & C</td><td>L’ensemble de coloration Hemacolor se compose de trois flacons en polyéthylène de 500 ml (16,9 oz) et comprend un fixateur de méthanol (Solution 1), un colorant à l’éosine ou à l’acide (Solution 2) et un colorant au bleu de méthylène ou basique (Solution 3)</td></tr><tr><td>Applicateur à pointe de coton</td><td>Puritan Medical</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir industriel à un tranchant</td><td>VWR</td><td>55411 - 055</td><td>Épaisseur : 0,30 mm (0,012")</td></tr><tr><td>Lames de microscope - Prénettoyées/Unies</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550A3</td><td>Dimensions : 25 mm x 75 mm x 1,0 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles n° 1</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545E</td><td>Épaisseur : 0,13 à 0,17 mm ; Taille : 50 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>Fisher Chemical Permount Montage Moyen</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Leica Stereo Dissection</td> microscope <td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Le microsope est équipé d’une caméra de microscope Leica Modèle MC170 HD et le logiciel de la caméra est Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build : 490]. Pièces de microscope :&nbsp ; LED3000 modèle d’éclairage ponctuel : MEB126, Leica M80 modèle de support optique M80, objectif achromat 1.0X, WD=90&nbsp ; mm Modèle : MOB306 & Objectif achromat 0,32X, WD=303&nbsp ; mm Modèle : MOB315, Objectif vidéo 0.5X Modèle : MTU-293</td></tr><tr>Assistant<td>d’hémacytomètre</td><td>Allemagne&nbsp ;</td><td></td><td>0,100 mm Profondeur - 0,0025 mm2</td></tr><tr><td>Microscope à lumière inversée Olympus</td><td>Corporation CKX41SF</td><td></td><td>Le microsope est équipé d’une caméra couleur CMOS Lumenera Infinity 1-2 2.0 mégapixels et le logiciel de la caméra est Infinity analyze Version 6.5.2</td></tr><tr><td>Armoire à flux laminaire 1300 Series A2</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>Modèle : 1375</td><td>N’importe quelle armoire à flux laminaire pour les travaux de culture cellulaire conviendra.</td></tr><tr><td>Incubateur de culture cellulaire</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>Modèle : 370</td><td>N’importe quel incubateur de culture cellulaire conviendra - Les cellules ont été cultivées dans un environnement humide, 5 % CO2, 37 &deg ; C&nbsp ;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Version 1.50e</td><td>Version minimale requise</td></tr><tr><td>Java Runtime Environment</td><td>Oracle</td><td>Version 1.8.0_66</td><td>Version minimale requise</td></tr></tbody></table>

automated quantification et analyse des procédures de comptage cellulaire utilisation imagej plugins

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

L&#39;Institut national de ImageJ de santé est un puissant disponible gratuitement suite logicielle, de traitement d&#39;image. ImageJ dispose d&#39;algorithmes complets d&#39;analyse de particules qui peuvent être utilisés efficacement pour compter diverses particules biologiques. Lorsque l&#39;on compte un grand nombre d&#39;échantillons de cellules, le hémocytomètre présente un goulot d&#39;étranglement en ce qui concerne le temps. De même, le comptage des membranes à partir d&#39;essais de migration / invasion avec le plug-in ImageJ compteur de cellules, bien que précise, est le travail exceptionnellement intensive, subjective, et infâme pour causer des douleurs au poignet. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé deux plugins au sein de ImageJ pour la seule tâche de hémocytomètre automatique (ou volume connu) et la migration / invasion cellulaire comptage. Les deux plugins reposent sur la capacité d&#39;acquérir des micrographies de haute qualité avec un fond minimal. Ils sont faciles à utiliser et optimisé pour le comptage rapide et l&#39;analyse des échantillons de grande taille avec des outils d&#39;analyse intégrés pour aider à l&#39;étalonnage des comptages. En combinant le principe de bases de compteur de cellules avec un algorithme de comptage et de post-comptage analyse automatisée, ce qui augmente considérablement la facilité avec laquelle les essais de migration peuvent être traités sans aucune perte de précision.

Calculatrice cellule de concentration La figure 1 présente le processus global de la CCC étalonnage et l&#39; acquisition d&#39;images dénombrable. Figure 1A et 1B représentent l&#39;image d&#39;étalonnage P-carré et le calcul de P-carré en pixels. La CCC détermine la concentration des cellules dans un volume donné par la formule: <img alt="L&#39;équat...

Cet article décrit la quantification des micrographies d’hémocytomètre et de migration/invasion à l’aide de deux nouveaux plugins ImageJ open-source : le calculateur de concentration cellulaire et le compteur de tests de migration. En outre, il décrit les protocoles d’acquisition et d’étalonnage des images et discute en détail des exigences d’entrée des plugins.

Automated Quantification et analyse des procédures de comptage cellulaire Utilisation ImageJ Plugins

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

L'objectif général de ce protocole est d'utiliser des outils d'analyse numérique pour effectuer rapidement des décomptes précis de cellules en suspension ou en migration sur une membrane d'essai d'invasion. Ce protocole peut aider les chercheurs à quantifier le nombre de cellules nécessaire pour des techniques courantes et des essais de mobilité cellulaire in vitro. Le principal avantage de cette méthode réside dans le fait qu'elle fournit des décomptes cellulaires rapides et précis tout en incluant plusieurs filtres et outils d'analyse.Pour commencer, réglez l'éclairage du microscope au maximum. Passez à l'objectif 4x et assurez-vous que les filtres de contraste de phase sont utilisés. Ensuite, dans le logiciel du microscope, réglez les paramètres de capture d'image à leurs valeurs par défaut.Placez maintenant un hématimètre standard sur la platine du microscope et capturez une image pour l'étape d'étalonnage du volume d'image. Ajustez le temps d'exposition selon les besoins. Dans ImageJ, sous la calculatrice de concentration cellulaire, ouvrez l'image et cliquez sur le bouton Obtenir les dimensions de l'image.Cette action remplit les zones de texte de largeur et de hauteur de l'i

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Micropatterns adhésif qui normalisent l'architecture cellulaire peut être utilisé pour augmenter la sensibilité dans la détection des effets des médicaments, améliorer la reproductibilité et de simplifier l'acquisition automatique d'images et d'analyse. Une telle technologie bénéficieront tests de dépistage de drogue / siARN, réalisée sur conventionnelles soutient la culture cellulaire et par conséquent souffrent d'excès de cellule à cellule variabilité.

Amélioration de la visualisation et l&#39;analyse quantitative des effets des drogues utilisant des cellules Micropatterned

Nous décrivons la méthode prototype pour la fabrication des lamelles de microscope recouvertes de gélatine fluorescente pour visualiser dégradation de la matrice invadopodes médiation. Techniques de calcul à l'aide du logiciel disponible sont présentées pour quantifier les niveaux résultants de protéolyse de la matrice de cellules individuelles au sein d'une population mixte et des groupes pluricellulaires englobant ensemble des champs microscopiques.

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Ce protocole décrit la fonctionnalisation de surface personnalisable de la desthiobiotine, de la streptavidine et du système APTES afin d’isoler des types de cellules spécifiques d’intérêt. De plus, ce manuscrit couvre les applications, l’optimisation et la vérification de ce processus.

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L&#39;étude de la protéine système de contrôle de la qualité des<em&gt; D. discoideum</em&gt; Utilisation de cellules vivantes d&#39;imagerie à température contrôlée

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Cet article décrit des méthodes étape par étape pour automatiser la quantification de noyaux basée sur des images à l’aide d’un programme exécutable open source validé sur une gamme de densités cellulaires. Ce programme offre une solution de rechange qui s’attaque aux obstacles liés au coût, à l’accessibilité pour les utilisateurs ayant des compétences technologiques limitées et à la validation propre à l’application qui peut limiter l’utilité des technologies existantes.

Utilisation des bibliothèques de vision par ordinateur pour rationaliser la quantification des noyaux

Découvrez la quantification automatisée des cellules en suspension et dans les essais de migration en utilisant les plugins ImageJ CCC et TC. Ces outils open-source offrent un comptage rapide et précis pour la biologie cellulaire.

Automated Quantification et analyse des procédures de comptage cellulaire Utilisation ImageJ Plugins

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