Automated Quantification et analyse des procédures de comptage cellulaire Utilisation ImageJ Plugins

L'objectif général de ce protocole est d'utiliser des outils d'analyse numérique pour effectuer rapidement des décomptes précis de cellules en suspension ou en migration sur une membrane d'essai d'invasion. Ce protocole peut aider les chercheurs à quantifier le nombre de cellules nécessaire pour des techniques courantes et des essais de mobilité cellulaire in vitro. Le principal avantage de cette méthode réside dans le fait qu'elle fournit des décomptes cellulaires rapides et précis tout en incluant plusieurs filtres et outils d'analyse.

Pour commencer, réglez l'éclairage du microscope au maximum. Passez à l'objectif 4x et assurez-vous que les filtres de contraste de phase sont utilisés. Ensuite, dans le logiciel du microscope, réglez les paramètres de capture d'image à leurs valeurs par défaut.

Placez maintenant un hématimètre standard sur la platine du microscope et capturez une image pour l'étape d'étalonnage du volume d'image. Ajustez le temps d'exposition selon les besoins. Dans ImageJ, sous la calculatrice de concentration cellulaire, ouvrez l'image et cliquez sur le bouton Obtenir les dimensions de l'image.

Cette action remplit les zones de texte de largeur et de hauteur de l'image avec la résolution de l'image en pixels. Ensuite, sélectionnez l'outil de ligne droite et tracez une ligne droite sur toute la longueur du carré principal p de l'hémocytomètre en cliquant et en faisant glisser le curseur. Puis, appuyez sur la touche M pour afficher la fenêtre des résultats.

Maintenant, saisissez la valeur de la colonne longueur dans la zone de texte de longueur p carré du calculateur de concentration cellulaire. Ensuite, cliquez sur le bouton Calculer le volume de l'image pour afficher le volume de l'image dans la zone de texte du volume de l'image. Enfin, cliquez sur le bouton Enregistrer pour terminer l'étalonnage du module.

Pour l'analyse de l'échantillon, chargez 10 microlitres de cellules dans les deux chambres d'une lame de cytomètre hématique et ajustez la mise au point de manière que l'intérieur des cellules soit plus sombre que la membrane cellulaire, afin de bien focaliser la coupe centrale de la cellule et non ses pôles. Ensuite, ajustez davantage l'exposition pour que les cellules ne soient pas surexposées. Des lignes légèrement visibles du cytomètre hématique sont acceptables.

À présent, capturez cinq à dix images non superposées de la région centrale de la cellule de comptage. La résolution et le grossissement de chaque image doivent être identiques à ceux de l'image de calibration de volume. Ensuite, dans la calculatrice de concentration cellulaire, cliquez sur Compter les cellules et, dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez un dossier à compter.

Ensuite, dans la zone de saisie du nombre d'échantillons, entrez le nombre d'images prises par chambre, puis cliquez sur OK. Le module complémentaire va maintenant recueillir les données. Voir le texte pour plus de détails. Pour commencer, dans le logiciel du microscope, réglez les paramètres de capture d'image sur leurs valeurs par défaut.

Pour l'étape du microscope de dissection, utilisez un fond blanc uni et une source lumineuse placée au-dessus de la platine, de préférence deux lampes LED flexibles. Placez maintenant une lame avec membrane provenant d'un test de migration terminé sur la platine. En observant l'image en temps réel affichée par le logiciel, ajustez manuellement le grossissement de sorte que les bords d'une membrane unique soient juste dans le champ de vue de la caméra.

Ensuite, ajustez les positions des sources lumineuses et les temps d'exposition afin de reproduire, le plus fidèlement possible, l'image idéale, qui présente une couleur de fond minimale et une membrane uniformément illuminée. La précision du décompte cellulaire dépend d'une acquisition d'image de haute qualité.

Il est donc important de capturer l’image la plus optimale possible avec la caméra de l’utilisateur pour une utilisation aussi efficace que possible des greffons. Retirez maintenant la lame et effectuez l’équilibrage des blancs de l’image à l’aide du logiciel du microscope afin de terminer l’étalonnage. Juste avant l’acquisition, aplanissez chaque membrane en appliquant une pression sur la lamelle afin d’éliminer le plus de bulles piégées possible.

Maintenant, dans le logiciel, définissez l'emplacement du dossier de capture. Ensuite, capturez une image par membrane, enregistrant les fichiers d'image au format TIF en utilisant la convention de nommage échantillon 001 avec une augmentation incrémentielle du numéro pour chaque image. Cette convention de nommage est nécessaire pour que le plugin puisse trouver les fichiers.

Si une correction de champ plat est souhaitée, recherchez pour chaque lame une zone vide et prenez une image vierge. Enregistrez le fichier sous le nom « nom de l'échantillon vierge ». Ensuite, dans ImageJ, ouvrez le module complémentaire TC.

Dans TC, cliquez sur le bouton Flatfield, puis dans la boîte de dialogue Choisir un répertoire, sélectionnez le dossier où les images de membrane ont été enregistrées. Ouvrez maintenant une image de membrane d'essai de migration et sélectionnez Seuil de couleur. Dans la fenêtre, réglez la méthode sur Shanbhag.

Définissez la couleur du seuil sur blanc. Réglez l'espace colorimétrique sur RVB et décochez l'option d'arrière-plan sombre. Ensuite, réglez les curseurs supérieurs sur zéro et les curseurs inférieurs sur 255 pour rendre l'image entièrement blanche.

Une fois le blanc ajusté, réglez les curseurs vert et rouge jusqu'à ce que seuls les noyaux soient visibles. Dans le module complémentaire TC, copiez les valeurs des curseurs RVB dans les zones de texte associées des paramètres de configuration seuil RVB. Ensuite, cliquez sur le bouton Ajouter/Modifier et remplacez la configuration.

Dans le panneau des paramètres de configuration, cliquez sur Enregistrer pour sauvegarder les paramètres sur le disque dur. Pour compter les images à l'aide du module TC, cliquez maintenant sur Compter le dossier et sélectionnez le dossier à compter. Le programme traitera ensuite les images et ajoutera automatiquement les données au tableau principal.

Maintenant, dans le tableau principal, une coche apparaîtra dans la colonne Calibrer ? si l'image est marquée pour la calibration en fonction de sa ressemblance avec les métriques idéales. Sélectionnez tous les échantillons marqués pour la calibration.

Ensuite, cliquez avec le bouton droit et sélectionnez Recompter et taille suggérée. Cela recomptera les images avec la surface minimale de particule suggérée. Ensuite, cliquez à nouveau avec le bouton droit et sélectionnez Afficher le graphique.

Une image idéale présentera un graphique ressemblant à une distribution normale à queue droite étirée. Si nécessaire, ajustez les paramètres de la plage de taille inférieure ou du seuil RVB en sélectionnant l'échantillon, en effectuant un clic droit, puis en choisissant Recompter et paramètres manuels. Saisissez ensuite les paramètres souhaités et cliquez sur Compter pour recompter l'image.

Pour ajuster manuellement les dénombrements, sélectionnez les échantillons, cliquez avec le bouton droit sur le tableau, puis choisissez Ouvrir l'image avec les décomptes. L'image d'origine s'ouvrira avec des marques rouges représentant chaque particule dénombrée par le module complémentaire. En outre, l'option Afficher l'image binaire décomptée peut être utilisée pour vérifier dans quelle mesure les cellules individuelles sont correctement résolues par le seuillage de couleur.

Pour ajouter manuellement un décompte, maintenez la touche contrôle enfoncée et cliquez avec le bouton gauche. Un marqueur sera ajouté à l'emplacement du curseur et sera inclus dans le décompte total. Pour supprimer manuellement un marqueur, cliquez avec le bouton droit sur l'image et le plugin supprimera le marqueur le plus proche du curseur.

Pour supprimer un groupe de marqueurs, sélectionnez une région d’intérêt et cliquez avec le bouton droit sur la région tout en maintenant la touche contrôle enfoncée. Le fonctionnement du calculateur de concentration cellulaire dépend de l’image d’étalonnage du p-carré et du calcul de la longueur du p-carré en pixels. Le p-carré d’un hémocytomètre a un volume de 100 nanolitres, et à partir de cette constante, le volume total de l’image peut être calculé après conversion des pixels en millimètres.

Une comparaison des dénombrements manuels et automatisés effectués sur 57 images provenant d'expériences et de types cellulaires variés montre une corrélation très étroite entre les deux méthodes. Les concentrations comprises entre cinq millions et 2 000 cellules par millilitre ont été dénombrées avec précision à l’aide du processus automatisé. La métrique Q représente la clarté globale des images, basée sur la distribution des tailles de particules distinctes.

Un Q adéquat est supérieur à 0,5. En appliquant ces critères à un ensemble d'images allant d'une qualité modeste à excellente en ce qui concerne la luminosité et le bruit de fond, les décomptes d'images étalonnés étaient nettement plus proches des décomptes manuels que les décomptes d'images non étalonnés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment dénombrer avec précision et efficacité les cellules en suspension ainsi que celles issues de tests de mobilité cellulaire à l'aide des greffons CCC et TC pour ImageJ.

Une fois le plugin TC maîtrisé, l'acquisition, la quantification et l'ajustement des décomptes cellulaires peuvent être effectués en moins d'une heure. Les deux plugins s'appuient sur la fonctionnalité de décompte de particules d'ImageJ et peuvent être modifiés en éditant les macros utilisées par ImageJ. Cela offre à l'utilisateur une plus grande flexibilité pour étendre l'application de ces plugins à d'autres types de particules.