Name: Quantifier les cellules microgliales morphologie de microphotographies d’immunohistochimie préparé des tissus à l’aide de ImageJ (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Découvrez une méthode de quantification de la morphologie des microglies à partir de tissus cérébraux préparés en immunohistochimie à l'aide d'ImageJ. Cette technique haut débit utilise l'analyse squelettique et fractale pour étudier les variations de forme cellulaire liées aux états neuro-inflammatoires.

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Cette étude a reçu le soutien financier de NINR (F32NR013611). Nous tenons encore à remercier les développeurs de AnalyzeSkeleton(2D/3D) et FracLac (Arganda-Carreras et coll. et Karperien et al., respectivement) sans laquelle l’analyse décrite dans les présentes ne serait pas possible.

<ol><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).</li>
<li>Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitating+the+subtleties+of+microglial+morphology+with+fractal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection(2013).</li>
<li>Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+microglia%3A+a+morphological+definition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rod microglia: a morphological definition.</a> PLoS One. 9 (5), e97096(2014).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Abiega, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Hyperactivity+Disturbs+ATP+Microgradients%2C+Impairs+Microglial+Motility%2C+and+Reduces+Phagocytic+Receptor+Expression+Triggering+Apoptosis%2FMicroglial+Phagocytosis+Uncoupling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling.</a> PLoS Biol. 14 (6), e1002466(2016).</li>
<li>Wyatt-Johnson, S. K., Herr, S. A., Brewster, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Status+Epilepticus+Triggers+Time-Dependent+Alterations+in+Microglia+Abundance+and+Morphological+Phenotypes+in+the+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Status Epilepticus Triggers Time-Dependent Alterations in Microglia Abundance and Morphological Phenotypes in the Hippocampus.</a> Front Neurol. 8 (700), eCollection(2017).</li>
<li>Morrison, H., Young, K., Qureshi, M., Rowe, R. K., Lifshitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+microglia+analyses+reveal+diverse+morphologic+responses+in+the+rat+cortex+after+diffuse+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative microglia analyses reveal diverse morphologic responses in the rat cortex after diffuse brain injury.</a> Sci Rep. 7 (1), 13211(2017).</li>
<li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+spatiotemporal+analysis+of+microglia+morphology+during+ischemic+stroke+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion.</a> J Neuroinflammation. 10 (4), (2013).</li>
<li>Gyoneva, S., Traynelis, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norepinephrine+modulates+the+motility+of+resting+and+activated+microglia+via+different+adrenergic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors.</a> J Biol Chem. 288 (21), 15291-15302 (2013).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+Enrichment+Potently+Prevents+Microglia-Mediated+Neuroinflammation+by+Human+Amyloid+beta-Protein+Oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Environmental Enrichment Potently Prevents Microglia-Mediated Neuroinflammation by Human Amyloid beta-Protein Oligomers.</a> J Neurosci. 36 (35), 9041-9056 (2016).</li>
<li>Rodriguez, J. J., Noristani, H. N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+response+to+Alzheimer%27s+disease+is+differentially+modulated+by+voluntary+wheel+running+and+enriched+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Microglial response to Alzheimer's disease is differentially modulated by voluntary wheel running and enriched environments.</a> Brain Struct Funct. 220 (2), 941-953 (2015).</li>
<li>Soltys, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+morphological+study+of+microglial+cells+in+the+ischemic+rat+brain+using+principal+component+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative morphological study of microglial cells in the ischemic rat brain using principal component analysis.</a> J Neurosci Methods. 146 (1), 50-60 (2005).</li>
<li>Orlowski, D., Soltys, Z., Janeczko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+development+of+microglia+in+the+postnatal+rat+brain.+A+quantitative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphological development of microglia in the postnatal rat brain. A quantitative study.</a> Int J Dev Neurosci. 21 (8), 445-450 (2003).</li>
<li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+astrocyte+and+microglia+responses+immediately+following+middle+cerebral+artery+occlusion+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sex differences in astrocyte and microglia responses immediately following middle cerebral artery occlusion in adult mice.</a> Neuroscience. 339, (2016).</li>
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<li>Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. , Available from:
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les cellules de la microglie sont finement accordées à la physiologie et la pathologie au sein de leurs micro-domaines et affichent un large éventail de morphologies2 fois subtiles7,14 et blessures brut8. L’utilisation de protocoles ImageJ rend quantification de la morphologie de la microglie accessible à tous les laboratoires comme plate-forme et plugins sont un logiciel de traitement d’images open source. Si le protocole décrit se concentre sur le traitement de l’image et l’analyse à l’aide de ce logiciel, l’uniformité de la collecte des données, la validité et la fiabilité commence par l’excellent IHC et microscopie. Ce protocole est utilisé pour améliorer le binaire, squelette et représentations contour des microphotographies ensemble et cellules individuelles mais ne peut pas prendre la place de pauvres IHC coloration et microscopie qui aboutit à faible contraste, floue ou déformée des images. Comme une autre considération, il faut ne pas d’aplatir le tissu cérébral pendant l’entreposage, avant incision, qui affecte irrévocablement la morphologie de la microglie. Enfin, au sein de chaque expérience, les microglies doivent être copié à l’aide de la même échelle, mais aussi le même microscope. Instrumentation, objectifs et logiciels varient de microscopes qui entraînera les photomicrographies tailles différentes malgré des objectifs similaires et changer le détail ainsi que le nombre de cellules au sein de chaque trame. Par exemple, acquisition d’images à l’aide d’un objectif X 40 sur un Leica SPII entraîne deux fois le nombre de cellules et moins de détails que l’acquisition à l’aide d’un Zeiss 880. Cela est particulièrement important pour les données de ramification des cellules prélevées dans l’ensemble du cadre plutôt que d’une seule cellule, comme cela devient une question d’échantillonnage des données.
En règle générale, analyse du squelette qui utilise la photomicrographie entière précède l’analyse fractale de cellule unique pour deux raisons. Ramification de cellule déterminant de toutes les cellules dans une microphotographie est rapide lorsque comparée à l’analyse fractale de cellule unique et peut être considérée comme un outil de dépistage si le temps est un facteur. En outre, les images binaires au cours de l’analyse de squelette sont utilisées pour analyse fractale. Une fois l’image, il y a un certain nombre d’étapes critiques qui peuvent influencer les résultats de l’analyse de squelette et introduire l’utilisateur-influence. Les étapes du protocole qui sont plus variable entre les utilisateurs ce sont l’étape 4.2 (luminosité croissante de l’image) et 4.5 (déterminer le seuil). Si possible, un nombre optimal pour augmenter la luminosité (curseur max ou min entre 0 et 255) est déterminé et maintenu constant pour toutes les images et les utilisateurs. Lorsque la variabilité de l’image est grande, l’utilisateur peut choisir à la place une luminosité qui variera entre les images. Par ailleurs, si les images sont lumineuses et le contraste est élevé, puis augmentation de luminosité peut être omis et seuillage peut être normalisée à l’aide d’un filtre de seuil de spécialité (e.g., Huang) plutôt que la valeur par défaut plus variable. Une fois optimisées, les paramètres doivent être respectées afin de minimiser l’influence utilisateur supplémentaire.
Un exemple de la variabilité de l’utilisateur est présenté dans la Figure 5. Valeurs de données ont augmenté à 1 utilisateur par rapport à l’utilisateur 2 et donc variabilité augmenterait si les utilisateur 1 et utilisateur 2 a contribué à la collecte de données. Un exemple des différences dans l’utilisateur 1 et utilisateur 2 des images binaires et squelettisés sont soulignées par des cercles colorés (Figure 5). Dans ce cas, les deux utilisateurs ont été brièvement formés étudiants de premier cycle ayant une expertise limitée dans la microglie. Surveillance régulière et l’encadrement par une expert avec protocole accrue d’entraînement2 la microglie peuvent réduire la variabilité inter-utilisateur. Bien que non évalués ici, analyse fractale est moins sujette à la variabilité inter-utilisateur parce que les cellules binaires sont manuellement et individuellement isolées d’une microphotographie, plutôt que de compter uniquement sur seuillage afin de déterminer les formes de la microglie. Cependant, toutes les méthodes possèdent une variabilité entre les utilisateurs. Par conséquent, un seul utilisateur (idéalement, formé par une expertise dans les cellules de la microglie) devrait terminer la collecte de données pour un dataset entier.
Modifications supplémentaires peuvent être facilement apportées à ce protocole et dépendront de la qualité d’image et les efforts déployés pour réduire le bruit et assurer la connectivité de processus. Par exemple, si le contraste est suffisant, puis masque flou n’est pas nécessaire et peut être omis. Il est prudent de les optimiser et finaliser le protocole pour un ensemble spécifique d’images, tant cas expérimentaux et témoins, avant de collecter des données d’un jeu entier. Enfin, les plugins supplémentaires peut être utilisé en lieu et place d’autres pour clarifier ou aiguiser les images qui n’étaient pas décrits dans le présent protocole tels que dilater ou aiguiser.
Avantages du présent protocole sont sa disponibilité universelle et son adaptabilité. En outre, évaluer la ramification de cellule à l’aide de AnalyzeSkeleton est rapide et applicable à un ensemble photomicrographie. Des avantages de l’approche de l’analyse de plusieurs cellules sont l’accent mis sur une région entière plutôt que des cellules individuelles. Par conséquent, il est possible d’évaluer rapidement la ramification moyenne (en termes de points de terminaison et la longueur du processus) de toutes les cellules microgliales au sein de l’image. Squelette analyse fournit une analyse de plusieurs cellules : un échantillon de données en termes de nombre de cellules qui ne peut être égalé par analyse fractale en raison de l’investissement de temps nécessaire pour isoler des cellules individuelles de photomicrographies. Une instance où cela pourrait être mieux adapté serait dans le dépistage des microglies morphologies à proximités d’une lésion focale. Une des limites est le rendu d’image de tout le domaine pour créer des modèles de squelette de microphotographies IHC est imparfait par rapport à l’approche de cellule unique beaucoup plus de temps. En outre, une analyse de la région n’est pas appropriée aux circonstances où les microglies morphologies sont radicalement différents dans le même champ. Enfin, cette méthode d’analyse est tributaire du nombre de cellules, un paramètre qui peut-être différer entre les conditions expérimentales.
Analyse fractale se déroule sur une seule cellule et complète donc la sortie de données de ramification moyenne des cellules issues de l’analyse du squelette. Bien que beaucoup plus de temps consommé, cet investissement donne un large éventail de données morphométriques. Par exemple, la cellule densité, span ratio, et données de circularité décrivent, élongation, forme et la taille de l’esquisse de la cellule, respectivement. Lacunarité et dimension fractale résument la complexité de la cellule et l’hétérogénéité de la forme, respectivement. On trouvera un résumé plus approfondi de la manière dont chaque paramètre est calculé et comment les données peuvent être interprétées dans le manuel interactif16 et les détails sont à considérer en ce qui concerne la question spécifique de recherche. Les résultats du protocole décrit dans les outils sensibles pour quantifier les petits changements dans les morphologies des microglies 2D qui peuvent survenir dans des conditions physiologiques et pathologiques. L’analyse morphométrique supplémentaires tels que la solidité, convexité et facteur de forme16,20 peut être possible si génère des formes 3D.
Adaptation et développement de protocole est continue et axée sur l’utilisateur. Il a été étendu de fluorescence8 à DAB/lumineux-zone images7 , mais pas encore pour tissus incorporé de paraffine. On outre, il peut être utilisé en conjonction avec des logiciels propriétaires comme Imaris pour analyse complémentaire. Ce protocole peut être appliqué à une variété de physiologie et n’est pas limité dans la microglie mais peut être appliqué à toute cellule ou tissu avec motifs particuliers ou des formes qui peuvent être identifiés à l’aide de méthodes IHC. Enfin, avec la taille de l’échantillon suffisant, une analyse multivariée ou cluster peut être appliquée pour stratifier des microglies selon morphologie12,21; Il s’agit d’informations utiles comme la morphologie de la microglie est un indicateur essentiel des fonctions de microglie et des réponses à leur environnement. L’appréciation de la diversité morphologique microgliale est en expansion et important de bien comprendre les interactions neurone-glie-vasculaire au cours de la santé et la maladie. La croissance dans ce domaine est renforcée par des protocoles bien développés, facile à utiliser et reproductibles pour quantifier et résumer la microglie morphologie à l’aide de multiples variables continues.

La microglie ont une réponse morphologique immédiate et diverse altérations dans cerveau physiologie1 selon un continuum de possibilités allant de morphologies hyper-ramification et extrêmement complexes aux morphologies hors ramifiés et amiboïdes2 . La microglie peut-être aussi devenir polarisée et bâtonnets3. Ramification de cellules de la microglie est communément définie comme une forme complexe ayant plusieurs processus et est souvent rapportée que le nombre de points de terminaison par cellule et la longueur des prolongements cellulaires. Puisque les microglies sont finement réglé à fonction neuronale et gliale et cellules continue diaphonie et in vivo la motilité4,5, microglie morphologies pouvant servir comme indicateurs de fonctions cellulaires variés et dysfonctionnements dans le cerveau. Une approche quantitative est nécessaire pour décrire adéquatement la diversité de ces modifications morphologiques et de distinguer les différences entre les cellules ramifiées qui se produisent avec subtiles perturbations physiologiques (tels que l’épilepsie5,6 et7de la commotion cérébrale) en plus de blessures brut (par exemple, accident vasculaire cérébral,8). Une utilisation accrue de morphologie quantification7,8,9,10,11,12,13,14 révélera toute la gamme des microglies morphologies au cours de la santé et la maladie. La présente étude détails l’utilisation progressive des plugins ImageJ nécessaire de résumer les microglies morphologie de fluorescents ou non fluorescent photomicrographies des microglies acquis dans les tissus de rongeurs fixe après l’immunohistochimie (IHC).
Centrale pour les techniques d’analyse décrites ici sont le ImageJ plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, développé en 2010 afin de quantifier les grandes structures mammaires et FracLac16, développé en 2014 pour intégrer l’analyse ImageJ et fractale à quantifier les formes individuelles de la microglie. Ces plugins fournissent une analyse rapide de la ramification de la microglie dans photomicrographies entières ou plusieurs cellules microgliales d’un retour sur investissement défini dans une microphotographie. Cette analyse peut être utilisée seul ou en complément avec l’analyse fractale. L’analyse fractale de cellule unique (FracLac) nécessite un investissement de temps mais offre plusieurs sorties de morphologie au sujet de la complexité de la microglie, forme et taille. L’utilisation de ces deux outils n’est pas superflue, comme cellule de ramification est complémentaire à la complexité de la cellule et la combinaison de plusieurs paramètres peut-être servir à distinguer les microglies diverses morphologies dans datasets12,17.

<table><tbody><tr><td>anticorps anticorps primaire anti-IBA1</td><td>Wako&nbsp ;</td><td>019-19741</td><td>lapin hôte</td></tr><tr><td>Vectashield montage souple</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire</td><td>Jackson ImmunorResearch</td><td>711-545-152</td><td>âne hôte</td></tr> 4 <tr><td>mL flacon en verre</td><td>Wheaton</td><td>UX-08923-11</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S-8032</td><td></td></tr><tr><td>lamelle en verre</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>Référence 12-544-G</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifier les cellules microgliales morphologie de microphotographies d’immunohistochimie préparé des tissus à l’aide de imagej

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Les microglies sont des phagocytes de cerveau qui participent à l’homéostasie du cerveau et d’enquête en permanence leur environnement pour dysfonctionnement, les blessures et la maladie. Comme les premiers intervenants, la microglie ont des fonctions importantes pour atténuer la dysfonction neurone et cellule gliale, et dans ce processus, ils subissent un large éventail de modifications morphologiques. La microglie morphologies peuvent être classés de manière descriptive ou, alternativement, peuvent être quantifiés comme une variable continue des paramètres tels que la ramification de la cellule, la complexité et la forme. Méthodes pour quantifier les cellules microgliales sont appliquées à des cellules individuelles, peu de techniques s’appliquent aux multiples microglies dans un ensemble photomicrographie. Cette méthode vise à quantifier les multiples et des cellules individuelles à l’aide de protocoles de ImageJ facilement disponibles. Ce protocole est un résumé des étapes et plugins ImageJ recommandé pour convertir les images binaires et squelettisés représentant photomicrographies fluorescence et lumineux-zone et de les analyser à l’aide de logiciels plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) et FracLac pour la collecte de données de morphologie. Les sorties de ces plugins résument la morphologie cellulaire en ce qui concerne les points finaux de process, jonctions et longueur ainsi que complexité, la forme des cellules et des descripteurs de taille. Le protocole d’analyse squelette décrit ci-après est bien adapté pour une analyse régionale des microglies multiples au sein d’un ensemble photomicrographie ou d’une région d’intérêt (ROI), tandis que FracLac fournit une analyse de cellules individuelles complémentaires. Combinés, le protocole prévoit un objectif, un outil d’évaluation sensibles et complète qui peut être utilisé pour stratifier entre microglie diverses morphologies présentes dans le cerveau en bonne santé et blessé.

Les protocoles d’analyse de la morphologie microglie décrits ci-après résument les étapes utiles dans le traitement des fluorescentes et microphotographies DAB pour analyse morphométrique. Ces étapes sont visuellement résumées dans la Figure 2 et Figure 3. L’objectif de ces mesures est de créer une image représentative de binaire et squelette qui modélise correctement la photomicrographie original telles que les données recueillies sont valides. Après l’application du protocole, le plugin AnalyzeSkeleton génère une image squelette marquée dont le nombre de points de terminaison et branche (i.e., processus) lengthcan être résumé à partir des fichiers de sortie qui en résulte. Points de terminaison et traiter les données de longueur sont ensuite utilisées pour estimer l’étendue de la ramification des microglies dans la photomicrographie ou le retour sur investissement. Figure 4 résume les données qui en résulte (points de terminaison/cellule et processus longueur/cellule) recueillies avec et sans l’application du protocole. Alors que des tendances similaires existent, les données résumées dans la Figure 4F sont moins variables que celles de la Figure 4E. En outre, ces données montrent une sensibilité accrue pour détecter les différences entre les groupes lorsque le protocole est appliqué. Enfin, les soins doivent être prises concernant la variabilité inter-utilisateur dans l’application du protocole. Ces différences sont résumées par la Figure 5 où le même ensemble de données a été analysé par deux utilisateurs indépendants selon un protocole identique résumées ci-dessus.
Morphologie supplémentaires données proviennent de cellules individuelles isolées à partir des images binaires créés lors de l’application du protocole. Les étapes du protocole pour analyser la morphologie des microglies avant et en utilisant le plugin FracLac sont résumées dans la Figure 6. Nous illustrons cette analyse dans les deux blessés (Figure 6 a) et blessé des tissus (Figure 6 b). Images représentatives du binaire, décrite, convexe coque/encapsulation cercle et case comptage des exemples pour chaque cellule analysée avec et sans le protocole application sont indiquées dans la Figure 6–F. Ces images aident à illustrer les origines des différences dans les données de morphologie qui sont résumées dans la Figure 6.
<img alt="Schéma de traçage neuronal ; soma circulaire ou d’origine unique ; superposition fluorescente ; Cartographie des réseaux neuronaux." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Illustrations des microglies squelette avec un circulaire soma (sous-optimal) versus un soma de même origine (optimal) et la superposition correspondante entre la cellule de squelette et la photomicrographie original. Echelle = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Étapes de traitement de l’image : microscopie de l’original au squelette étiqueté, y compris les niveaux de gris, le despkle, le binaire." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Protocole d’application de microphotographies fluorescents. Illustrations du protocole squelette analyse appliqué à une microphotographie fluorescente avec une seule cellule recadrée pour afficher les détails. Echelle = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Séquence de traitement d’images pour l’analyse de la structure neuronale ; filtre FFT ; niveaux de gris ; schéma squelette." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Application du protocole de lumineux-zone DAB photomicrographies. Illustrations du protocole squelette analyse appliqué à une microphotographie DAB lumineux-zone avec une seule cellule recadrée pour afficher les détails. Echelle = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Analyse des processus neuronaux ; Images de microscopie, comparaison de protocoles, graphique montrant les points d’évaluation/cellule." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Analyse des données avec et sans l’application du protocole. (A) une microphotographie exemple d’IHC fluorescent et recadrée cellule correspondant à la boîte jaune (B). Images de binaire et squelettisés exemple avec (C) et sans (D), le protocole appliqué comme décrit. Données sommaires de microglie points de terminaison/cellule et processus longueur/cellule dans indemnes (blanc) et blessé le tissu cortical (gris) avec (E) et sans (F) le protocole appliqué. Analyse statistique au moyen de l’élève test t et n = 3, ** dénote p &lt; 0,01. Echelle = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig4large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Analyse de la morphologie des neurones ; traitement d’images et graphes de données ; binaire, diagrammes squelettes, résultats statistiques." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Différences d’utilisateur associé à l’application du protocole. Un exemple d’une conversion image et protocole original d’images binaires et squelettes par utilisateur 1 et utilisateur 2. Différences entre les deux images sont mises en évidence avec des cercles colorés. Graphiques sommaires des microglies points de terminaison/cellule et processus des données longueur/cellule dans des régions de cerveau blessé et blessé par utilisateur 1 et utilisateur 2. Analyse statistique ANOVA et échantillon taille est n = 3 ; p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001. Echelle = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig5large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Analyse des lésions neuronales avec comparaison morphologique ; Effet de l’application du protocole sur la microglie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figure 6. Analyse fractale avec et sans l’application du protocole. Exemple de recadrée photomicrographies des microglies dans le blessé (A) et blessé (B) cortex avec binaire correspondant (C) et des images de contour (D) qui entraînent avec et sans le protocole appliqué. L’enveloppe convexe associé (bleu) et en joignant le cercle (rose) pour les formes de contour correspondant (E) sont utilisés pour calculer la densité de la forme, span ratio et circularité (G). La zone de comptage méthode est illustrée en (F) et utilisée pour la dimension fractale (D,B) et lacunarité (λ) calculs (G). Echelle = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig6large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Les microglies sont des cellules immunitaires du cerveau qui enquête et réagissent à la physiologie du cerveau altéré par des modifications morphologiques qui peuvent être évalués quantitativement. Ce protocole décrit un ImageJ base protocole d’analyse pour représenter la microglie morphologie comme continue des données selon des indicateurs tels que la ramification de la cellule, la complexité et la forme.

Quantifier les cellules microgliales morphologie de microphotographies d’immunohistochimie préparé des tissus à l’aide de ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

L’objectif global de ces méthodes d’analyse du squelette et des fractales est de mesurer la morphologie de la microglie à partir de tissus préparés par l’IHC, en utilisant des méthodes quantitatives à la fois à haut débit et sensibles à la détection de petites différences dans les formes cellulaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine neuroinflammatoire, en définissant les nuances de la forme et de la fonction de la microglie au cours de la santé et de la maladie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle quantifie la morphologie de la microglie à l’aide de variables continues plutôt que catégorielles.Les méthodes décrites ici ne nécessitent pas de logiciel propriétaire et peuvent être utilisées pour le dépistage de régions cérébrales ou une analyse cellule par cellule. Kimberly Young, une technicienne de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Avant de commencer, assurez-vous que le plug-in AnalayzeSkeleton a été téléchargé sur ImageJ ou Fiji.Ouvrez ensuite une pile Z de 30 microns montrant un cerveau immunomarqué d’Iba1. Si vous utilisez une photomicrographie à fluorescence, assurez-vous que l’image est de 8 bits et convertissez-la en niveaux de gris pour mieux visualiser toutes les taches positives. Utilisez la barre d’outils et cliquez sur Image, Tables de correspondance, Gris.Si vous utilisez une photo DAB en champ clair, utilisez d’abord le plug-in de filtre passe-bande FFT avec les paramètres par défaut. Cliquez sur Traiter, FFT, Filtre passe-bande, puis convertir en niveaux de gris. Si l’image est trop sombre pour visualiser le processus de la microglie, utilisez la barre d’outils et cliquez sur Image, Ajuster, Luminosité/Contraste.Ajustez les curseurs minimum ou maximum selon vos besoins, jusqu’aux bords de l’histogramme, mais pas plus. Le réglage de la luminosité produit le plus de variabilité dans l’analyse des données et constitue donc l’étape la plus critique. Ensuite, exécutez un filtre Masque flou pour augmenter encore le contraste, en cliquant sur Traiter, Filtres, Masque flou.Effectuez une étape de désaffûtage pour éliminer le bruit de sel et de poivre généré par le masque flou. Utilisez la barre d’outils et cliquez sur Traiter, Bruit, Désormoucher. Convertissez l’image en binaire en sélectionnant Image, Ajuster, Seuil.Appliquez ensuite la fonction Despeckle à l’image binaire pour supprimer tout bruit d’un seul pixel restant. Appliquez ensuite la fonction Fermer en cliquant sur Traiter, Binaire, Fermer, pour connecter les pixels sombres séparés par un maximum de deux pixels. Ensuite, supprimez les valeurs aberrantes en cliquant sur Traiter, Bruit, Supprimer les valeurs aberrantes.Après avoir enregistré l’image en tant que fichier séparé pour une utilisation ultérieure, squelettez l’image à l’aide de la barre d’outils, en cliquant sur Traiter, Binaire, Squeletter. Sélectionnez l’image squelettée et exécutez le plug-in AnalyzeSkeleton en cliquant sur Plug-ins, Squelette, Analyser le squelette et en cochant la case d’informations sur la branche. Copiez les données des résultats et des informations de branche, puis collez-les dans une feuille de calcul Excel.Dans Excel, réduisez les données pour supprimer les fragments de squelette résultant de l’IHC et de l’acquisition d’images. Déterminez la longueur des fragments à supprimer de l’ensemble de données en ouvrant l’image squelettée dans ImageJ et en sélectionnant l’outil Ligne. Mesurez plusieurs fragments, en tenant compte de la longueur moyenne, et décidez d’une valeur limite, qui doit être cohérente dans tout l’ensemble de données.Triez la feuille de calcul Excel en cliquant sur Trier et filtrer, Tri personnalisé. Triez par voxels d’extrémité, du plus grand au plus petit, et dans un nouveau niveau, par branche Mx PT du plus grand au plus petit. Supprimez toutes les rangées qui contiennent deux extrémités dont la longueur maximale de branche est inférieure à la valeur limite.Additionnez les données de la colonne des points de terminaison pour calculer le nombre total de points de terminaison collectés à partir de l’image. Répétez l’opération pour les données d’informations sur les branches après le tri par longueur de branche. Une fois que toutes les données ont été coupées et additionnées, divisez les données de chaque image par le nombre de microglies somas dans l’image correspondante.Entrez le point final et la longueur de cellule et de branche par cellule dans le logiciel statistique. Assurez-vous que le plugin FracLac a été téléchargé. Utilisez ensuite l’outil rectangle pour dessiner le retour sur investissement.Assurez-vous que la zone est suffisamment grande pour capturer l’intégralité de la cellule et qu’elle peut rester cohérente dans l’ensemble du jeu de données. Dans la fenêtre du Gestionnaire de retour sur investissement, sélectionnez Mettre à jour pour verrouiller le retour sur une cellule sélectionnée au hasard dans la photomicrographie. Ouvrez l’image binaire contenant la cellule sélectionnée.Double-cliquez sur l’outil Pinceau, réglez la couleur sur noir et ajustez la largeur du pinceau si nécessaire. En utilisant la photomicrographie correspondante comme référence, utilisez le pinceau pour supprimer les processus cellulaires adjacents, connecter les processus fragmentés et isoler la cellule d’intérêt. Une fois la cellule binaire isolée, enregistrez le fichier binaire.Convertissez la cellule binaire en plan à l’aide de la barre d’outils, via Process, Binary, Outline. Dans la barre d’outils, ouvrez FracLac à l’aide de la barre d’outils, en cliquant sur Plugins, Fractal Analysis, FracLac, et sélectionnez BC pour le comptage de boîtes. Dans Grid Design, définissez Num G sur quatre.Sous Options graphiques, cochez la case des mesures pour analyser l’enveloppe convexe et le cercle englobant de la cellule. Lorsque vous avez terminé, sélectionnez OK, puis sélectionnez le bouton Scanner pour exécuter un balayage de comptage de cases sur l’image sélectionnée. Dans la fenêtre Résultats de la coque et du cercle, copiez tous les résultats de données souhaités.Faites ensuite de même dans la fenêtre Résumé du nombre de boîtes. Transférez les données copiées dans un fichier Excel ou un logiciel de statistiques. Ce graphique présente des données récapitulatives des paramètres de la microglie par cellule et de la longueur traitée par cellule dans le tissu cortical non blessé et blessé.C’est le résultat de l’analyse avec le protocole appliqué. Dans les deux cas, l’analyse statistique a été effectuée à l’aide du test T de Students et trois images ont été analysées. Il faut faire attention à la variabilité inter-utilisateurs dans l’application du protocole.Ces différences sont résumées ici, où le même ensemble de données a été analysé par deux utilisateurs indépendants appliquant un protocole identique. Bien que les tendances soient similaires partout, la variabilité entre les utilisateurs influe sur l’importance des données. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que l’objectif est d’obtenir un modèle de squelette ou de contour représentatif de la photomicrographie d’origine.Cela signifie que les étapes peuvent être modifiables en fonction des besoins spécifiques de l’enquêteur. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier rapidement la morphologie de la microglie à partir de photomicrographies de tissus d’immunohistochimie à l’aide d’un logiciel informatique facilement disponible.

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Source : Etienne, F. et al. Imagerie à deux photons de l’attraction des processus microgliaux vers l’ATP ou la sérotonine dans les tranches de cerveau aiguës. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo démontre l’utilisation de la microscopie à deux photons pour étudier l’attraction des processus microgliaux vers un composé injecté dans des tranches de cerveau. Il donne un aperçu de la préparation de coupes de cerveau de souris, de l’injection d’un composé d’essai de chimioattractant et de l’imagerie de...

Microscopie à deux photons pour l’étude de l’attraction du processus microglial vers un composé dans une tranche de cerveau de souris

Une façon d’obtenir de nouvelles connaissances sur la complexité de la réponse inflammatoire cérébrale est présentée. Nous décrivons des protocoles basés sur l’immunofluorescence suivis d’une analyse confocale tridimensionnelle pour étudier le modèle de co-expression des marqueurs phénotypiques microglie/macrophage dans un modèle murin d’ischémie focale.

Trois dimensions d&#39;analyse confocale de marqueurs microglies / macrophages de polarisation dans Experimental Brain Injury

Les microglies sont les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central (SNC) avec une grande capacité à phagocyter ou engloutir matériau dans leur environnement extracellulaire. Ici, un test largement applicable, fiable et hautement quantitative pour la visualisation et la mesure de l'engloutissement de la microglie médiation de composants synaptiques est décrite.

Un enlisement test: Un protocole pour évaluer les interactions entre les neurones du système nerveux central et les phagocytes

activation de cellules microgliales et microgliose sont des réponses clés à la neurodégénérescence chronique. Ici, nous présentons les méthodes pour in vivo, la visualisation à long terme de la rétine CX3CR1-GFP + cellules microgliales par ophtalmoscopie confocale, et pour le seuil et analyses morphométriques d'identifier et de quantifier leur activation. Nous surveillons changements microgliales durant les premiers stades de glaucome liée à l'âge.

En Vivo Dynamique de la rétine microglial activation cours neurodégénérescence: confocale ophtalmoscopique Imaging and Cell Morphometry dans Souris glaucome

Deux algorithmes d'analyse d'images, « drosophile NMJ Morphométrie » et « drosophile NMJ Bouton Morphométrie » ont été créés, pour quantifier automatiquement neuf caractéristiques morphologiques de la jonction neuromusculaire drosophile (NMJ).

Deux algorithmes pour Quantification haut débit et multi-paramétrique de<em&gt; drosophile</em&gt; Junction neuromusculaires Morphology

Ce protocole a été développé pour identifier quantitativement les composants de micro-environnement de la tumeur dans les résections du patient au glioblastome utilisant l'immunohistochimie chromogène et ImageJ.

Immunohistochimie quantitatif du microenvironnement cellulaire dans les résections du glioblastome du patient

Ce protocole décrit un workflow étape par étape pour la costaining immunofluorescente d'IBA1 et de TMEM119, en plus de l'analyse de la densité, de la distribution et de la morphologie microgliales, aussi bien que l'infiltration périphérique de cellules myéloïdes dans le tissu de cerveau de souris.

Cellule d'immunofluorescence utilisant IBA1 et TMEM119 pour la densité microgliale, la morphologie et l'analyse périphérique d'infiltration de cellules myéloïdes dans le cerveau de souris

Nous présentons une méthode qui utilise une approche d’analyse d’image généraliste basée sur des zones pour identifier le nombre de cellules. L’analyse de différentes populations cellulaires a exploité les différences significatives de hauteur et de structure cellulaires entre les différents types de cellules au sein d’un algorithme adaptatif.

Algorithme d’analyse d’image basé sur la zone pour la quantification des cocultures macrophages-fibroblastes

Ce protocole décrit le processus de différenciation des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) en cellules de type microglie pour l’expérimentation in vitro . Nous incluons également une procédure détaillée pour générer des synaptosomes humains à partir de motoneurones inférieurs dérivés de l’iPSC qui peuvent être utilisés comme substrat pour des tests de phagocytose in vitro utilisant des systèmes d’imagerie de cellules vivantes.

Cellules humaines de type microglie : différenciation à partir de cellules souches pluripotentes induites et dosage in vitro de la phagocytose sur cellules vivantes à l’aide de synaptosomes humains

La naissance prématurée (accouchement &lt; 37 semaines) est un problème de santé mondial urgent, avec des options de prévention et de traitement sous-optimales. Nous présentons un modèle murin d’accouchement prématuré induit par une infection bactérienne vaginale ascendante et décrivons comment analyser la morbidité et la mortalité néonatales qui en résultent.

Modélisation de l’infection vaginale ascendante, de l’accouchement prématuré et de la morbidité néonatale chez la souris

Le logiciel de cartographie des paramètres microgliales (MMPS) est un pipeline d’analyse convivial qui ne nécessite aucune expertise en codage et qui automatise semi-automatisé l’analyse de morphologie microgliale unicellulaire à partir d’images d’immunofluorescence. Validé dans un modèle de neuroinflammation induit par des lipopolysaccharides de rongeurs, le MMPS détecte de manière reproductible les changements morphologiques associés à l’activation et permet un phénotypage microglial...

Logiciel de cartographie des paramètres microgliales (MMPS) : un outil open source et convivial pour l’analyse quantitative de la morphologie de la microglie

Découvrez une méthode de quantification de la morphologie des microglies à partir de tissus cérébraux préparés en immunohistochimie à l'aide d'ImageJ. Cette technique haut débit utilise l'analyse squelettique et fractale pour étudier les variations de forme cellulaire liées aux états neuro-inflammatoires.

Quantifier les cellules microgliales morphologie de microphotographies d’immunohistochimie préparé des tissus à l’aide de ImageJ (Vidéo) | JoVE Journal

Quantifier les cellules microgliales morphologie de microphotographies d’immunohistochimie préparé des tissus à l’aide de ImageJ

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