Quantifier les cellules microgliales morphologie de microphotographies d’immunohistochimie préparé des tissus à l’aide de ImageJ

L’objectif global de ces méthodes d’analyse du squelette et des fractales est de mesurer la morphologie de la microglie à partir de tissus préparés par l’IHC, en utilisant des méthodes quantitatives à la fois à haut débit et sensibles à la détection de petites différences dans les formes cellulaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine neuroinflammatoire, en définissant les nuances de la forme et de la fonction de la microglie au cours de la santé et de la maladie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle quantifie la morphologie de la microglie à l’aide de variables continues plutôt que catégorielles.

Les méthodes décrites ici ne nécessitent pas de logiciel propriétaire et peuvent être utilisées pour le dépistage de régions cérébrales ou une analyse cellule par cellule. Kimberly Young, une technicienne de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Avant de commencer, assurez-vous que le plug-in AnalayzeSkeleton a été téléchargé sur ImageJ ou Fiji.

Ouvrez ensuite une pile Z de 30 microns montrant un cerveau immunomarqué d’Iba1. Si vous utilisez une photomicrographie à fluorescence, assurez-vous que l’image est de 8 bits et convertissez-la en niveaux de gris pour mieux visualiser toutes les taches positives. Utilisez la barre d’outils et cliquez sur Image, Tables de correspondance, Gris.

Si vous utilisez une photo DAB en champ clair, utilisez d’abord le plug-in de filtre passe-bande FFT avec les paramètres par défaut. Cliquez sur Traiter, FFT, Filtre passe-bande, puis convertir en niveaux de gris. Si l’image est trop sombre pour visualiser le processus de la microglie, utilisez la barre d’outils et cliquez sur Image, Ajuster, Luminosité/Contraste.

Ajustez les curseurs minimum ou maximum selon vos besoins, jusqu’aux bords de l’histogramme, mais pas plus. Le réglage de la luminosité produit le plus de variabilité dans l’analyse des données et constitue donc l’étape la plus critique. Ensuite, exécutez un filtre Masque flou pour augmenter encore le contraste, en cliquant sur Traiter, Filtres, Masque flou.

Effectuez une étape de désaffûtage pour éliminer le bruit de sel et de poivre généré par le masque flou. Utilisez la barre d’outils et cliquez sur Traiter, Bruit, Désormoucher. Convertissez l’image en binaire en sélectionnant Image, Ajuster, Seuil.

Appliquez ensuite la fonction Despeckle à l’image binaire pour supprimer tout bruit d’un seul pixel restant. Appliquez ensuite la fonction Fermer en cliquant sur Traiter, Binaire, Fermer, pour connecter les pixels sombres séparés par un maximum de deux pixels. Ensuite, supprimez les valeurs aberrantes en cliquant sur Traiter, Bruit, Supprimer les valeurs aberrantes.

Après avoir enregistré l’image en tant que fichier séparé pour une utilisation ultérieure, squelettez l’image à l’aide de la barre d’outils, en cliquant sur Traiter, Binaire, Squeletter. Sélectionnez l’image squelettée et exécutez le plug-in AnalyzeSkeleton en cliquant sur Plug-ins, Squelette, Analyser le squelette et en cochant la case d’informations sur la branche. Copiez les données des résultats et des informations de branche, puis collez-les dans une feuille de calcul Excel.

Dans Excel, réduisez les données pour supprimer les fragments de squelette résultant de l’IHC et de l’acquisition d’images. Déterminez la longueur des fragments à supprimer de l’ensemble de données en ouvrant l’image squelettée dans ImageJ et en sélectionnant l’outil Ligne. Mesurez plusieurs fragments, en tenant compte de la longueur moyenne, et décidez d’une valeur limite, qui doit être cohérente dans tout l’ensemble de données.

Triez la feuille de calcul Excel en cliquant sur Trier et filtrer, Tri personnalisé. Triez par voxels d’extrémité, du plus grand au plus petit, et dans un nouveau niveau, par branche Mx PT du plus grand au plus petit. Supprimez toutes les rangées qui contiennent deux extrémités dont la longueur maximale de branche est inférieure à la valeur limite.

Additionnez les données de la colonne des points de terminaison pour calculer le nombre total de points de terminaison collectés à partir de l’image. Répétez l’opération pour les données d’informations sur les branches après le tri par longueur de branche. Une fois que toutes les données ont été coupées et additionnées, divisez les données de chaque image par le nombre de microglies somas dans l’image correspondante.

Entrez le point final et la longueur de cellule et de branche par cellule dans le logiciel statistique. Assurez-vous que le plugin FracLac a été téléchargé. Utilisez ensuite l’outil rectangle pour dessiner le retour sur investissement.

Assurez-vous que la zone est suffisamment grande pour capturer l’intégralité de la cellule et qu’elle peut rester cohérente dans l’ensemble du jeu de données. Dans la fenêtre du Gestionnaire de retour sur investissement, sélectionnez Mettre à jour pour verrouiller le retour sur une cellule sélectionnée au hasard dans la photomicrographie. Ouvrez l’image binaire contenant la cellule sélectionnée.

Double-cliquez sur l’outil Pinceau, réglez la couleur sur noir et ajustez la largeur du pinceau si nécessaire. En utilisant la photomicrographie correspondante comme référence, utilisez le pinceau pour supprimer les processus cellulaires adjacents, connecter les processus fragmentés et isoler la cellule d’intérêt. Une fois la cellule binaire isolée, enregistrez le fichier binaire.

Convertissez la cellule binaire en plan à l’aide de la barre d’outils, via Process, Binary, Outline. Dans la barre d’outils, ouvrez FracLac à l’aide de la barre d’outils, en cliquant sur Plugins, Fractal Analysis, FracLac, et sélectionnez BC pour le comptage de boîtes. Dans Grid Design, définissez Num G sur quatre.

Sous Options graphiques, cochez la case des mesures pour analyser l’enveloppe convexe et le cercle englobant de la cellule. Lorsque vous avez terminé, sélectionnez OK, puis sélectionnez le bouton Scanner pour exécuter un balayage de comptage de cases sur l’image sélectionnée. Dans la fenêtre Résultats de la coque et du cercle, copiez tous les résultats de données souhaités.

Faites ensuite de même dans la fenêtre Résumé du nombre de boîtes. Transférez les données copiées dans un fichier Excel ou un logiciel de statistiques. Ce graphique présente des données récapitulatives des paramètres de la microglie par cellule et de la longueur traitée par cellule dans le tissu cortical non blessé et blessé

C’est le résultat de l’analyse avec le protocole appliqué. Dans les deux cas, l’analyse statistique a été effectuée à l’aide du test T de Students et trois images ont été analysées. Il faut faire attention à la variabilité inter-utilisateurs dans l’application du protocole.

Ces différences sont résumées ici, où le même ensemble de données a été analysé par deux utilisateurs indépendants appliquant un protocole identique. Bien que les tendances soient similaires partout, la variabilité entre les utilisateurs influe sur l’importance des données. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que l’objectif est d’obtenir un modèle de squelette ou de contour représentatif de la photomicrographie d’origine.

Cela signifie que les étapes peuvent être modifiables en fonction des besoins spécifiques de l’enquêteur. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier rapidement la morphologie de la microglie à partir de photomicrographies de tissus d’immunohistochimie à l’aide d’un logiciel informatique facilement disponible.