Procédure et des stratégies d’optimisation clés pour un procédé de dosage immunologique axée sur électrophorèse capillaire automatisée

Un test immunologique capillaire-basé utilisant une plate-forme commerciale pour mesurer les protéines cibles des préparations de protéines totales est démontré. En outre, les paramètres de dosage des temps d’exposition et la concentration de protéines et l’affaiblissement de l’anticorps sont optimisés pour un système de modèle de culture cellulaire.

L’objectif global de cette procédure est de démontrer un dosage immunologique par électrophorèse capillaire à l’aide d’une plateforme commerciale. Cette plateforme permettra de distinguer et de quantifier des cibles protéiques à partir d’un échantillon biologique pouvant provenir de tissus de culture cellulaire et de biofluides. Le processus examine les protéines en fonction de leur taille qui varie de deux à 440 kilodaltons.

L’avantage de cette procédure automatisée par rapport aux procédures traditionnelles, comme le Western blot, est que les dosages immunophorétiques capillaires éliminent le besoin de gels, de dispositifs de transfert et de lavages manuels. De plus, la quantité absolue de protéines requise est environ 10 fois inférieure, ce qui rend la procédure idéale pour les types de cellules rares ou les échantillons limités. De plus, les résultats sont obtenus en aussi peu que trois heures à l’aide de systèmes automatisés et se sont révélés plus quantitatifs et reproductibles que les procédures conventionnelles de transfert Western.

Préparez les échantillons et les réactifs du kit, y compris le tampon d’échantillons, le dithiothréitol, le mélange maître fluorescent et l’échelle biotinylée, conformément à la notice du fabricant. Préparez les échantillons de protéines en utilisant votre méthode préférée. Ici, nous avons isolé un extrait de cellule entière à partir de cultures cellulaires BEAS-2B.

Diluez les échantillons de protéines avec un tampon d’échantillon. Mélangez une partie de mélange maître fluorescent cinq fois avec quatre parties d’échantillon dilué pour obtenir la concentration finale de protéines souhaitée. Un exemple de calcul est montré pour faire 70 microlitres de 0,2 microgramme par microlitre de concentration finale de protéines en commençant par une concentration de stock de protéines de 1,2 microgrammes par microlitre.

Le Master Mix représente 1/5 du volume total, dans ce cas, 14 microlitres. Pour calculer le volume de stock de protéines nécessaire, multipliez la concentration finale souhaitée par le volume total et divisez par la concentration de stock de protéines. Soustrayez les volumes de mélange maître et de brut du volume total pour calculer le volume de tampon d’échantillon.

Dénaturez les échantillons préparés et l’échelle en chauffant à 95 degrés centigrades pendant cinq minutes. Notez que certaines protéines peuvent nécessiter des conditions de dénaturation plus douces. Par exemple, 70 degrés pendant 10 minutes pour éviter l’agrégation des protéines et améliorer la migration.

Envisagez cette option s’il y a un étalement important aux poids moléculaires les plus élevés. Préparez les dilutions d’anticorps souhaitées dans le diluant fourni. Notez que les anticorps sont généralement utilisés à des concentrations plus élevées pour l’immunodosage capillaire que pour le western blot traditionnel.

Préparez un mélange individuel de luminol et de peroxyde frais à chaque utilisation. Pipeter les échantillons et les réactifs dans la plaque de dosage en utilisant les volumes indiqués dans le modèle. Le codage couleur représente le bon chargement des réactifs et des échantillons sur la plaque de dosage.

Pipette échelle biotinylée vers le puits A1, échantillons préparés vers les puits A2 à A25. Le diluant d’anticorps fourni aux puits B1 à B25 et au puits C1. Anticorps primaire contre les puits C2 à C25. Streptavidine HRP au puits D1. Anticorps secondaire dirigé contre les puits D2 à D25.

Et mélange de luminol-peroxyde aux puits E1 à E25. Ajoutez un tampon de lavage aux trois premières rangées des plus grands puits de la plaque médiane. Allumez l’instrument d’immunodosage capillaire et ouvrez le logiciel qui l’accompagne.

Chargez la cartouche capillaire et la plaque de dosage dans la machine conformément aux instructions du fabricant et démarrez le cycle. Une fois le tirage terminé, vérifiez que les étalons fluorescents sont correctement identifiés et corrigez-les si nécessaire. De plus, vérifiez que l’échelle biotinylée présente les pics de taille corrects pour le kit utilisé.

Pour plus de détails, consultez le guide de référence rapide du fabricant ou le manuel du produit. L’optimisation des conditions de dosage telles que le temps d’exposition, la concentration en protéines et la dilution des anticorps est importante pour obtenir des résultats précis et reproductibles. Ces conditions sont spécifiques à chaque combinaison d’anticorps du système modèle et, par conséquent, doivent être déterminées empiriquement pour chaque nouveau test.

La capacité de générer des résultats quantitatifs dépend de l’analyse d’un temps d’exposition auquel le substrat de luminol ne s’épuise pas rapidement, car l’appauvrissement du substrat entraîne une perte de signal ou un épuisement du signal. Cela peut être déterminé en examinant les données à différents temps d’exposition à la chimiluminescence, comme le montre la figure deux. Les expositions avec l’instrument utilisé variaient de cinq à 480 secondes.

Les vues de Lane ont montré une diminution des concentrations de protéines pour les extraits BEAS-2B sondés avec l’anticorps p53 DO-1 à une dilution de un à 500. Les coefficients de signal de chimiluminescence signalés sous forme de hauteurs de crête dans le logiciel de l’instrument sont superposés. Les intensités des bandes visuelles sont automatiquement ajustées par l’instrument et ne sont pas comparables d’un panneau à l’autre.

Le coefficient du signal diminue avec des expositions séquentiellement plus longues si le luminol s’épuise, comme on le voit ici. Le signal commence à disparaître et le pic se divise aux deux expositions les plus longues. Pour cette raison, un temps d’exposition court de 15 secondes a été choisi pour l’analyse des données.

L’apport total en protéines doit également être optimisé pour chaque test et système modèle. Pour l’évaluation quantitative, les mesures doivent être prises dans la plage dynamique linéaire de chaque essai. Où les changements de signal, mesurés par l’aire du pic, sont proportionnels aux changements dans la quantité de protéines dans l’échantillon.

Le titrage du lysat montre les vues de voie du lysat BEAS-2B lorsqu’il est sondé avec un anticorps contre 500 p53 DO-1 ou un contre 50 contre l’alpha-tubuline. L’analyse de régression linéaire confirme que les tests sont linéaires sur toute la plage testée. Les concentrations totales de protéines au milieu de la plage linéaire ont été choisies pour tenir compte de la variation potentielle des protéines cibles dans les deux sens.

Comme dernière considération d’optimisation, une dilution appropriée des anticorps primaires doit être évaluée. L’utilisation d’anticorps à des concentrations de suture permet de s’assurer que tout changement de signal mesuré est dû uniquement à des changements dans la quantité de protéines. Deux échantillons de protéines BEAS-2B, représentés par les points bleus et oranges, ont été sondés avec un anticorps alpha-tubuline dilué en série.

Le signal de chimiluminescence, mesuré en tant que surface de pic, a été tracé en fonction de la dilution des anticorps. Une saturation a été observée près de la dilution de un à 50, où la courbe commence un plateau notable. Un à 50 a donc été choisi comme dilution optimale pour cet anticorps.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez vous sentir à l’aise pour préparer des échantillons, charger des échantillons et exécuter des analyses sur l’instrument d’immunodosage capillaire ProteinSimple Wes. Une fois que vous maîtrisez cette procédure, l’ensemble du cycle peut être effectué en trois heures avec 25 échantillons. Lors de l’analyse d’un cycle, il est important d’effectuer un contrôle de qualité pour chaque capillaire et échantillon.

Cela comprend la vérification des normes fluorescentes dans une échelle biotinylée. Si les pics sont mal identifiés, le logiciel d’analyse doit être utilisé pour identifier principalement les pics corrects et éliminer les pics mal identifiés. Comme pour toutes les techniques de biologie moléculaire en laboratoire, portez un équipement de protection individuelle approprié pour vous protéger et protéger vos échantillons.

Cela comprend une blouse de laboratoire, des gants, des lunettes de sécurité et des chaussures fermées. Il est important de garder à l’esprit que l’optimisation doit être effectuée pour chaque nouvelle cible mesurée ou lorsque différentes sources d’échantillonnage sont utilisées. Les étapes de validation et de suivi comprennent l’évaluation de la spécificité et du signal des anticorps à l’aide d’une protéine ou d’un épitope purifié.

Tester la plage dynamique du test à l’aide d’une série de dilutions de l’échantillon et optimiser la dilution des anticorps en évaluant la saturation du signal sur une plage de concentration d’anticorps. Une fois optimisée, cette procédure d’immunothérapie capillaire devrait fournir une méthode plus rapide et plus quantitative de mesure des protéines cibles des échantillons biologiques par rapport aux méthodes traditionnelles telles que le Western blot.