Modèles expérimentaux pour étudier la neuroprotection du postconditionnement acide contre l'ischémie cérébrale

L’objectif global du traitement de l’acidose dans un modèle de coupe de cortico striatal dans un modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne est d’étudier l’effet neuroprotecteur du post-conditionnement acide contre l’ischémie cérébrale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la façon dont le post-conditionnement de l’acidose peut protéger les lésions cérébrales ischémiques, et à développer une nouvelle stratégie pour le traitement de l’AVC. Le principal avantage de cette technique est de pouvoir utiliser des modèles d’expériences largement disponibles pour étudier la neuroprotection de l’acidose post-conditionnement.

Yarong Zheng, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez par retirer le cerveau du crâne d’une souris décapitée à l’aide d’une spatule fine et déposez-le soigneusement dans un bécher contenant de l’ACSF régulier glacé équilibré avec cinq pour cent de dioxyde de carbone et 95 % d’oxygène. Appliquez de la colle cryoprécipitée sur la plaque vibratone en deux bandes.

Mettez un morceau de trois pour cent d’agarose sur la bande de colle la plus éloignée de la lame pour soutenir le cerveau. Ensuite, utilisez des pinces pour transférer le cerveau sur du papier filtre. Coupez le pôle frontal et le cervelet avec une lame.

Placez le tissu cérébral verticalement sur la bande de colle libre avec le cerveau appuyé contre l’agarose. Ajoutez de l’ACSF glacé dans le réservoir de coupe pour immerger le cerveau et ajoutez de la glace dans la zone du glacier. Gardez l’ACSF dans le réservoir rempli de 5 % de dioxyde de carbone et de 95 % d’oxygène.

Après avoir réglé le vibratone pour couper des sections de 400 microns et positionné correctement le cerveau par rapport à la lame de coupe, appuyez sur le bouton start-stop pour démarrer la coupe automatique. À l’aide d’une pipette Pasteur avec une pointe coupée, transférez cinq tranches de cerveau une par une et placez-les dans le support de tissu dans un ACSF ordinaire glacial, rempli de cinq pour cent de dioxyde de carbone et de 95 % d’oxygène. Après 30 minutes à température ambiante, placez les tranches de cerveau dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant dix minutes pour récupérer la fonction synaptique.

Placez de l’ACSF sans glucose et de l’ACSF acide dans le bain-marie à 37 degrés Celsius et faites bouillir les solutions avec respectivement 5 pour cent de dioxyde de carbone et 95 % d’azote et 20 pour cent de dioxyde de carbone et 80 % d’oxygène pendant 30 minutes. Transférez soigneusement quatre des cinq tranches de cerveau dans un ACSF préchauffé à 37 degrés Celsius, sans glucose, et incubez pendant 15 minutes. Pour étudier la fenêtre temporelle du préconditionnement acide, transférez une tranche directement de l’ACSF sans glucose à l’ACSF acide et transférez les trois autres tranches à l’ACSF ordinaire pour la reperfusion.

Après trois minutes, transférez la tranche d’ACSF acide dans de l’ACSF ordinaire. Ensuite, après cinq minutes dans l’ACSF ordinaire, transférez l’une des tranches de l’ACSF ordinaire dans le support de tissu dans l’ACSF acide pendant trois minutes. Transférez une autre tranche de la même manière 15 minutes après la reperfusion.

La tranche restante qui a été placée dans de l’ACSF sans glucose mais pas dans l’ACSF acide est définie comme le groupe de privation d’oxygène et de glucose. Transférez les tranches de l’ACSF dans les puits d’une plaque à 24 puits contenant une solution de TTC. Étirez la tranche dans la solution.

Ensuite, incubez à 37 degrés Celsius dans un bain d’eau peu profond pendant 30 minutes. Ensuite, transférez les tranches dans des tubes à centrifuger propres et pesés de 1,5 millilitre recouverts d’une feuille d’aluminium et mesurez le poids sec des tranches. Après la pesée, extrayez le Formazan en ajoutant une solution individuelle d’éthanol et de diméthylsulfoxyde dans les tubes à un rapport volume/poids de 10 pour un.

Incuber à l’abri de la lumière pendant 24 heures. Le lendemain, transférez la solution de diméthylsulfoxyde d’éthanol des tubes dans une plaque à 96 puits et mesurez l’absorbance à 490 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaques. Confirmez d’abord la bonne anesthésie par l’absence d’un réflexe de pincement de l’orteil.

Placez ensuite la souris anesthésiée avec la sonde LDF attachée à son crâne en position couchée et fixez-la à l’aide de fils de coton stériles. Désinfectez la peau rasée du cou avec de l’alcool éthylique à 75 %. Ensuite, après avoir fait une incision cutanée périmédiane dans le cou, disséquez les tissus mous avec une pince pour exposer les vaisseaux sanguins.

Ajoutez une goutte de solution saline aux tissus exposés pour les garder hydratés. Ensuite, utilisez une pince ophtalmique pour disséquer l’artère carotide commune des tissus environnants et du nerf vague. Veillez à ne pas endommager le nerf vague.

Placez une pince à micro-vaisseaux à l’extrémité distale de l’artère carotide commune. Et faites un nœud mort avec des sutures en soie 6-0 à l’extrémité proximale. Ensuite, faites un nœud lâche à proximité de la pince comme suture temporaire.

Ensuite, utilisez des ciseaux micro-ophtalmiques pour faire une petite incision longitudinale entre les deux nœuds aussi près que possible du nœud mort. Insérez maintenant un monofilament émoussé de 12 millimètres à travers l’incision dans la lumière de l’artère et avancez-le de quelques millimètres. Serrez le nœud lâche autour de l’extrémité du monofilament, puis retirez la pince.

Ensuite, utilisez une pince ophtalmique pour faire avancer le filament dans l’artère carotide interne jusqu’à ce que le logiciel LDF montre une forte baisse du flux sanguin. Enregistrez l’heure de début de l’occlusion. Ensuite, coupez la sonde LDF et placez la souris dans un incubateur à 30 degrés Celsius pendant la durée d’une heure d’occlusion.

55 minutes après le début de l’occlusion, anesthésier à nouveau l’animal avec de l’isoflurane et positionner l’animal comme avant. Ouvrez ensuite l’incision du cou et réexposez l’artère carotide commune. Après la période d’occlusion, utilisez une pince ophtalmique pour retirer doucement le filament afin d’obtenir une reperfusion.

Transformez ensuite la suture temporaire en une suture permanente en resserrant le nœud. Pour le traitement de l’acidose, changez le gaz inhalé par le cône nasal à 20 % de dioxyde de carbone, 20 % d’oxygène et 60 % d’azote pendant cinq minutes. Après avoir fermé l’incision avec une suture chirurgicale interrompue, placez la souris dans une cage chauffée à 30 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle reprenne conscience.

Cet histogramme montre les résultats du test TTC effectué sur des coupes corticales après privation d’oxygène et de glucose et post-conditionnement acide, comme démontré dans cette vidéo. Trois minutes de traitement de l’acidose étaient neuroprotectrices si le traitement était commencé immédiatement ou cinq minutes après la privation d’oxygène et de glucose, mais pas si les tranches étaient reperfusées pendant 15 minutes. Des souris ont été soumises à 60 minutes d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne et traitées en inhalant 20 % de dioxyde de carbone pendant cinq minutes à cinq, 50 ou 100 minutes après la reperfusion.

Le volume de l’infarctus a été quantifié par deux, trois, cinq colorations au chlorhydrate de triphényltétrazolium 24 heures après la reperfusion, comme l’indiquent les pointillés noirs. Cet histogramme indique le pourcentage de volume d’infarctus pour chaque condition. La neuroprotection contre le post-conditionnement acide était robuste même lorsque le temps d’apparition était retardé à 50 minutes après la reperfusion.

Cependant, le traitement par acidose initié à 100 minutes n’a pas bloqué la lésion ischémique. Après avoir regardé la vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier la neuroprotection de l’acidose postconditionnement sur le modèle OGD de tranches de cerveau et sur le modèle MSO de souris. Lors de la tentative des procédures, il est important de se rappeler que l’extension et la durée de l’acidose sont très importantes pour reproduire les effets protecteurs.