Name: Peptide et protéine Quantification moyen automatisé Immuno-MALDI (iMALDI) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Découvrez la quantification automatisée de peptides et protéines par immuno-MALDI (iMALDI) pour la protéomique quantitative. Cette méthode sensible permet le diagnostic précoce des maladies grâce à l'enrichissement immunitaire des biomarqueurs peu abondants dans les fluides biologiques complexes.

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Nous remercions le soutien financier de Génome Canada et Génome Colombie-Britannique pour les opérations (204PRO) et le développement de la technologie (214PRO) à travers le génome Innovations Network (GIN). Nous remercions la plateforme de découverte de drogue à l’Institut de recherche de la McGill University Health Center pour l’utilisation de l’instrument de MALDI-TOF pour le tournage. H.L. est reconnaissante pour le soutien d’une bourse de recherche postdoctorale de la National Science et génie conseil recherche du Canada (CRSNG). C.H.B est reconnaissante pour le soutien de la pointe Endowment Fund (LEEF). C.H.B. est reconnaissante pour le soutien de la présidence de McGill Segal en oncologie moléculaire à l’Université McGill (Montréal, Québec, Canada). M.X.C. et C.H.B. sont reconnaissants pour le soutien de la Warren Y. Soper Charitable Trust et la Fondation de la famille Alvin Segal à l’hôpital général juif (Montréal, Québec, Canada).

les montants des réactifs décrits ci-dessous sont basés sur la mesure des 20 échantillons de plasma patient. Le protocole présenté ci-dessous suit les directives de l’Université de Victoria &#39; Comité de déontologie de la recherche humaine s.
 1. génération de Ang j’ai dans le Plasma humain <ol><li>décongeler les échantillons de plasma (&#8805; 200 µL) dans une salle l’eau à température de bain pendant 5 min et puis mettre les échantillons sur la glace jusqu'à ce que complètement décongelée.</li>
	<li>Transférer 200 µL de chaque échantillon de plasma manuellement pour séparer les puits d’une plaque de fond de puits de 1,1 mL (plaque d’échantillon) et centrifuger la plaque dans une centrifugeuse pendant 10 min à 2 ° C et 1278 x g.</li>
	<li>Utiliser un liquide automatique, système de manutention en série diluer une solution titrée 500 fmol/µL Ang I NAT pour préparer six calibrateurs avec albumine de blanc d’oeuf de poulet (0.1, 0.2, 0.6, 1,9, 5,7, 17,2 fmol/µL).</li>
	<li>Pipette 200 µL de chaque étalon à un puits et 125 µL de génération tampon plaque échantillon. 
	Remarque : Le chaieb en phosphate tampon tampon salin (PBS) doit être fraîchement préparées le jour de l’expérience.</li>
	<li>à l’aide d’un liquide automatique, système de manutention, dans une nouvelle assiette Mélanger 125 µL du plasma surnageant ou 125 µL de chaieb dans du PBS avec 25 µL d’Ang j’ai tampon de génération, qui contient les Tris, l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 0,2 mM et 1 mM 1 M le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF). 
	NOTE : Préparer l’Ang j’ai tampon génération en mélangeant un tampon aqueux 1 M Tris/0,2 mM EDTA (ajusté à pH 5.5 à l’aide d’acide acétique) et une solution PMSF (100 mM dans le méthanol). Les deux solutions peuvent être conservées jusqu'à 1 mois à 4 solutions de ° C. Mélangez les deux le jour de l’expérience.</li>
	<li>Transférer automatiquement les solutions dans une plaque à 96 puits, 3 répétitions par solution, 34 µL / puits. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 3 h</li>
</ol> 2. Immuno-enrichissement de Ang je revêtus d’anticorps à l’aide de perles <ol><li>conjugaison d’anticorps sur des billes magnétiques de protéines G Remarque : conjugaison de l’anticorps avec les perles est effectuée manuellement pendant les 3 h Ang j’ai des période de génération sur le jour de l’expérience. D’autres analytes, les perles conjugués pourraient être en mesure d’être stocké dans le tampon PBS contenant 0,015 % CHAPS (PBSC) à 4 ° C pendant trois mois ou plus, selon les propriétés et la stabilité de l’anticorps.
	<ol><li>Transfert 110 µL de lisier de perle (assez pour 20 échantillons de mesure et de faire une courbe standard de 6 points) dans un tube de 1,5 mL. Laver les perles sept fois avec 1 mL d’acétonitrile/PBSC de 25 % et trois fois avec 1 mL de PBSC. Utiliser un support magnétique pour granuler les perles entre chaque étape de lavage. Retirer le tampon de lavage après le dernier lavage à. 
		Remarque : Laver 7 fois avec 25 % acétonitrile/PBSC est essentiel pour éliminer les additifs MS incompatible avec du lisier de perle, comme le Tween-20. S’il n’y a pas d’additifs dans les perles sélectionnées, cette étape un lavage n’est peut-être pas nécessaire.</li>
		<li>Remettre en suspension les perles dans 110 µL de PBSC et ajoutez 110 µL d’anti-Ang I anticorps (concentration finale d’anticorps : 100 µg/mL). Mélanger la solution et perles en pipettant également et puis les incuber à température ambiante pendant 1 h, tournant à 8 tr/min.</li>
		<li>Laver les billes 3 fois avec 1 mL de PBSC et resuspendre dans 1100 µL de PBSC. 
		Remarque : Si aucune solution de perle a coulé dans le capuchon du tube pendant l’incubation, tourner vers le bas de la solution à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse à 2680 x g.</li>
		<li>Transférer la solution de perle manuellement dans une plaque à 96 puits (plaque standard perle). Utiliser le liquide automatisé système partie aliquote de manutention des perles sur la même plaque 96 puits, 120 µL par puits.</li></ol></li> <li>Immuno-enrichissement sur les perles <ol><li>après les 3 h Ang période de génération, placer la plaque d’incubation sur glace pendant 10 min mettre fin à la génération d’Ang I.</li>
		<li>Automatiquement diluer la solution mère de SIS peptide (10 pmol/μL) 100 fois avec du PBS de mémoire tampon et en outre automatiquement partie aliquote de la dilution de peptide standard stable isoptope à une plaque PCR 96 puits. Transférer 1,5 µL d’une solution de peptide de normes (SIS) isotopes stables (contenant 100 fmol) dans chaque puits de la plaque d’incubation et mélangez-le avec les échantillons de plasma ou la chaieb dans des tampons de PBS.</li>
		<li>Automatiquement transférer le contenu de la plaque d’incubation dans la solution de perle, 10 mL par puits, mélanger.</li>
		<li>Incuber la plaque à 4 ° C pendant 1 h tout en tournant à 8 tr/min.</li>
		<li>Laver les perles trois fois automatiquement avec la solution de bicarbonate d’ammonium (AmBic) de 5 mM, 100 µL / puits / cycle de lavage. Après le dernier lavage, remettre en suspension les perles dans 7 µL de 5 mM AmBic solution dans chaque puits. Utiliser un aimant pour tirer les billes vers le bas après le dernier lavage à.</li>
	</ol></li></ol> 3. Transfert de perles sur une plaque de mire MALDI et ajout de la Solution de matrice <ol><li>Transfer 7 µL du lisier perle automatiquement sur une plaque de mire MALDI avec une taille de spot de 2 600 µm. Laissez sécher les perles. 
	Remarque : Un petit ventilateur alimenté par USB peut être utilisé pour accélérer le talon du processus de séchage.</li>
	<li>Ajouter automatiquement 2 µL de α-cyano-4-hydroxycinnamique (LCSS)-solution de matrice (contenant 3 mg/mL LCSS, citrate d’ammonium et 1,8 mg/mL, 70 % d’acétonitrile et 0,1 % d’acide trifluoroacétique) de la matrice bien sur chaque échantillon spot sur la plaque cible .</li>
</ol> 4. Acquisition par un MALDI-TOF-MS et l’analyse des données de signaux taches <ol><li>analyser l’échantillon avec un instrument de MALDI-TOF à l’aide de mode réflecteur positive. Effectuer l’étalonnage interne, lissage de données et de la soustraction de référence automatiquement avec le logiciel spécifique au fournisseur. 
	Remarque : Le mode (positif/négatif, linéaire/réflecteur) sélectionné pour mesure de MALDI-TOF dépend de la cible peptides ou des protéines.</li>
	<li>Calculer le taux de réponse relative (ratio d’intensité de Nat/SIS) et la comparer à la courbe d’étalonnage pour déterminer de l’Ang I concentration dans chaque échantillon. Calculer PRA où à l’aide de l’équation (1), Δt Ang je génération représente le temps utilisé pour la génération d’Ang I. 
	PRA = [Ang I] / Δt Ang je génération (1)</li></ol>

<ol><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li>
<li>Nicol, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+Immunoaffinity-Mass+Spectrometry-based+Approach+for+the+Quantification+of+Protein+Biomarkers+from+Serum+Samples+of+Lung+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).</li>
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<li>Anderson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six+decades+searching+for+meaning+in+the+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Six decades searching for meaning in the proteome.</a> J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).</li>
<li>Landegren, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+Sensitive+Plasma+Proteome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).</li>
<li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+Enrichment+and+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Protein+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li>
<li>Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-linked+immuno-mass+spectrometric+assay+with+the+substrate+adenosine+monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocapture+strategies+in+translational+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunocapture strategies in translational proteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).</li>
<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Affinity+Capture+and+On-Tip+Digestion+to+Accurately+Quantitate+in+Vivo+Deamidation+of+Therapeutic+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies.</a> Anal. Chem. , (2016).</li>
<li>Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precision+quantification+of+human+plasma+proteins+using+the+automated+SISCAPA+Immuno-MS+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow.</a> N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).</li>
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<li>Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexed+iMALDI+for+the+detection+of+angiotensin+I+and+angiotensin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II.</a> Methods. 56 (2), 213-222 (2012).</li>
<li>Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+immuno-MALDI+%28iMALDI%29+assay+for+angiotensin+I+and+the+diagnosis+of+secondary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension.</a> Clin. Proteomics. 10 (1), 20(2013).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+immuno+tandem+mass+spectrometry+%28iMALDI%29+assay+for+EGFR+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis.</a> Proteomics Clin Appl. 1, (2007).</li>
<li>Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Immunoaffinity+Tandem+Mass+Spectrometry+%28iMALDI%29+assay+for+Detection+of+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+chimica+acta%22%5BJournal%5D)">An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis.</a> Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).</li>
<li>Popp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+assay+for+the+clinical+measurement+of+plasma+renin+activity+by+immuno-MALDI+%28iMALDI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI).</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).</li>
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<li>Weiß, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+and+measure-mass+spectrometry-based+immunoassays+in+biomarker+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).</li>
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<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+an+aptamer+for+use+as+an+affinity+reagent+with+MS%3A+PCSK9+as+an+example+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein.</a> Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).</li>
</ol>

C.H.B détient le brevet sur la technologie iMALDI.

Par rapport à la quantification des protéines classiques basées sur, iMALDI utilise les anticorps d’enrichir l’analyser et de les purifier des échantillons complexes, rendant donc impossible de quantifier les protéines ou les peptides à de faibles concentrations. Une étape cruciale dans le protocole d’iMALDI est l’immuno-enrichissement des peptides cible. À cette fin, avec une grande spécificité et l’affinité des anticorps doivent être sélectionnés. Dans SISCAPA, on a signalé que des affinités d’anticorps à 10-9</su...

Spectrométrie de masse est devenu un outil indispensable en protéomique quantitative. Spectrométrie de masse permet de déterminer les masses des peptides ou des protéines cibles, donc les signaux analyte obtenus peuvent être très spécifiques par rapport aux tests immunologiques. Deux méthodes d’ionisation electrospray et MALDI, sont plus couramment utilisés pour la détection des protéines et des peptides1,2,3,4. Un défi majeur dans la quantification des protéines basée sur MS réside dans la détection des protéines de faible abondance dans des échantillons complexes à des concentrations ng/mL ou pg/mL en présence de protéines de haute-abondance, et nombreux biomarqueurs protéiques de candidat dans le plasma humain sont au sein de cette gamme5. Ce problème est dû en grande partie par l’intrinsèquement une plage dynamique étendue et la complexité du protéome humain6.
Pour surmonter ces difficultés de détection, les méthodes immuno-SM ont été développés afin d’enrichir les protéines cibles ou des peptides dans les solutions d’échantillon sur une surface solide, suivie d’élution de l’analyser et MS mesure7,8 , 9 , 10. par immuno-enrichissement sans cause, les analytes sont purifiées à partir des échantillons complexes et donc les effets de la suppression des ions d’autres molécules sont réduites au minimum. Parmi les différents supports solides, billes magnétiques sont actuellement plus largement utilisés car ils ont les avantages de la capacité de liaison anticorps élevés et facilité de manipulation. Billes magnétiques avec différentes fonctionnalisation et tailles ont été développés et commercialisés pour des expériences d’immunoprécipitation. A ce jour, immuno-enrichissement sur perles a été interfacé avec ionisation par électrospray (ESI) et MALDI-MS pour la mesure de protéines et de peptides. Dans les normes des isotopes stables et la capture par la technologie anticorps anti-peptide (SISCAPA), les protéines dans les échantillons sont digérées, suivie d’une incubation avec perles revêtus d’anticorps pour immuno-enrichissement. Dans SISCAPA « classique », les peptides proteotypic capturés sont éluées de talons et mesurées par Liquid Chromatography-ESI-MS (LC-MS), ou par perfusion directe ESI-Multiple réaction Monitoring-MS (MRM-ESI-MS)11,12. Immuno-enrichissement amélioré la sensibilité de l’éssai MRM de 3-4 ordres de grandeur, atteignant le rang faible ng/mL13.
Par rapport à electrospray-MS, MALDI-MS est plus rapide et n’implique pas le nettoyage et la rééquilibration des colonnes LC donc il n’y a aucun problème de report et contamination, plus adapté aux études haut débit14. Immuno-MALDI technologie a été développée dans notre laboratoire à combiner immuno-enrichissement avec MALDI-MS pour la quantification sensible et spécifique des peptides et des protéines (basés sur le dosage des peptides proteotypic)15,16 ,,17. Après enrichissement immuno, les perles sont déposés sur une plaque de mire MALDI, la solution de matrice est ajoutée aux billes et la plaque est prête pour l’analyse par un MALDI-TOF-MS après séchage. L’élution des peptides de la perle n’est pas exécutée comme une étape distincte, mais affinité lié aux analytes sont éluées par la solution de matrice MALDI lorsqu’il est ajouté aux spots perle, ce qui simplifie la préparation de l’échantillon et réduisant au minimum la perte de l’échantillon. La technologie iMALDI a été appliquée dans une variété d’applications18,19et récemment a été automatisée et utilisée pour la mesure de l’angiotensine I (Ang je) pour la détermination de l’activité (PRA) rénine plasmatique20. Ce protocole fera la démonstration de la procédure utilisée pour effectuer un test automatique iMALDI. Prendre le dosage de la PRA à titre d’exemple, la inter-journée CVs de moins de 10 % ont été obtenus grâce à l’automatisation, la capacité de mesurer 744 échantillons par jour20.
Le test PRA iMALDI démontré dans ce manuscrit ne nécessite pas de digestion des protéines, comme la molécule cible (Ang I) est un peptide avec un poids moléculaire de 1295.7 Da. Lors d’autres essais où la digestion de protéines est nécessaire et un peptide est utilisé comme substitut pour la protéine intacte, le peptide sélectionné pour iMALDI doit être unique et spécifique à la protéine cible, avec une masse plus de 800 Da alors qu’elle peut être aisément distinguée de la c bruit chimique de la solution de matrice MALDI. Anticorps anti-peptides sont requis pour l’immuno-enrichissement des peptides. Le protocole de test iMALDI PRA de mesure se compose de quatre étapes : 1) génération de Ang j’ai dans le plasma humain ; 2) immuno-enrichissement d’Ang I à l’aide de petites perles revêtus d’anticorps ; 3) transfert de perles à une plaque de mire MALDI et ajout solution de matrice ; et 4) acquisition de signal par une analyse de MALDI-TOF-MS et données20.

<table><tbody><tr><td>Témoin sain Plasma humain</td><td>Biorécupération</td><td>HMPLEDTA2</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate d’ammonium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Citrate d’ammonium dibasique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09833</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS (>=98 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>Albumine du blanc d’œuf de poule (>98 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70990</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de phénylméthanesulfonyle</td><td>Sigma Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85172</td><td>Grade LC-MS</td></tr><tr><td>acétonitrile</td><td>Fluka</td><td>34967</td> Eau <td>de qualité LC-MS</td></tr><tr><td></td><td>Fluka</td><td>39253</td> Acide acétique <td>de qualité LC-MS</td></tr><tr><td></td><td>Fluka</td><td>320099</td><td>de qualité LC-MS</td></tr><tr><td>Tris(hydroxyméthyl)aminométhane</td><td>Roche Diagnostics</td><td>3118169001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G billes magnétiques</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td>2.8 &mu ; m, 30 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-Ang I Anticorps polyclonal de chèvre</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7419</td><td></td></tr><tr><td>Nat et SIS Ang I</td><td>synthétisés à l’Université de Victoria-Genome BC Proteomics Centre</td><td></td><td></td>Système</tr><tr><td>automatisé de manipulation des liquides</td><td>Agilent</td><td>16050-102</td><td>Poste de travail robotique Agilent Bravo</td></tr><tr><td>Aimant Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Aimant Invitrogen DynaMag-2</td></tr><tr><td>Rotateur de tube</td><td>Theromo Scientific</td><td>400110Q</td><td>Rotateur de tube Labquake</td></tr><tr><td>Aimant Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>DynaMag-96 Aimant à jupe latérale</td></tr><tr><td></td><td>Aimant VP Scientific</td><td>771RM-1</td><td>utilisé pour tirer les billes au fond du puits</td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td>Bruker Microflex LRF</td></tr></tbody> instrument</table>

peptide et protéine quantification moyen automatisé immuno-maldi (imaldi)

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Spectrométrie de masse (MS) est une des technologies plus couramment utilisées pour quantifier les protéines dans des échantillons complexes, avec dosage excellente spécificité à la suite de la détection directe du ratio masse à charge de chaque molécule cible. Cependant, protéomique axée sur les MS, comme la plupart des autres techniques analytiques, a un biais de mesure haute-abondance analytes, donc il est difficile d’atteindre les seuils de détection de basse ng/mL ou pg/mL chez des échantillons complexes et c’est la plage de concentration pour beaucoup maladie-les protéines liquides comme le plasma humain. Pour aider à la détection d’analytes de faible abondance, immuno-enrichissement a été intégré dans l’essai de se concentrer et de purifier l’analyte avant MS mesure, améliorer significativement la sensibilité. Dans ce travail, la technologie immuno - Matrix-Assisted Laser désorption-ionisation (iMALDI) est présentée pour la quantification des protéines et des peptides dans les liquides, issue des immuno-enrichissement sur perles, suivie par MALDI-MS mesure sans préalable d’élution. Les anticorps anti-peptides sont fonctionnalisés sur billes magnétiques et incubées avec les échantillons. Après le lavage, les perles sont directement transférées sur une plaque de mire MALDI, et les signaux sont mesurés par un MALDI-temps des instruments de vol (MALDI-TOF) après que la solution de la matrice a été appliquée aux talons. La procédure de préparation d’échantillon est simplifiée par rapport aux autres tests immuno-MS, et la mesure de la MALDI est rapide. La préparation de l’ensemble de l’échantillon est automatisée avec un liquide de système, de la manutention avec la reproductibilité du dosage améliorée et un débit plus élevé. Dans cet article, le test d’iMALDI est utilisé pour déterminer l’angiotensine peptide j’ai (Ang I) concentration dans le plasma, qui est utilisé cliniquement comme indicateur de l’activité rénine plasmatique pour la projection d’hyperaldostéronisme primaire (PA).

Une procédure automatisée d’iMALDI pour mesurer les Ang I est montré dans la Figure 1. Peptides de la cible (peptides endogènes ou peptides de protéines digérées) sont enrichies sur le anti-peptides billes magnétiques, et ensuite les perles sont transférés à une plaque de mire pour la mesure de MALDI. L’ensemble de la procédure est simplifiée par rapport aux autres technologies d’immuno-MS qui nécessitent des mesures supplémentaires de peptide élution. Automa...

Un protocole pour la quantification de la protéine dans les liquides biologiques complexes à l’aide de la technologie automatisée immuno-MALDI (iMALDI) est présenté.

Peptide et protéine Quantification moyen automatisé Immuno-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

L'objectif général de cet essai immuno-MALDI automatisé est de quantifier des peptides et des protéines intactes dans des fluides biologiques complexes de manière précise et sensible. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la protéomique quantitative, telles que la quantification des niveaux protéiques à des fins diagnostiques ou pour surveiller la réponse d'un patient au traitement. L'avantage principal de cette méthode est qu'elle permet de quantifier les niveaux protéiques de façon très sensible et précise à partir d'échantillons complexes.Cette technique permet le diagnostic de maladies à un stade précoce, car l'étape d'immuno-enrichissement du test permet la quantification de biomarqueurs protéiques et peptidiques peu abondants. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'activité de la rénine plasmatique, elle peut également être appliquée à d'autres études liées à des maladies, telles que la quantification de protéines associées au cancer pour le pronostic, le diagnostic et la gestion du traitement. Pour commencer cette procédure, décongeler les échantillons de plasma humain dans un bain d'eau à température ambiante pendant cinq minutes.Ensuite, placer les échantillons sur de la glace jusqu'à décongélation complète. Puis, transférer manuellement 200 microlitres de chaque échantillon de plasma dans des puits séparés d'une plaque profonde de 1,1 millilitre. Centrifuger la plaque pendant 10 minutes à deux degrés Celsius et 3 000 tr/min.Ensuite, utiliser le Bravo pour diluer en série une solution standard de NAT Ang-1 à 500 femtomoles par microlitre afin de préparer six solutions étalons avec de l'albumine de blanc d'œuf de poulet. Après centrifugation, prélever à la pipette 200 microlitres de chaque solution étalon et les transférer dans une cavité, puis ajouter 125 microlitres de tampon de génération dans la plaque d'échantillons. À l'aide d'un système automatisé de manipulation des liquides, mélanger 125 microlitres de surnageant plasmatique ou 125 microlitres de la solution d'albumine de blanc d'œuf de poulet avec 25 microlitres de tampon de génération d'angiotensine I dans une nouvelle plaque profonde de 1,1 millilitre.Maintenant, transférez automatiquement les solutions dans une plaque de 96 puits avec trois réplicats par solution et 34 microlitres de solution par puits. Incubez ensuite la plaque à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Pour la conjugaison de l'anticorps avec les billes de protéine G, transférez d'abord 78 microlitres de la suspension de billes préparée précédemment dans un tube de 1,5 millilitre.Lavez les billes sept fois avec un millilitre de 25 % d'acétonitrile dans du PBSC et trois fois avec un millilitre de PBSC, en utilisant un support magnétique pour former un culot de billes entre chaque lavage. Après le lavage des billes, resuspendez-les dans 110 microlitres de PBSC et ajoutez 110 microlitres d'anticorps anti-angiotensine I. Mélangez les billes et la solution à l’aide d’une pipette.Ensuite, incuber les billes à température ambiante pendant une heure tout en les agitant à huit tr/min. Après cela, laver les billes trois fois avec un millilitre de PBSC. Puis, resuspendre les billes dans 1 100 microlitres de PBSC.Maintenant, transférez manuellement la solution de billes vers une plaque de 96 puits. Ensuite, demandez au système Bravo d’effectuer la distribution des billes dans la même plaque de 96 puits. Après la période de génération de l’angiotensine I de trois heures, placez la plaque d’incubation sur de la glace pendant 10 minutes afin de mettre fin à la génération de l’angiotensine I. Diluez automatiquement une solution mère de peptides standards isotopiques stables 100 fois à l’aide de tampon PBS.En outre, aliquoter automatiquement la dilution du peptide standard isotopique stable dans une plaque PCR de 96 puits. Transférer 10 microlitres de la solution peptidique diluée dans chaque puit de la plaque d'incubation. Mélanger la solution peptidique diluée avec les échantillons de plasma ou la solution d'albumine d'œuf de poule.Ajouter automatiquement les solutions d'échantillon ou d'étalon aux solutions de billes dans la plaque d'incubation et mélanger. Après une heure d'incubation, laver automatiquement les billes trois fois avec une solution de bicarbonate d'ammonium à cinq millimolaire. Utiliser un aimant pour plaquer les billes au fond après chaque lavage.Après le dernier lavage, ajouter 10 microlitres de la solution de bicarbonate d'ammonium dans chaque puits afin de resuspendre les billes. Transférer automatiquement sept microlitres de la suspension de billes sur une plaque cible MALDI avec une taille de spot de 2 600 micromètres. Une fois les billes sèches, ajouter automatiquement deux microlitres de la solution matrice HCCA préparée précédemment, provenant du puits matrice, sur chaque spot d'échantillon de la plaque cible.Ensuite, analyser les points d'échantillon à l'aide d'un instrument MALDI-TOF en mode réflecteur positif. Réaliser l'étalonnage interne, le lissage des données et la soustraction du bruit de fond à l'aide du logiciel spécifique au fabricant. La procédure automatisée iMALDI pour la mesure de l'angiotensine I permet une analyse à haut débit d'un grand nombre d'échantillons, avec un coefficient de variation intra-journalier inférieur à 10 %. Des spectres représentatifs obtenus par la mesure de l'angiotensine I dans des échantillons de plasma humain sont affichés ici.La corrélation des valeurs de PRA provenant de 188 échantillons de patients obtenues avec le test automatisé iMALDI et des valeurs de PRA obtenues à l’aide d’une procédure clinique LC-MS/MS est présentée ici. Les deux méthodes présentent un coefficient de corrélation de 0,98, et la différence entre les pentes pourrait être due à l’utilisation de différents étalons internes ou de différents anticorps. La gamme linéaire du test et la précision du test sont affichées ici.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ cinq heures. Lors de la réalisation de cette procédure, veillez à bien régler l'orientation de la pipette et la vitesse de manipulation du liquide. Après cette procédure, d'autres méthodes peuvent être utilisées pour confirmer un hyperaldostéronisme primaire chez les patients, notamment un test de charge orale en sel ou une perfusion de sérum salé.La technique automatisée iMALDI permet le criblage quantitatif spécifique et précis à haut débit d'échantillons biologiques, y compris des échantillons de patients, pour détecter des protéines ou des peptides liés à une maladie. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser un dosage iMALDI automatisé pour la quantification de protéines et de peptides par spectrométrie de masse. N'oubliez pas que le travail avec des échantillons biologiques, tels que le plasma humain, est extrêmement dangereux, et que les précautions de sécurité nécessaires doivent toujours être prises lors de l'exécution de la procédure.

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Normes des isotopes stables et capture par anticorps anti-peptide (SISCAPA) l'enrichissement affinités couples de peptides avec des isotopes stables de dilution spectrométrie de masse (MRM-MS) pour fournir une mesure quantitative des peptides comme substituts pour leurs protéines respectives. Nous décrivons ici le protocole en utilisant des particules magnétiques dans un format partiellement automatisés.

La quantification des protéines à l&#39;aide d&#39;enrichissement d&#39;immunoaffinité peptide couplé à la spectrométrie de masse

Nous avons développé une technologie basée sur le film de silice mésoporeuse mince pour la récupération sélective des protéines de faible poids moléculaire et des peptides à partir de sérum humain. Les propriétés physico-chimiques de nos puces mésoporeux ont été finement réglé pour fournir un contrôle substantiel dans l'enrichissement peptide et par conséquent le profil du protéome sérique à des fins diagnostiques.

Faible enrichissement moléculaire des protéines de poids sur les films minces de silice mésoporeuse de recherche de biomarqueurs

Stable marquage isotopique des peptides par diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) est une stratégie rapide et peu coûteuse pour la protéomique masse précises la spectrométrie quantitatifs. Ici, nous démontrons une méthode robuste pour la préparation et l'analyse des mélanges de protéines à l'aide de l'approche de Redi qui peut être appliqué à pratiquement n'importe quel type d'échantillon.

Protéomique quantitative à l&#39;aide réductrice diméthylation pour les isotopes stables étiquetage

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Selected Reaction Monitoring spectrométrie de masse pour Absolute quantification des protéines

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Nous décrivons l’utilisation d’immunotransfert quantitative pour valider l’histologie immunofluorescence couplée avec l’analyse de l’image comme un moyen de quantifier une protéine d’intérêt dans les échantillons de tissus fixés au formol, paraffine (FFIP). Nos résultats démontrent l’utilité de l’examen histologique immunofluorescence pour déterminer la quantité relative de biomarqueurs protéines dans des échantillons de biopsie systématique.

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Nous présentons une méthode pour la purification, la détection et l’identification des peptides diGly qui proviennent de protéines ubiquitinées à partir d’échantillons biologiques complexes. La méthode présentée est reproductible, robuste et surpasse les méthodes publiées par rapport au niveau de profondeur de l’analyse ubiquitinome.

Détection des sites d’ubiquitination des protéines par l’enrichissement du peptide et la spectrométrie de masse

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Enrichissement simultané d’affinité de deux modifications post-traductionnelle pour la quantification et la localisation des sites

L’étiquetage isotopique combiné des précurseurs et le marquage isobarique (cPILOT) est une stratégie améliorée de multiplexage d’échantillons qui est capable d’augmenter le nombre d’échantillons qui peuvent être analysés simultanément avec les étiquettes isobariques disponibles. L’incorporation d’une plate-forme robotique a considérablement augmenté le débit expérimental, la reproductibilité et la précision quantitative.

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Nous présentons ici un protocole pour la purification des complexes peptidiques de classe I et de classe II du CMH à partir de lignées cellulaires de souris et d’humains fournissant des données immunopeptidomiques de haute qualité. Le protocole se concentre sur la préparation d’échantillons à l’aide d’anticorps disponibles dans le commerce.

Immunopeptidomique : isolement de peptides associés à la souris et au CMH humain de classe I et II pour l’analyse par spectrométrie de masse

Ici, nous décrivons un flux de travail protéomique pour la caractérisation du protéome de surface cellulaire de différents types de cellules. Ce flux de travail comprend l’enrichissement en protéines de surface cellulaire, la préparation ultérieure des échantillons, l’analyse à l’aide d’une plate-forme LC-MS/MS et le traitement des données avec un logiciel spécialisé.

Flux de travail « Cell Surface Capture » pour la quantification sans marquage du protéome de surface cellulaire

Découvrez la quantification automatisée de peptides et protéines par immuno-MALDI (iMALDI) pour la protéomique quantitative. Cette méthode sensible permet le diagnostic précoce des maladies grâce à l'enrichissement immunitaire des biomarqueurs peu abondants dans les fluides biologiques complexes.

Peptide et protéine Quantification moyen automatisé Immuno-MALDI (iMALDI)

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