Peptide et protéine Quantification moyen automatisé Immuno-MALDI (iMALDI)

L’objectif global de ce test immuno-MALDI automatisé est de quantifier les peptides et les protéines intactes dans des fluides biologiques complexes de manière précise et sensible. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la protéomique quantitative, telles que la quantification des niveaux de protéines pour le diagnostic ou pour le suivi de la réponse d’un patient au traitement. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle peut quantifier les niveaux de protéines de manière très sensible et précise à partir d’échantillons complexes.

Cette technique permet de diagnostiquer les maladies à un stade précoce car l’étape d’immuno-enrichissement du test permet de quantifier les biomarqueurs protéiques et peptidiques peu abondants. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’activité de la rénine plasmatique, elle peut également être appliquée à d’autres études liées à la maladie, telles que la quantification des protéines liées au cancer pour le pronostic, le diagnostic et la gestion du traitement. Pour commencer cette procédure, décongelez des échantillons de plasma humain dans un bain-marie à température ambiante pendant cinq minutes.

Ensuite, placez les échantillons sur de la glace jusqu’à ce qu’ils soient complètement décongelés. Ensuite, transférez manuellement 200 microlitres de chaque échantillon de plasma dans des puits séparés d’une plaque de puits de 1,1 millilitre de profondeur. Centrifugez la plaque pendant 10 minutes à deux degrés Celsius et 3 000 tr/min.

Ensuite, utilisez le Bravo pour diluer en série une solution étalon de NAT Ang-1 de 500 femtomole par microlitre pour préparer six solutions de calibrage avec de l’albumine de blanc d’œuf de poule. Après la centrifugation, pipeter 200 microlitres de chaque calibrateur dans un puits et 125 microlitres de tampon de génération dans la plaque d’échantillon. À l’aide d’un système automatisé de manipulation des liquides, mélangez 125 microlitres de surnageant plasmatique ou 125 microlitres de solution d’albumine de blanc d’œuf de poule avec 25 microlitres de tampon de génération d’angiotensine I dans une nouvelle plaque à puits profond de 1,1 millilitre.

Maintenant, transférez automatiquement les solutions sur une plaque de 96 puits avec trois répétitions par solution et 34 microlitres de solution par puits. Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Pour la conjugaison de l’anticorps avec des billes de protéine G, transférez d’abord 78 microlitres de boue de billes préalablement préparée dans un tube de 1,5 millilitre.

Lavez les billes sept fois avec un millilitre d’acétonitrile à 25 % et trois fois avec un millilitre de PBSC, en utilisant un support magnétique pour granuler les billes entre chaque lavage. Après avoir lavé les billes, mettez-les en suspension dans 110 microlitres de PBSC et ajoutez 110 microlitres d’anticorps anti-angiotensine I. Mélangez les billes et la solution par pipetage.

Ensuite, incubez les billes à température ambiante pendant une heure tout en tournant à huit tr/min. Ensuite, lavez les perles trois fois avec un millilitre de PBSC. Ensuite, mettez les billes en suspension dans 1 100 microlitres de PBSC.

Maintenant, transférez manuellement la solution de billes dans une plaque à 96 puits. Ensuite, demandez au Bravo d’aliquote les perles sur la même plaque à 96 puits. Après la période de génération de trois heures d’angiotensine I, placez la plaque d’incubation sur de la glace pendant 10 minutes pour mettre fin à la génération d’angiotensine I. Diluez automatiquement une solution mère de peptides étalons d’isotopes stables 100 fois avec un tampon PBS.

De plus, aliquote automatiquement la dilution peptidique standard d’isotope stable sur une plaque de PCR à 96 puits. Transférez 10 microlitres de la solution peptidique diluée dans chaque puits de la plaque d’incubation. Mélangez la solution peptidique diluée avec les échantillons de plasma ou la solution d’albumine de blanc d’œuf de poule.

Ajoutez automatiquement l’échantillon ou les solutions standard aux solutions de billes sur la plaque d’incubation et mélangez. Après une heure d’incubation, laver automatiquement les billes trois fois avec une solution de bicarbonate d’ammonium à cinq millimolaires. Utilisez un aimant pour tirer les perles vers le bas après chaque lavage.

Après le dernier lavage, ajoutez 10 microlitres de la solution de bicarbonate d’ammonium dans chaque puits pour remettre les billes en suspension. Transférez automatiquement sept microlitres de boue de billes sur une plaque cible MALDI d’une taille de spot de 2 600 micromètres. Une fois que les billes ont séché, ajoutez automatiquement deux microlitres de solution matricielle HCCA préalablement préparée à partir du puits de matrice sur chaque point d’échantillon de la plaque cible.

Ensuite, analysez les points d’échantillonnage avec un instrument MALDI-TOF en utilisant le mode réflecteur positif. Effectuez l’étalonnage interne, le lissage des données et la soustraction de la ligne de base à l’aide du logiciel spécifique au fournisseur. La procédure automatisée iMALDI de mesure de l’angiotensine I permet l’analyse à haut débit d’un grand nombre d’échantillons avec un coefficient de variation intrajournalière inférieur à 10 %Les spectres représentatifs obtenus en mesurant l’angiotensine I dans des échantillons de plasma humain sont présentés ici.

La corrélation des valeurs PRA de 188 échantillons de patients obtenus avec le test automatisé iMALDI avec les valeurs PRA obtenues à l’aide d’une procédure clinique LC-MS/MS est illustrée ici. Les deux méthodes ont un coefficient de corrélation de 0,98, et la différence entre les pentes peut être due à l’utilisation d’étalons internes différents ou d’anticorps différents. La plage linéaire du dosage et la précision du dosage sont affichées ici.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures environ. Lors de cette procédure, n’oubliez pas de régler correctement la tête de la pointe et la vitesse de manipulation du liquide. Après cette procédure, des méthodes supplémentaires peuvent être utilisées pour confirmer l’aldostéronisme primaire chez les patients, y compris des tests de charge orale en sel ou de perfusion saline.

La technique automatisée iMALDI permet le dépistage quantitatif spécifique et précis d’échantillons biologiques, y compris des échantillons de patients, pour des protéines ou des peptides liés à des maladies. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un test iMALDI automatisé pour la quantification des protéines et des peptides basée sur la spectrométrie de masse. N’oubliez pas que travailler avec des échantillons biologiques, tels que le plasma humain, est extrêmement dangereux et que les précautions de sécurité nécessaires doivent toujours être prises lors de l’exécution de la procédure.