Identification de Motifs Fonctionnelles et leurs PARTENAIRES DE LIAISON Peptide-basée sur

Cette vidéo présente un ensemble de quatre expériences utilisées pour identifier les motifs fonctionnels de la protéine NPH du VIH et pour développer des inhibiteurs à base de peptides. Des peptides courts spécifiques dérivés de motifs trouvés dans des protéines de pleine longueur conservent leur fonction biologique et inhibent de manière compétitive la fonction de la protéine de pleine longueur pour identifier les motifs apoptotiques. Dans le cas du VIH, une cellule de chat secoussé NEF est exposée à des peptides de balayage NEF et un test apoptotique tunnel est effectué pour identifier les peptides qui induisent l’apoptose.

Un deuxième ensemble de peptides contenant des variations sur un motif de sécrétion NEF. La région de modification de la sécrétion ou SMR est transfectée dans les cellules avec la perte de fonction de la NPH GFP due à une inhibition compétitive indiquée par une diminution de la sécrétion de nph. La GFP est évaluée par fluorométrie pour identifier les facteurs cellulaires qui interagissent avec la région de modification des sécrétions ou SMR de nef.

Les précipitations sont effectuées à l’aide de NPH de type sauvage SMR comme appât. Enfin, pour tester si ces interactions affectent la sécrétion, des anticorps contre des partenaires de liaison identifiés sont transfectés dans des cellules. Pour évaluer s’ils antagonisent la sécrétion du motif NF, les résultats obtenus identifient deux motifs apoptotiques fonctionnels dans la NEF et un peptide inhibiteur qui antagonise un motif de sécrétion de NEF fonctionnel ainsi que ses partenaires de liaison cellulaire nécessaires à la sécrétion.

L’objectif global de cet ensemble de quatre expériences est d’accélérer l’identification de motifs fonctionnels dans les protéines cibles, puis d’utiliser ces données pour développer des inhibiteurs de bases peptidiques de ces motifs fonctionnels. Cet ensemble de protocoles a été utile à notre groupe pour nous aider à répondre à des questions clés liées à la pathogenèse du VIH, telles que la compréhension du rôle de la sécrétion de neph dans la pathogenèse et le déchiffrage des mécanismes sous-jacents à la capacité de Neff à manipuler la voie du trafic exosomal. Aujourd’hui, le Dr Ming Bo Huang, qui est instructeur de recherche dans mon laboratoire, fera la démonstration des procédures.

Commencer cette procédure avec un ensemble de peptides balayant la région d’intérêt pour cette expérience. 20 peptides mères avec un chevauchement de 10 acides aminés couvrant l’ensemble du VIH et une protéine NPH ont été obtenus à partir du programme de réactifs du sida. Pour identifier les motifs apoptotiques NPH, effectuez un test d’apoptose à l’aide des peptides de balayage NEF individuellement comme suit, ajoutez un millilitre de milieu de culture contenant 10 nanogrammes par millilitre de peptide par plaque de 35 millimètres de jerk hat, des cultures cellulaires et incubez des cultures pendant 24 heures à 37 degrés Celsius.

Après l’incubation, effectuer un test terminal de marquage ou de marquage ou un test tunnel médié par la désoxynucléotide transférase terminale, une encoche de biotine ou un test tunnel pour évaluer l’apoptose. Pour ce faire, lavez d’abord les cellules avec du PBS, puis aspirez le PBS et ajoutez 4 % d’aldéhyde paraforme dans le PBS, incubez pendant 30 minutes à température ambiante pour fixer les cellules après avoir fixé les cellules, lavez-les avec du PBS et ajoutez du Triton X 100, incubez pendant 10 minutes à température ambiante pour les percer. Après avoir fixé et perméable les cellules, ajoutez le réactif tunnel et incubez les cellules pendant une heure à 37 degrés Celsius après la perméabilité.

Rincez les cellules deux fois avec du PBS. Déterminez ensuite le pourcentage de cellules colorées par épifluorescence sur un système de microscopie contrôlé par ordinateur. Après avoir transecté des cellules jca avec du NPH, du plasmide GFP et différentes variantes du peptide SMR à l’aide du kit de réactifs d’administration de protéines chariot, comme décrit dans le document d’accompagnement, récoltez le milieu pour déterminer l’efficacité de la transfection par microscopie fluorescente.

Capturez des images fluorescentes et en fond clair et déterminez le pourcentage de cellules. Transfecté ensuite pour évaluer l’inhibition de la sécrétion de NPH GFP, transférez 100 microlitres du milieu conditionné acellulaire dans des puits individuels d’une plaque de microtitration noire de 96 puits. Utilisez un fluorimètre avec une longueur d’onde d’excitation de 485 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 515 nanomètres pour mesurer la fluorescence GFP dans le milieu en unités de fluorescence relatives.

Une fois la lecture terminée, transférez les données sur un PC. Réglez le niveau de fluorescence GFP dans le milieu témoin à 100 %, puis comparez-le au niveau de fluorescence GFP dans le milieu à partir de cellules co-transfectées avec divers peptides SMR pour déterminer les changements dans la sécrétion de GFP NPH. La co-IP pour isoler les partenaires de liaison de motif est une étape difficile.

Assurez-vous que les billes sont correctement agitées pendant les incubations et que le plus de liquide possible est retiré des billes à chaque étape de lavage. Cultivez des cellules de jerk hat dans un milieu RPMI 1640 contenant 10 % de FBS à 37 degrés Celsius dans des cellules de granulés de fiole de culture tissulaire T 75 par centrifugation à 1000 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Remettez en suspension la pastille de cellule dans un millilitre de PBS et transférez-la dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre.

Faites tourner à 1000 fois G pendant une minute. Remettez ensuite la pastille en suspension dans un millilitre de lyse Anti-Flag. Tampon par pipetage doux différentiellement micro centrifugeuse.

Les suspensions à 2000 fois G pendant cinq minutes et à 13 000 fois G pendant 10 minutes. Pour granuler les débris cellulaires et l’ADN, respectivement, collectez le surnageant, ci-après appelé lysat. Après avoir déterminé la concentration en protéines, ajoutez un milligramme de protéine de lysat et un microgramme de peptide de type sauvage SMR ou de peptide mutant SMR à 20 microlitres de gel d’affinité Anti-Flag M deux.

Ce gel d’affinité est ci-après appelé la résine qui porte le mélange à un volume final d’un millilitre dans un tampon co-IP. Préparez également un contrôle négatif dans lequel le lysat est combiné à de la résine en l’absence de l’un ou l’autre des peptides. Incuber les mélanges à quatre degrés Celsius pendant la nuit avec rotation de bout en bout.

Le lendemain, granulez la résine par micro-centrifugation à 5 000 à 8 000 fois G pendant 30 secondes. Après l’essorage, attendez une à deux minutes avant de manipuler les échantillons pour permettre à la résine de se déposer dans le tube. Retirez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette à extrémité étroite ou d’une seringue Hamilton en prenant soin de ne pas transférer de résine.

Lavez la résine quatre fois à l’aide d’un réusus, en la suspendant dans 500 microlitres de tampon de lavage, suivie d’une micro-centrifugation. Pour éluer les protéines cellulaires liées. Ajoutez 15 microgrammes de peptide trois x drapeau en excès dans le tube dans 50 microlitres de tampon de lavage et incubez sur un agitateur à bascule pendant 30 minutes à température ambiante après la centrifugeuse d’incubation à 5 000 à 8 000 fois G pendant 30 secondes.

Après avoir laissé les tubes se déposer pendant deux minutes, récupérez et conservez le surnageant contenant les protéines éludées. Après avoir concentré les EITs par précipitation d’acétone, faites bouillir les échantillons dans un tampon d’échantillon. Séparez ensuite les protéines par page SDS sur un gel préfabriqué de 40 à 20 % de triss, critère HCL, colorez le gel avec kumasi brilliant blue R deux 50.

Pour évaluer l’inhibition des anticorps transfectent les cellules JCA avec du NGFP et de la tubuline antifa ou un anticorps anti-mortalité à l’aide du kit de réactifs d’administration de protéines de chariot tel que décrit dans le document d’accompagnement, prélever le milieu conditionné acellulaire à partir des cellules récoltées. Transférez 100 microlitres dans des puits individuels d’une plaque de microtitration noire de 96 puits. Mesurez ensuite la fluorescence GFP dans le milieu à l’aide d’un fluorimètre avec une longueur d’onde d’excitation de 485 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 515 nanomètres en unités fluorescentes relatives.

Après avoir lu la plaque, transférez les données sur un PC et réglez le niveau de fluorescence GFP dans le contrôle de la tubuline anti-graisse à 100 %Comparez cela au niveau de fluorescence GFP dans le milieu à partir de cellules cot transfectées avec un anticorps anti-mortalité pour déterminer les changements dans la sécrétion de GFP NEF pour cartographier les motifs apoptotiques du VIH une analyse de balayage peptidique des protéines NPH a été effectuée comme décrit dans cette vidéo. L’axe des y montre le pourcentage de cellules marquées en tunnel et l’axe des x indique la condition de traitement comme indiqué ici, deux régions distinctes du VIH et une NEF ont été identifiées qui induisent l’apoptose. Ceux-ci sont indiqués par un marquage tunnel accru des cellules exposées aux peptides neph.

Les pics d’apoptose sont désignés par le premier motif et le deuxième motif afin d’évaluer l’inhibition compétitive de la sécrétion de neph par les peptides de type sauvage SMR, milieu de culture à partir de cellules T CAT saccadées transectées avec un clone de NPH GFP et divers peptides SMR ont été dosés pour la sécrétion de NPH exo omal, comme le montre la fluorescence GFP dans les peptides moyens contenant un ou plusieurs motifs de séquence SMR NPH de type sauvage, inhibé la sécrétion de NEF exo omal. Alors que le remplacement de l’alanine de tout acide aminé dans cette région a considérablement réduit l’efficacité des peptides. Cela suggère que le peptide de type sauvage SM R inhibe l’exo omal nph, une version brouillée de 11 acides aminés du motif apoptotique de Neff. Un SM, précédemment décrit et obtenu de Sigma Genesis, a été utilisé comme témoin négatif et n’a eu aucun effet sur la sécrétion de NEP exo-omal.

Cette image du gel SDS coloré au kumasi montre la co-immunoprécipitation de quatre protéines par le peptide de type sauvage SMR avec des tailles de 60, 65, 75 et 250 kilodaltons. Le peptide mutant SMR de contrôle négatif n’a pas capturé ces protéines, et ces protéines n’ont pas interagi de manière non spécifique avec la résine d’affinité. En l’absence du peptide de type sauvage SMR, ces résultats suggèrent que les protéines précipitées interagissaient spécifiquement avec les motifs SMR du peptide de type sauvage SMR.

Le test du lecteur de plaque montre que la transfection de l’anticorps antimortel avec le plasmide d’expression du neph a complètement aboli la sécrétion de NPH exo-omal. L’anticorps non apparenté n’a eu aucun effet sur la sécrétion d’exo omal ne. Ces résultats suggèrent qu’une interaction intacte du talent NM est nécessaire pour la sécrétion d’exo omal neph.

En conclusion, après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir développé une bonne compréhension de la façon d’utiliser les techniques de description pour identifier les motifs fonctionnels dans les protéines cibles et d’utiliser ces données pour développer des inhibiteurs de base peptidique de ces motifs fonctionnels. Lors de la tentative de la procédure co-IP, il sera essentiel de se rappeler de porter une attention particulière à l’exécution des lavages d’incubation, en s’assurant que les billes sont correctement agitées pendant les incubations et que le plus de liquide possible est retiré des billes à chaque étape de lavage. De plus, pendant les lavages de la résine cellulaire et lysate, les lavages permettent toujours à la résine de se déposer après la centrifugation.

Utilisez les pointes de pipette à extrémité étroite et effectuez quatre lavages pour réduire adéquatement l’arrière-plan à des niveaux acceptables.