Identification de Motifs Fonctionnelles et leurs PARTENAIRES DE LIAISON Peptide-basée sur

Ce vidéo présente un ensemble de quatre expériences utilisées pour identifier des motifs fonctionnels de la protéine NPH du VIH-1 et pour développer des inhibiteurs peptidiques. Des peptides courts spécifiques, dérivés de motifs présents dans des protéines pleine longueur, conservent à la fois leur fonction biologique et inhibent de manière compétitive la fonction de la protéine pleine longueur afin d'identifier des motifs apoptotiques. Dans des cellules infectées par le VIH-1 exprimant la protéine NEF, des peptides de balayage de la protéine NEF sont appliqués, puis un test apoptotique TUNEL est réalisé pour identifier les peptides induisant l'apoptose.

Un deuxième ensemble de peptides contenant des variations d'un motif de sécrétion de NEF. La région de modification de la sécrétion, ou SMR, est transfectée dans des cellules conjointement avec NPH ; la perte de fonction de GFP due à une inhibition compétitive est indiquée par une diminution de la sécrétion de nph. La GFP est évaluée par fluorométrie afin d'identifier les facteurs cellulaires qui interagissent avec la région de modification de la sécrétion, ou SMR, de nef.

Des précipitations par liaison d'anticorps sont réalisées en utilisant le NPH de type sauvage SMR comme appât. Enfin, afin de tester si ces interactions affectent la sécrétion, des anticorps dirigés contre les partenaires de liaison identifiés sont transfectés dans des cellules. Pour évaluer s'ils antagonisent la sécrétion du motif NF, les résultats obtenus permettent d'identifier deux motifs apoptotiques fonctionnels dans NEF ainsi qu'un peptide inhibiteur qui antagonise un motif de sécrétion fonctionnel de NEF, ainsi que ses partenaires cellulaires nécessaires à la sécrétion.

L'objectif général de cette série de quatre expériences est d'accélérer l'identification de motifs fonctionnels dans des protéines cibles, puis d'utiliser ces données pour développer des inhibiteurs peptidiques ciblant ces motifs fonctionnels. Ce jeu de protocoles s'est révélé utile pour notre équipe afin de répondre à des questions clés liées à la pathogenèse du VIH, comme comprendre le rôle de la sécrétion induite par la néphrine dans la pathogenèse, ou élucider les mécanismes sous-jacents à la capacité de Nef à manipuler la voie de trafic exosomale. Aujourd'hui, les procédures seront présentées par le Dr Ming Bo Huang, chercheur-enseignant dans mon laboratoire.

Commencez cette procédure avec un ensemble de peptides balayant la région d'intérêt pour cette expérience. Des peptides de 20 acides aminés avec un recouvrement de 10 acides aminés couvrant l'ensemble de la protéine NPH du VIH-1 ont été obtenus auprès du programme de réactifs contre le SIDA. Pour identifier les motifs apoptotiques de NPH, réalisez un test d'apoptose en utilisant individuellement les peptides de balayage de NEF comme suit : ajoutez un millilitre de milieu de culture contenant 10 nanogrammes par millilitre de peptide par plaque de 35 millimètres de cultures cellulaires de jerk hat, puis incubez les cultures pendant 24 heures à 37 degrés Celsius.

Après l'incubation, réalisez un test TUNEL (marquage terminal des brins cassés de l'ADN par la transférase de désoxynucléotidyles en présence de dUTP biotinylé) pour évaluer l'apoptose. Pour ce faire, lavez d'abord les cellules avec du PBS, puis aspirez le PBS et ajoutez du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS ; incubez pendant 30 minutes à température ambiante afin de fixer les cellules. Après la fixation, lavez les cellules avec du PBS puis ajoutez du Triton X-100 et incubez pendant 10 minutes à température ambiante pour les permeabiliser. Une fois les cellules fixées et permeabilisées, ajoutez le réactif TUNEL et incubez les cellules pendant une heure à 37 degrés Celsius après la permeabilisation.

Rincez les cellules deux fois avec du PBS. Déterminez ensuite le pourcentage de cellules marquées par fluorescence d'épimicroscopie sur un système de microscopie contrôlé par ordinateur. Après avoir transfecté des cellules jca avec le plasmide NPH, GFP et différentes variantes du peptide SMR en utilisant le kit de réactif de livraison protéique Chariot comme décrit dans le document accompagnant, récoltez le milieu afin de déterminer l'efficacité de transfection par microscopie fluorescente.

Capturez des images en fluorescence et en champ clair et déterminez le pourcentage de cellules. Pour évaluer l'inhibition de la sécrétion de GFP NPH, transférez ensuite 100 microlitres du milieu conditionné sans cellules dans des puits individuels d'une plaque microtitration noire de 96 puits. Utilisez un fluorimètre avec une longueur d'onde d'excitation de 485 nanomètres et une longueur d'onde d'émission de 515 nanomètres pour mesurer la fluorescence de la GFP dans le milieu en unités de fluorescence relative.

Une fois la lecture terminée, transférez les données sur un ordinateur. Réglez le niveau de fluorescence de la GFP dans le milieu témoin à 100 %, puis comparez-le au niveau de fluorescence de la GFP dans le milieu provenant des cellules cotransfectées avec divers peptides SMR afin de déterminer les modifications de la sécrétion de la GFP-NPH. La co-immunoprécipitation permettant d'isoler les partenaires de liaison du motif constitue une étape délicate.

Veillez à ce que les billes soient correctement agitées pendant les incubations et à ce que le maximum de liquide soit éliminé des billes lors de chaque étape de lavage. Faites croître les cellules jerk hat dans un milieu RPMI 1640 contenant 10 % de FBS à 37 degrés Celsius dans un flacon de culture tissulaire T75. Récupérez les cellules par centrifugation à 1000 × g pendant 20 minutes à 4 degrés Celsius. Resuspendez le culot cellulaire dans un millilitre de PBS et transférez-le dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.

Faire centrifuger à 1000 × g pendant une minute. Ensuite, resuspendre le culot dans un millilitre de tampon de lyse Anti-Flag par pipetage doux dans une microcentrifugeuse.

Les suspensions sont centrifugées à 2000 fois G pendant cinq minutes et à 13 000 fois G pendant 10 minutes afin de former un culot contenant respectivement les débris cellulaires et l'ADN. Récupérez le surnageant, dorénavant appelé lysat. Après avoir déterminé la concentration en protéines, ajoutez un milligramme de protéine de lysat et un microgramme de l'un des peptides, soit le type sauvage SMR, soit le peptide muté SMR, à 20 microlitres de gel d'affinité Anti-Flag M deux.

Ce gel d'affinité est ci-après désigné comme la résine ; amener le mélange à un volume final d'un millilitre dans du tampon co-IP. Préparer également un témoin négatif dans lequel le lysat est associé à la résine en l'absence de tout peptide. Incuber les mélanges à quatre degrés Celsius toute la nuit avec une rotation bout à bout.

Le lendemain, faire tomber la résine en pellet par microcentrifugation à 5 000-8 000 ×g pendant 30 secondes. Après la centrifugation, attendre une à deux minutes avant de manipuler les échantillons afin de permettre à la résine de se déposer au fond du tube. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette munie d’une pointe fine ou d’une seringue Hamilton, en prenant soin de ne pas transférer de résine.

Lavez la résine quatre fois par resuspension dans 500 microlitres de tampon de lavage, suivie d'une microcentrifugation. Pour éluer les protéines cellulaires liées, ajoutez 15 microgrammes de peptide Flag triplement excédentaire dans 50 microlitres de tampon de lavage au tube et incubez sur un agitateur rotatif pendant 30 minutes à température ambiante ; après l'incubation, centrifugez à 5 000 à 8 000 ×g pendant 30 secondes.

Après avoir laissé les tubes se décanter pendant deux minutes, recueillir et conserver le surnageant contenant les protéines élutées. Après concentration des EIT par précipitation à l'acétone, faire bouillir les échantillons dans un tampon d'échantillonnage LaLy. Puis séparer les protéines par électrophorèse SDS-PAGE sur un gel préformé Tris-HCl Criterion allant de 40 à 20 %, et colorer le gel avec le bleu de Coomassie Brilliant Blue R-250.

Pour évaluer l'inhibition par les anticorps, cotransfectez les cellules JCA avec NGFP et soit un anticorps anti-tubuline, soit un anticorps anti-mort, en utilisant le kit de réactif de livraison protéique Chariot comme décrit dans le document joint. Récupérez le milieu conditionné sans cellules à partir des cellules récoltées. Transférez 100 microlitres dans des puits individuels d'une plaque microtitration noire de 96 puits. Ensuite, mesurez la fluorescence GFP dans le milieu à l'aide d'un fluorimètre avec une longueur d'onde d'excitation de 485 nanomètres et une longueur d'onde d'émission de 515 nanomètres, exprimée en unités de fluorescence relative.

Après la lecture de la plaque, transférez les données sur un PC et réglez le niveau de fluorescence de la GFP dans le témoin anti-fat tubuline à 100 %. Comparez ce niveau à celui de la fluorescence de la GFP dans le milieu provenant des cellules cotransfectées avec l'anticorps anti-mortalité afin de déterminer les variations de la sécrétion de GFP-NEF pour cartographier les motifs apoptotiques des protéines NPH du VIH-1. Une analyse par balayage peptidique a été réalisée comme décrit dans cette vidéo. L'axe des Y indique le pourcentage de cellules marquées en tunnel et l'axe des X désigne la condition de traitement. Comme indiqué ici, deux régions distinctes du NEF du VIH-1 ont été identifiées comme induisant l'apoptose. Elles sont indiquées par une augmentation du marquage en tunnel des cellules exposées à des peptides de NEF.

Les pics d'apoptose sont désignés par le motif un et le motif deux afin d'évaluer l'inhibition compétitive de la sécrétion de NPH par des peptides de type sauvage SMR. Le milieu de culture provenant de cellules T CAT transfectées conjointement avec un clone NPH-GFP et divers peptides SMR a été analysé pour la sécrétion de NPH exomale, comme indiqué par la fluorescence GFP dans le milieu. Les peptides contenant un ou plusieurs motifs de séquence SMR-NPH de type sauvage ont inhibé la sécrétion de NPH exomale, tandis que le remplacement par l'alanine de n'importe quel acide aminé à l'intérieur de cette région a fortement réduit l'efficacité du peptide. Cela suggère que le peptide SMR de type sauvage inhibe la NPH exomale, une version désordonnée de 11 acides aminés du motif apoptotique de NEF. Un SM un, précédemment décrit et obtenu auprès de Sigma Genosys, a été utilisé comme contrôle négatif et n'a eu aucun effet sur la sécrétion de NEP exomale.

Cette image du gel SDS-PAGE coloré au kumasi montre la co-immunoprécipitation de quatre protéines par le peptide de type sauvage SMR, dont les tailles sont de 60, 65, 75 et 250 kilodaltons. Le peptide mutant SMR utilisé comme contrôle négatif n’a pas capturé ces protéines, et celles-ci n’ont pas interagi de manière non spécifique avec la résine d’affinité. En l’absence du peptide SMR de type sauvage, ces résultats suggèrent que les protéines co-précipitées interagissaient spécifiquement avec les motifs SMR du peptide SMR de type sauvage.

Le test au lecteur de plaques montre que la codiffusion de l'anticorps anti-mortal avec le plasmide d'expression de neph abolit complètement la sécrétion exogène de NPH. L'anticorps non apparenté n'a aucun effet sur la sécrétion exogène de ne. Ces résultats suggèrent qu'une interaction NM intacte est nécessaire à la sécrétion exogène de neph.

En conclusion, après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir acquis une bonne compréhension de la manière d'utiliser les techniques décrites pour identifier des motifs fonctionnels dans des protéines cibles et d'exploiter ces données afin de concevoir des inhibiteurs peptidiques ciblant ces motifs fonctionnels. Lors de la réalisation de la procédure de co-immunoprécipitation, il sera essentiel de prêter une attention particulière aux étapes d'incubation et de lavage, en veillant à ce que les billes soient correctement agitées pendant les incubations et à ce que le maximum de liquide soit éliminé des billes à chaque étape de lavage. De plus, lors des lavages des cellules et de la résine à lysat, laissez toujours la résine se déposer après chaque centrifugation.

Utilisez des pointes de pipette étroites et effectuez quatre lavages pour réduire suffisamment le fond jusqu'à des niveaux acceptables.