Protéomique quantitative à l'aide réductrice diméthylation pour les isotopes stables étiquetage

L’objectif global de cette procédure est de comparer les concentrations de nombreuses protéines entre les échantillons par spectrométrie de masse à l’aide de la protéomique prête. Pour ce faire, il faut d’abord digérer la protéine de chaque échantillon pour générer des mélanges de peptides. Ensuite, les deux échantillons sont mélangés, et les peptides de l’échantillon mélangé sont fractionnés et dessalés.

Ensuite, l’échantillon mélangé est ensuite analysé par spectrométrie de masse. Enfin, les peptides sont identifiés en comparant les deux spectres MS à une base de données de leurres cibles de tous les peptides potentiels dans les échantillons et l’abondance relative des peptides entre les échantillons est quantifiée. En fin de compte, la protéomique prête à l’emploi permet de quantifier l’abondance relative de nombreuses protéines entre des échantillons complexes.

Le principal avantage de la déméthylation réductrice par rapport à d’autres méthodes de marquage d’isotopes stables telles que iLite, est qu’il s’agit d’une méthode rapide, peu coûteuse et précise qui ne nécessite pas de trois spécifiques ou de milieu synthétique, ce qui signifie qu’elle peut être appliquée à presque tous les types d’échantillons. Pour commencer, préparez un milligramme de protéines cellulaires et 500 microlitres en utilisant la sonication ou une presse française pour mélanger les cellules afin de précipiter les protéines. Ajoutez un volume d’acide trichlorotique à quatre volumes de protéines et réfrigérez sur de la glace pendant 10 minutes.

Centrifuger à 12 000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et retirer le surnageant. Utilisez ensuite un millilitre d’acétone glacée pour Resus. Suspendez le granulé avant de l’essorer une deuxième fois.

Après avoir aspiré le natte, séchez la pastille dans un bloc de chaleur de 56 degrés Celsius pour dénaturer les protéines et réduire les liaisons sulfure du colorant. Utilisez 500 microlitres de tampon de dénaturation et de réduction pour réuser. Remettez les protéines en suspension à environ deux milligrammes par millilitre.

Incuber les protéines pendant 30 minutes à 56 degrés Celsius, suivies de 10 minutes à température ambiante. En plus des groupes sulfure sans alkylates, ajoutez 25 microlitres d’acétamide IDO 0,3 molaire fraîchement préparé dans de l’eau à 500 microlitres de protéines et incubez dans l’obscurité pendant 20 minutes à température ambiante. Après l’incubation, éteignez la réaction en ajoutant 10 microlitres de DTT de trois millimolaires.

Stockez les protéines alkylées à moins 80 degrés Celsius pour digérer les protéines alkylées après la précipitation du TCA, utilisez une urée molaire dans 50 millimolaires HEIS pH 8,2 pour remettre la protéine en suspension. Préparez une solution mère de Lysol, d’endoprotéinase ou de ly C dans de l’eau à une concentration de deux microgrammes par microlitre et ajoutez l’enzyme à la protéine digérée à une concentration finale de 10 nanogrammes par microlitre. Les échantillons sont laissés à température ambiante pendant six heures ou toute la nuit. Mettez en suspension 20 microgrammes de trypsine de qualité séquençage dans 40 microlitres d’acide acétique de 50 millimolaires et ajoutez cinq microlitres à la réaction de digestion du lyce.

Incuber pendant six heures à 37 degrés Celsius sur les protéines alkylées. Ajouter de l’acide trifluoracétique ou TFA à une concentration finale de 0,5 %Fixer une colonne de C 18 à un collecteur d’extraction. Utilisez ensuite six millilitres d’acéto nitrile ou un CN pour mouiller la colonne.

Ensuite, avec le débit le plus élevé possible, utilisez six millilitres de CN 0,1 % TFA pour laver la colonne avant d’utiliser six millilitres de TFA 0,1 % pour équilibrer la colonne, arrêter la pression du vide et charger 500 microgrammes de peptides sur la colonne à un débit d’environ un millilitre par minute. Une fois que les peptides sont liés à la colonne, redémarrez le vide et avec le débit le plus élevé possible, utilisez 0,1 % TFA suivi de trois millilitres de tampon d’acide citrique pour laver la colonne afin d’effectuer une onco, une réductrice, une méthylation faible ou un étiquetage prêt à l’emploi. Sous une hotte chimique, préparez 12 millilitres chacun de tampons légers et lourds prêts à l’emploi Tom Methylate sans peptide.

A signifie ajouter 10 millilitres de tampon prêt à l’emploi léger ou lourd à la colonne à un débit d’un millilitre par minute. Après l’application d’une deuxième aliquote de 10 millilitres. Pour assurer l’étiquetage, utilisez six millilitres d’AGF à 0,1 %, suivis d’un millilitre d’acide acétique à 0,5 %.

Pour laver la colonne afin d’éluer les protéines, arrêtez le vide et appliquez un millilitre de 40 % à un acide acétique CN 0,5 % à un débit de 0,5 millilitres par minute. Ajoutez ensuite un millilitre d’éluté à 80 % de CN et 0,5 % d’acide acétique avec une seringue de cinq millilitres si vous le souhaitez. Mélangez un rapport de un pour un d’échantillons de peptides marqués lourds et légers et quantifiez par spectrométrie de masse pour vous assurer que le marquage et le marquage léger étaient efficaces, fractionnez le mélange de peptides en l’appliquant d’abord sur une colonne HPLC C 18.

Ensuite, après avoir utilisé 5 % de CN pour laver la colonne pendant cinq minutes, utilisez un gradient de cinq à 35 % de CN sur 60 minutes pour éluer les peptides en fractions égales. Dans une plaque à 96 puits, suivie d’un CN à 90 % A pendant une minute. Après quatre minutes supplémentaires de CN à 90 %A, utilisez CN à 5 % pour rééquilibrer la colonne.

Combinez ensuite les fractions de la manière suivante avec la centrifugeuse à vide. Retirez le solvant des fractions combinées. Ensuite, utilisez 130 microlitres d’une molaire d’urée 0,5 % TFA à Resus.

Suspendez les peptides des fractions suivantes, et stockez l’ensemble des fractions à moins 20 degrés Celsius pour effectuer, arrêter et relancer l’extraction sur les fractions remises en suspension. Préparez des micro-colonnes d’embouts d’étage C 18 à partir d’embouts de pipette de 200 microlitres en utilisant deux disques C 18 d’un diamètre intérieur de 1,07 millimètre pour les emballer. Placez les pointes de la platine dans des microtubes à centrifuger et ajoutez 130 microlitres de méthanol et essorez.

Ajoutez ensuite 130 microlitres d’acide 80 % CN 0,5 % acétique avant d’essorer à nouveau après avoir utilisé 130 microlitres de 0,1 % TFA pour équilibrer les pointes, transférez le mélange de peptides sur les pointes et lavez. D’abord avec 130 microlitres de 0,1 % TFA suivi de 40 microlitres de 0,1 % TFA. Puis 40 microlitres d’acide acétique à 0,5 % pour éluer les peptides.

Tout d’abord, ajoutez 20 microlitres de 40 % à un acide NC 0,5 % acétique. Puis 20 microlitres de 80 % de CN 0,5 % d’acide acétique. Combinez les IIT et le filtrat sous vide pour sécher afin d’effectuer une chromatographie liquide microcapillaire.

spectrométrie de masse en tandem ou L-C-M-S-M-S commence par utiliser 5 % d’acide formique, 5 % de CN pour remettre les protéines en suspension à une concentration d’environ un microgramme par microlitre. Appliquez environ un microgramme de peptides sur un C 18 de 100 micromètres sur 20 centimètres. Colonne HPLC en phase inverse et éluation en utilisant un gradient de six à 22 % d’un NC dans de l’acide formique à 0,1 25 % à un débit d’environ 300 nanolitres par minute, appliqué sur 75 à 100 minutes.

Utilisez un spectromètre de masse à haute résolution et à haute précision de masse et identifiez les peptides dans l’échantillon en comparant les fichiers bruts Ms.Ms Spectra à une base de données théorique avec un algorithme tel que SE quest, en utilisant les paramètres présentés ici avec la base de données des cadres de lecture ouverts dans les peptides de filtre d’orientation réelle et inverse à un taux de fausse découverte de 1 % avec une méthode telle que le leurre cible. Pour quantifier les peptides identifiés, calculez les surfaces des paires lourdes et légères de MS un extrait des chromatogrammes ioniques et les rapports signal/bruit des peptides incluent les paires de peptides uniquement lorsque leur rapport signal/bruit moyen est supérieur à cinq. Quantifiez l’abondance relative d’un peptide dans les deux échantillons comme le rapport entre les surfaces MS et un pic des versions lourdes et légères du même peptide, calculez les abondances relatives des protéines comme le rapport médian MS et une surface pic pour tous les peptides de la protéine lorsqu’ils sont filtrés à un taux de fausses découvertes de peptides de 1 %.

L’efficacité de l’étiquetage d’un mélange de phyto ferment c provenant de cultures marquées lourdes et légères contenant 11 194 séquences peptidiques uniques était de 98 % de lysat de protéine visier non fractionné a été analysé de la même manière. Les différences d’expression des protéines reflètent de manière reproductible les rapports auxquels les échantillons lourds et légers ont été mélangés dans une large gamme de rapports de mélange. Plus précisément, la variation de 99 % des protéines était inférieure à 1,6 pour les échantillons mixtes individuels dans les échantillons un à 10 et 10 à un.

99 % des protéines étaient à moins de 3,8 fois du rapport attendu, montrant une augmentation de l’écart-type à une plus grande distance d’un mélange un à un. Lorsque l’étiquetage prêt à l’emploi a été appliqué au protéome de phyto-ferment de Clostridium, plus de 2000 protéines ont été quantifiées avec 94 % de protéines mesurées à des niveaux doubles pour des cultures répétées poussant sur le pli de protéines de glucose. Les changements pour les paires de cultures en double étaient également fortement corrélés.

Ensemble, ces expériences confirment que la protéomique prête à l’emploi est une méthode précise et reproductible pour quantifier les différences d’expression des protéines entre des échantillons complexes. Parce que cette technique peut être appliquée à pratiquement n’importe quel type d’échantillon, elle a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la protéomique pour explorer les changements d’expression des protes dans toutes sortes d’échantillons, y compris de nouveaux microbes, des poissons et des cellules de mammifères.