Name: Protéomique quantitative à laide réductrice diméthylation pour les isotopes stables étiquetage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Découvrez la protéomique quantitative par diméthylation réductive pour l'étiquetage isotopique stable. Cette méthode rapide et économique permet de quantifier les protéines par spectrométrie de masse dans divers échantillons complexes.

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Nous remercions SP Gygi et GM Church pour leur aide et leurs conseils. Ces travaux ont été soutenus par une chaire d’excellence du CNRS à l’ACT.

NOTE: Cette méthode a déjà été décrite 12. Une. Protein Isolation Préparer 1 mg de protéine cellulaire par lyse des cellules, de préférence par des méthodes physiques telles que la presse française, bourrelet battage ou sonication. Éviter la lyse cellulaire par le lysozyme médiation car l&#39;enzyme confondra mesures de spectrométrie de masse. 2. TCA précipitation des protéines Ajouter de l&#39;acide trichloroacétique 1 volume (TCA) à 4 volumes de protéines et de froid sur la glace pendant 10 min pour précipiter les protéines. Centrifugeuse à 12 000 g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Remettre en suspension le culot dans 1 ml d&#39;acétone glacée et centrifuger à 12 000 g pendant 5 min à 4 ° C. Eliminer le surnageant et inverser le tube sur le banc pour sécher le culot pendant 15 min. boulettes de protéines de magasin à -80 ° C. 3. Dénaturer les protéines et réduire les liaisons disulfures Resuspendre les protéines à ~ 2 mg / ml dans 500 ul de tampon de dénaturation et de réduction (soit 4 M d&#39;urée ou de 3% de SDS à 50 mM d&#39;HEPES pH 8,5, 5 mM de DTT). En option, inclure un inhibiteur de protéase dans la mémoire tampon. Incuber les protéines de 30 min à 56 ° C, suivies de 10 min à température ambiante. 4. Aklylate Groupes sulfhydryle libre de perturber de façon irréversible la formation de liaisons disulfures Préparer une solution fraîche 0,3 M iodacétamide dans l&#39;eau. ATTENTION! Iodoacetamide est hautement toxique. Ajouter 25 ul de 0,3 M d&#39;iodoacétamide (15 mM de concentration finale) et 500 ul de protéine et incuber pendant 20 min à l&#39;obscurité à température ambiante. Étancher iodacétamide en ajoutant 10 ul de 300 mM de DTT (5 mM concentration finale TNT). Stocker des protéines alkylés à -80 ° C. 5. Digestion des protéines TCA précipiter les protéines (comme décrit dans l&#39;étape 2) et remettre en suspension dans 1 ml de 50 mM de HEPES (pH 8,2), 1 M d&#39;urée. Préparer une solution stock de Lysyl endoproteinase (Lys-C) dans de l&#39;eau à une concentration de 2 ug / ul et ajouter 5 pl de la solution de protéine. Faire incuber le mélange pendant 16 heures à température ambiante. S&#39;assurer que la concentration finale Lys-C est de 10 ng / ul, et le rapport protéine-à-LysC (p / p) est 1/50-1/200. Remettre en suspension 20 ug de trypsine de qualité séquençage dans 40 ul de 50 mM d&#39;acide acétique, 5 ul (10 ug de trypsine) à la digestion par Lys-C et incuber pendant 6 heures à 37 ° C. Utiliser la même concentration de la protéase et les ratios protease-à-protéine pour Lys-C, tel qu&#39;utilisé pour la trypsine. 6. Phase inverse Peptide Extraction <ol><li> On acidifie par addition de peptides de l&#39;acide trifluoroacétique (TFA) à une concentration finale de 0,5% (pH d&#39;≈ 2). Attacher une colonne C18 à un collecteur d&#39;extraction. Utilisez le débit le plus élevé possible pour toutes les étapes sauf le chargement et l&#39;élution des peptides. </li><li> Colonne d&#39;eau avec 6 ml d&#39;acétonitrile (ACN). Laver la colonne avec 6 ml de 80% d&#39;ACN, 0,1% de TFA, puis s&#39;équilibrer avec 6 ml de TFA 0,1%. Ne pas laisser lecolonne fonctionner à sec entre les étapes. </li><li> Arrêter la pression de vide et charger 500 ug de peptides sur la colonne à un débit d&#39;environ 1 ml / min. Une fois que les peptides sont liés à la colonne, sous vide de redémarrage et laver avec 6 ml de TFA 0,1%, puis avec 3 ml de tampon d&#39;acide citrique (0,09 M acide citrique, 0,23 M de Na 2 HPO 4, à pH 5,5). Nota: Les montants élevés de peptides peuvent être marqués, mais la colonne C18 capacité de liaison devraient être au moins deux fois plus élevées que la quantité de peptide pour éviter la perte de l&#39;échantillon. </li></ol> 7. Sur colonne Peptide étiquetage par réductrice diméthylation (PENSER étiquetage) Effectuez cette étape sous une hotte chimique que le cyanure d&#39;hydrogène est libéré en faible concentration pendant le processus d&#39;étiquetage. <ol><li> Préparer 12 ml de tampons et de PENSER &quot;lourdes&quot; &quot;légères&quot; à la méthylation des amines peptide libre. Tampon de Redi lumière est constituée de 0,8% de formaldéhyde et 0,12 M cyanoborohydrure de sodium portant des atomes d&#39;hydrogène dans le eEIR naturelles distributions isotopiques dans le tampon d&#39;acide citrique. Tampon de Redi lourde est constituée de 0,8% de formaldehyde deutéré et 0,12 M de cyanoborohydrure de sodium deutéré dans un tampon d&#39;acide citrique. </li><li> Incuber colonne contenant des peptides par addition de 10 ml soit lumineux ou tampons de Redi lourd pour les colonnes contenant des peptides à raison de 1 ml / min et répéter à garantir un étiquetage complet. Laver la colonne avec 6 ml de TFA 0,1%, puis avec de l&#39;acide acétique à 1 ml de 0,5%. </li><li> Arrêter le vide et éluer les peptides marqués première avec 1 ml de 40% d&#39;ACN, de l&#39;acide acétique à 0,5%, puis avec 1 ml de 80% d&#39;ACN, de l&#39;acide acétique à 0,5% en utilisant un débit d&#39;environ 0,5 ml / min. Si vous le souhaitez, de mesurer l&#39;efficacité de l&#39;étiquetage des échantillons individuels par spectrométrie de masse avant de mélanger des échantillons lourds et légers (voir «Les résultats représentatifs&quot;). Mélanger 01:01 échantillons peptidiques lourdes et légères marqué pour être quantifiée par spectrométrie de masse. </li></ol> 8. Peptide indépendante Mélange de pH basique de la phase inversée (BPRP) de chromatographie &lt;/ P&gt; PH basique en phase inverse (BPRP) chromatographie pour séparer le mélange de peptide en plusieurs fractions, qui sont analysées indépendamment par LC-MS/MS pour augmenter la couverture du protéome. <ol><li> Fractionner le mélange de peptides sur une colonne HPLC C18 en appliquant un gradient de concentration croissante d&#39;ACN dans 10 mM de bicarbonate d&#39;ammonium (pH 8). Commencer avec 5% (v / v) pendant 5 min ACN, augmenter à 35% ACN en 60 min, puis à 90% d&#39;ACN en 1 min. Conserver la CAN de 90% pendant 4 minutes avant de réduire la CAN à 5% de ré-équilibrer la colonne de 9 min. Recueillir 96 fractions de volume égal à une plaque de 96 puits (A1 à H12). Surveiller le fractionnement à l&#39;aide d&#39;un détecteur UV à 220 nm tandis que les peptides sont élution de la colonne (10 à 70 min dans les conditions décrites ici). </li><li> Combiner les fractions à partir de puits A1, C1, E1, et G1 (fraction A1), à partir de puits B1, D1, F1, H1 et (fraction B1), à partir de puits A2, C2, E2, et G2 (fraction A2) et en conséquence pour l&#39; fractions restantes. Retirez le solvent en utilisant une centrifugeuse sous vide. peptides Remettre en suspension de fractions A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 et B12 dans 130 pi de 1 M urea/0.5% de TFA et purifier l&#39;aide StageTips comme décrit à l&#39;étape 9. magasin fractions B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11 et A12 à -20 º C. </li></ol> 9. Purify peptides par Stop and Go Extraction (StageTips) Préparer C18-StageTip 7 microcolonnes par emballage 200 conseils ul de pipettes avec deux C18 disques avec un diamètre interne (ID) de 1,07 mm. Mettez étape Conseils dans des tubes Eppendorf. Utilisez une micro à laver astuces avec 130 ul de méthanol, puis 130 ul de 80% d&#39;ACN, l&#39;acide acétique à 0,5%. Equilibrer StageTips avec 130 ul de 0,1% de TFA. Transfert mélange de peptides à StageTips et laver avec 130 ul de 0,1% de TFA, puis 40 ul de 0,1% de TFA, puis 40 ul d&#39;acide acétique à 0,5%. Éluer les peptides d&#39;abord avec 20 ul de 40% d&#39;ACN, de l&#39;acide acétique à 0,5%, puis 20 ul de 80% d&#39;ACN, de l&#39;acide acétique à 0,5%. Combinez éluats unend sec par filtration sous vide. 10. Microcapillaire LC-MS/MS <ol><li> Dissoudre dans peptides 1-5 ul d&#39;acide formique à 5%, 5% de ACN à une concentration d&#39;environ 1 pg / pl. Résoudre ~ 1 pg peptides sur une 100 um x 20 cm C18-inversés colonne de HPLC en phase avec un gradient de 6-22% d&#39;ACN dans de l&#39;acide formique 0,125% appliqué sur 75 ou 100 min à un débit de ~ 300 nl / min. </li><li> Identifier des peptides en utilisant un Orbitrap Velos LTQ 12 ou liquide similaire plate-forme de spectrométrie de masse chromatographie avec un spectromètre de masse offrant haute résolution et haute précision de masse. Fonctionner le spectromètre de masse en mode dépendant des données avec un plein MS balayage (résolution de 60000) acquise dans l&#39;analyseur Orbitrap. Générer piège à ions linéaire spectres MS / MS pour les 20 ions les plus abondants détectés dans le spectre MS plein. Régler la commande automatique de gain (AGC) de cibles à 1 x 10 6 pour la pleine MS et 2000 pour MS / MS. Réglez durées maximales d&#39;accumulation d&#39;ions à 1000 mspour MS et 150 ms pour MS / MS. Exclure ions précurseurs de peptides fragmentés de sélection supplémentaire à partir de MS / MS pour 20-60 sec. </li></ol> 11. Acquisition de données MS / MS Identifier des peptides en comparant les fichiers RAW spectres MS / MS à une base de données théoriques avec un algorithme tel que SEQUEST 8 à l&#39;aide de ces paramètres (tableau 1). Tableau 1. Peptidiques Base de données Paramètres de recherche. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600"><tbody><tr height="19"><td height="19" rowspan="3" style="height:19px;" width="180"> Paramètres généraux </td><td> digestion trypsique entièrement avec jusqu&#39;à deux clivages raté </td></tr><tr height="19"><td> 25 ppm d&#39;ions précurseur tolérance </td></tr><tr height="19"><td> 1,0 Da fragment tolérance d&#39;ions </td></tr><tr height="35"><td height="35" rowspan="2" style="height:36px;"> Modifications statiques </strong&gt; </td><td> 57,02146 Da sur la cystéine, carboxyamidomethylation </td></tr><tr height="19"><td> 28,03130 Da sur la lysine et le peptide N-terminal, l&#39;étiquette de diméthylation lumière </td></tr><tr height="19"><td height="19" rowspan="2" style="height:19px;"> Modifications dynamiques </td><td> 15,99491 Da sur la méthionine, l&#39;oxydation </td></tr><tr height="19"><td> 6,03766 Da sur la lysine et le peptide N-terminal, l&#39;étiquette de diméthylation lourde </td></tr></tbody></table><ol><li> Filtrer les peptides à un taux de faux positifs de 1% avec un procédé tel que le 9-stratégie de cible leurre en utilisant une base de données des cadres de lecture ouverts dans les orientations réelles et inversés. </li></ol> 12. Peptide Quantification Calculer les domaines de paires lourdes et légères de MS1 extraits ion chromatogrammes (zones de pointe MS1) et le peptide signal-sur-bruit (S / N) 10 rapports. Inclure paires peptidiques lorsque leur moyenne signal-noirapport est supérieur à cinq soi. Quantifier l&#39;abondance relative d&#39;un peptide dans les deux échantillons en tant que le rapport des aires des pics des versions MS1 lourdes et légères de la même peptide (MS1 de rapport de surface de pic). Calculer l&#39;abondance relative de la protéine comme étant le rapport de la MS1 surface du pic médian de tous les peptides dans la protéine.

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</ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents ou d&#39;autres conflits d&#39;intérêts.

Plusieurs points font stable marquage isotopique des peptides en utilisant une méthode intéressante pour la protéomique quantitative diméthylation réductrice (étiquetage PENSER): réactifs peu coûteux en matière d&#39;étiquetage (réactifs coûtent moins de 1 $ par échantillon), la vitesse de réaction rapide (~ 10 min), l&#39;absence de produits secondaires, hauts reproductibilité (figures 3, 4), produits de réaction stables, la capacité à utiliser toute la protéase, et une grande efficacité de l&#39;ionis...

Mesure des différences de concentration de nombreuses protéines entre les échantillons complexes est un défi central en protéomique. De plus en plus, ce qui est fait par marquage des protéines dans chaque échantillon avec des étiquettes isotopiques, combiner les échantillons, et l&#39;utilisation de la spectrométrie de masse pour quantifier les différences de concentration. Plusieurs méthodes existent pour marquage isotopique stable des protéines et des peptides. 15 N étiquetage 1 et 2 présentent SILAC marqueurs isotopiques métabolique in vivo, alors que iCAT 3, iTRAQ 4, et la réduction diméthylation 5 ajouter des tags sur les isotopes stables après extraction des protéines et la digestion. Parmi ces méthodes, diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) gagne en popularité comme une méthode reproductible peu coûteux à quantifier les différences de concentration de protéines dans presque n&#39;importe quel type d&#39;échantillon. Étiquetage Redi implique peptides réagissant avec du formaldéhyde pour former une base de Schiff, qui est ensuite réduitpar cyanoborohydrure. Cette réaction dimethylates groupes amino libres sur N-terminales et latérales de lysine chaînes et monomethylates ProLines N-terminaux. Le protocole décrit ici méthylation peptides dans l&#39;échantillon 1 avec une étiquette &quot;lumière&quot; en utilisant des réactifs avec des atomes d&#39;hydrogène dans leur distribution isotopique naturelle et de l&#39;échantillon 2 avec une étiquette &quot;lourd&quot; en utilisant du formaldéhyde et du cyanoborohydrure deutéré (Figure 1). Chaque groupe amino diméthylé sur un résultat de peptide dans une différence de masse de 6,0377 Da entre la lumière et les formes lourds, qui est utilisé pour distinguer les deux formes à l&#39;aide d&#39;un spectromètre de masse. Plus précisément, les abondances relatives des peptides sont quantifiées comme étant le rapport des aires de chromatogramme d&#39;ions MS1 extraites (MS1 de rapport de surface de pic) de la lumière et de la version lourde pour chaque paire d&#39;ions peptide. L&#39;abondance relative d&#39;une protéine est calculée comme le rapport médian MS1 ​​de surface de pic parmi tous les peptides dans la protéine. Dans ce rapport, nous décrivons un protocole robuste pour conduitement Redi expériences de marquage par LC-MS/MS qui comprend peptide extraction en phase inverse en phase solide, en colonne étiquetage de Redi, peptide fractionnement par pH basique en phase inverse (BPRP) Chromatographie, et la purification de mélanges de peptides à l&#39;aide StageTips (Figure 2) . Nous discutons des avantages et des limites de l&#39;utilisation étiquetage PENSER pour protéomique quantitative.

<table><tbody><tr><td>Acide trichloracétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9159</td><td>précipitation des protéines</td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td>précipitation des protéines</td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>dénature, réduire les protéines</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>dénaturer, réduire les protéines</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43816</td><td>dénaturer, réduire, alkylate protéine</td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase Complete Mini Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693124001</td><td>dénaturer, réduire les protéines</td></tr><tr><td>Iodoacétamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td>alkylate protein</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td>remettre, extraire, marquer protéine</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>Protéine de remise en suspension</td></tr><tr><td>Lysyl Endoprotéase</td><td>Wako Chemicals</td><td>129-02541</td><td>digestion des protéines</td></tr><tr><td>Séquençage grade trypsine Promega</td><td></td><td>V5111</td><td>digestion des protéines</td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>digestion des protéines</td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299537</td><td>Extraction peptidique en phase inverse</td></tr><tr><td>tC18 Sep-Pak C18 cartouches</td><td>Waters</td><td>WAT054960</td><td>Extraction peptidique en phase inverse</td></tr><tr><td>Collecteur d’extraction</td><td>Eaux</td><td>WAT200609</td><td>Extraction peptidique en phase inverse</td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14261</td><td></td></tr><tr><td>divers Formaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>" lumière" marquage peptidique</td></tr><tr><td>Cyanoborohydrure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71435</td><td>" lumière" marquage peptidique</td></tr><tr><td>Formaldéhyde deutéré</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492620</td><td>" lourd" marquage peptidique</td></tr><tr><td>Isotopes CDN</td><td>du cyanoborodeutéride de sodium</td><td>D-1797</td><td>" lourd" marquage peptidique</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>marquage peptidique</td></tr><tr><td>C18-HPLC colonne (4,6 x 250 mm, 5 & micro ; m taille des particules)</td><td>Agilent</td><td>770450-902</td><td>pH basique chromatographie en phase inversée</td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>399388</td><td>divers</td></tr><tr><td>disques C18 Empore</td><td>3M</td><td>14-386-3&nbsp ;</td><td>Conseils STAGE</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>494437</td><td>STAGE tips</td></tr></tbody></table>

protéomique quantitative à l&#39;aide réductrice diméthylation pour les isotopes stables étiquetage

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Stable marquage isotopique des peptides par diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) est une méthode pour quantifier avec précision les différences d&#39;expression des protéines entre les échantillons à l&#39;aide de la spectrométrie de masse. Étiquetage Redi est réalisée en utilisant soit régulière (lumière) ou deutérés formes (lourds) de formaldéhyde et cyanoborohydrure de sodium à ajouter deux groupes méthyle à chaque amine libre. Ici, nous démontrons un protocole robuste pour l&#39;étiquetage de Redi et la comparaison quantitative de mélanges complexes de protéines. Les échantillons de protéines pour la comparaison sont digérés en peptides, marqués à porter la lumière ou des étiquettes de méthyle lourds, mélangé, et co-analysés par LC-MS/MS. Les abondances relatives des protéines sont quantifiées en comparant les aires des pics du chromatogramme d&#39;ions de versions lourdes et légères marqués du peptide constituant extrait de la MS spectres complet. La méthode décrite ici comprend la préparation d&#39;échantillons par phase inverse extraction en phase solide, en colonne étiquetage de Redi de peptides, un peptide fractionnement par pH rev basephase ersed (BPRP) Chromatographie, et StageTip purification de peptide. Nous discutons des avantages et des limites de l&#39;étiquetage Redi par rapport à d&#39;autres méthodes pour l&#39;incorporation des isotopes stables. Nous soulignons de nouvelles applications utilisant l&#39;étiquetage PENSER comme une méthode rapide, peu coûteux et précis pour comparer l&#39;abondance de protéines dans presque n&#39;importe quel type d&#39;échantillon.

Nous avons évalué l&#39;exactitude, la précision et la reproductibilité de l&#39;étiquetage Redi utilisant Saccharomyces cerevisiae et Clostridium phytofermentans lysats de cellules entières. Nous avons d&#39;abord quantifié l&#39;étiquetage efficacité de Redi d&#39;un mélange de C phytofermentans lysats de protéines à partir de cellulose (lourde marqué, H) et le glucose (étiquette de la lumière, L) cultures. Lorsque filtré à un peptide taux de fausses découvertes de 1%, cet échantillon conten...

Stable marquage isotopique des peptides par diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) est une stratégie rapide et peu coûteuse pour la protéomique masse précises la spectrométrie quantitatifs. Ici, nous démontrons une méthode robuste pour la préparation et l&#39;analyse des mélanges de protéines à l&#39;aide de l&#39;approche de Redi qui peut être appliqué à pratiquement n&#39;importe quel type d&#39;échantillon.

Protéomique quantitative à l&#39;aide réductrice diméthylation pour les isotopes stables étiquetage

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

L'objectif général de cette procédure est de comparer les concentrations de nombreuses protéines entre des échantillons par spectrométrie de masse en utilisant la protéomique prête à l'emploi. Cela est réalisé en digérant d'abord la protéine provenant de chaque échantillon afin de générer des mélanges de peptides. Ensuite, les deux échantillons sont mélangés, et les peptides présents dans l'échantillon mixte sont fractionnés et désalinisés.Ensuite, l'échantillon mixte est analysé par spectrométrie de masse. Enfin, les peptides sont identifiés en comparant les deux spectres MS à une base de données cible-distracteur contenant tous les peptides potentiels présents dans les échantillons, et l'abondance relative des peptides entre les échantillons est quantifiée. En définitive, la protéomique rapide permet la quantification de l'abondance relative de nombreuses protéines entre des échantillons complexes.Les principaux avantages de la déméthylation réductrice par rapport à d'autres méthodes de marquage isotopique stable, comme iLite, sont que ready est une méthode rapide, peu coûteuse et précise qui ne nécessite ni trois spécifique ni milieu synthétique, ce qui signifie qu'elle peut êtr

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JoVE Journal

Chemistry

Chimie

13 C-marquage isotopique est une technique utile pour déterminer le métabolisme de la cellule centrale pour divers types de microorganismes. Après les cellules ont été cultivées sur un substrat spécifique marqué, GC-MS de mesure peut révéler des voies métaboliques fonctionnelles basées sur les modèles d'étiquetage unique dans protéinogènes acides aminés.

Confirmation des voies métaboliques et la découverte par 13 C-étiquetage des acides aminés protéinogènes

Réactif niveau de l'espèce d'oxygène est élevé lorsque les cellules rencontrent des conditions de stress. Ici, nous montrons l'exemple de la coloration diaminobenzidine 3'-3 'ainsi que l'étiquetage cysTMT et spectrométrie de masse pour établir le profil du protéome redox...

Profilage thiol redox du protéome par spectrométrie de masse isotopique de l&#39;étiquetage

Deux méthodes d’attribution des signaux de résonance magnétique nucléaire α- et ε-diméthylamine d’une lysine N-terminale 13C-méthylée réductrice sont décrites. Une méthode utilise la sélectivité induite par le pH de la réaction de méthylation réductrice, et l’autre utilise l’aminopeptidase pour éliminer sélectivement la lysine N-terminale.

Méthodes d’identification des résonances RMN de l’amine 13C-diméthyl N-terminale sur des protéines méthylées de manière réductrice

Ce protocole décrit comment effectuer des tests de quantification absolue de protéines cibles dans des échantillons biologiques complexes à l’aide d’une surveillance de réaction sélectionnée. Il a été utilisé pour quantifier avec précision les protéines de la voie de signalisation de la chimiotaxie des macrophages de souris. La sélection des peptides cibles, la mise au point d’essais et les essais qualitatifs et quantitatifs sont décrits en détail.

Selected Reaction Monitoring spectrométrie de masse pour Absolute quantification des protéines

marquage isotopique de précurseur combiné et le marquage isobare (cPILOT) est une stratégie de protéomique quantitative qui améliore les capacités de multiplexage échantillon d'étiquettes isobares. Ce protocole décrit l'application de cPILOT aux tissus à partir d'un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer et les contrôles de type sauvage.

Exemple amélioré Multiplexage de tissus à l&#39;aide combinée Precursor et étiquetage Isotopique isobarique Tagging (cPILOT)

Nous présentons un protocole visant à quantifier avec précision les protéines avec étiquetage isobare, vaste fractionnement, outils bioinformatiques et mesures de contrôle de la qualité en combinaison avec la chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse à haute résolution.

Profilage de Proteome profonde en étiquetage isobare, vaste chromatographie en phase liquide, spectrométrie de masse et Quantification assistée par logiciel

Nous présentons ici la quantification objective des protéines spécifiques au site acétylation et/ou succinylation occupation (stoechiométrie) un proteome ensemble grâce à une analyse logométrique de modifications endogènes aux modifications introduites après quantitative acylation chimique utilisant des anhydrides stables isotopes marqués. En combinaison avec la spectrométrie de masse sensibles acquisition indépendante des données, mesures d’occupation de site précis sont obtenus.

Quantification des protéines spécifiques au site Lysine acétylation et stoechiométrie Succinylation spectrométrie de masse indépendante des données Acquisition

Le protocole décrit fournit une analyse protéomique quantitative optimisée des échantillons de tissus à l’aide de deux approches : la quantification basée sur l’étiquette et la quantification sans étiquette. Les approches basées sur l’étiquette ont l’avantage d’une quantification plus précise des protéines, tandis qu’une approche sans étiquette est plus rentable et utilisée pour analyser des centaines d’échantillons d’une cohorte.

Flux de travail complet de protéomique des échantillons de tissus basée sur la spectrométrie de masse

La méthylation de l’arginine (R) est une modification post-traductionnelle généralisée régulant de multiples voies biologiques. La spectrométrie de masse est la meilleure technologie pour établir le profil global du R-méthyl-protéome, lorsqu’elle est couplée à des approches biochimiques pour l’enrichissement peptidique modifié. Le flux de travail conçu pour l’identification à haut niveau de confiance de la R-méthylation globale dans les cellules humaines est décrit ici.

Une approche protéomique basée sur la spectrométrie de masse pour l’analyse globale et à haut niveau de confiance de la R-méthylation des protéines

L’oxydation des protéines thiols a des implications significatives dans des conditions physiologiques et physiopathologiques normales. Nous décrivons les détails d’une méthode quantitative de protéomique redox, qui utilise la capture assistée par résine, le marquage isobare et la spectrométrie de masse, permettant l’identification et la quantification spécifiques au site des résidus de cystéine oxydés de protéines de manière réversible.

Capture assistée par résine couplée à un étiquetage de masse en tandem isobare pour la quantification multiplexée de l’oxydation des protéines thiols

Cet article décrit une méthode de préparation d’échantillons basée sur l’inactivation thermique pour préserver les peptides endogènes en évitant la dégradation post-mortem, suivie d’une quantification relative utilisant le marquage isotopique plus LC-MS.

Préparation des échantillons et quantification relative à l’aide de la méthylation réductrice des amines pour les études peptidomiques

Découvrez la protéomique quantitative par diméthylation réductive pour l'étiquetage isotopique stable. Cette méthode rapide et économique permet de quantifier les protéines par spectrométrie de masse dans divers échantillons complexes.

Protéomique quantitative à l'aide réductrice diméthylation pour les isotopes stables étiquetage

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