Protéomique quantitative à l'aide réductrice diméthylation pour les isotopes stables étiquetage

L'objectif général de cette procédure est de comparer les concentrations de nombreuses protéines entre des échantillons par spectrométrie de masse en utilisant la protéomique prête à l'emploi. Cela est réalisé en digérant d'abord la protéine provenant de chaque échantillon afin de générer des mélanges de peptides. Ensuite, les deux échantillons sont mélangés, et les peptides présents dans l'échantillon mixte sont fractionnés et désalinisés.

Ensuite, l'échantillon mixte est analysé par spectrométrie de masse. Enfin, les peptides sont identifiés en comparant les deux spectres MS à une base de données cible-distracteur contenant tous les peptides potentiels présents dans les échantillons, et l'abondance relative des peptides entre les échantillons est quantifiée. En définitive, la protéomique rapide permet la quantification de l'abondance relative de nombreuses protéines entre des échantillons complexes.

Les principaux avantages de la déméthylation réductrice par rapport à d'autres méthodes de marquage isotopique stable, comme iLite, sont que ready est une méthode rapide, peu coûteuse et précise qui ne nécessite ni trois spécifique ni milieu synthétique, ce qui signifie qu'elle peut être appliquée à presque tous les types d'échantillons. Pour commencer, préparez un milligramme de protéine cellulaire et 500 microlitres en utilisant la sonication ou une presse française pour lyser les cellules afin de précipiter les protéines. Ajoutez un volume d'acide trichloroacétique à quatre volumes de protéine et refroidissez sur de la glace pendant 10 minutes.

Centrifuger à 12 000 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et éliminer le surnageant. Ensuite, utiliser un millilitre d'acétone glacée pour resuspendre le culot avant de centrifuger une deuxième fois.

Après avoir aspiré le surnageant, séchez le culot dans un bloc chauffant à 56 degrés Celsius pour dénaturer les protéines et réduire les liaisons sulfure du colorant. Utilisez 500 microlitres de tampon de dénaturation et de réduction pour le reprendre. Remettez les protéines en suspension à environ deux milligrammes par millilitre.

Incuber les protéines pendant 30 minutes à 56 degrés Celsius, puis pendant 10 minutes à température ambiante. Pour alkyler les groupes sulfhydryles libres, ajouter 25 microlitres de iodoacétamide 0,3 molaire fraîchement préparé dans l'eau à 500 microlitres de protéine et incuber à l'obscurité pendant 20 minutes à température ambiante. Après l'incubation, arrêter la réaction en ajoutant 10 microlitres de DTT à 3 millimolaire.

Conservez les protéines alkylées à moins 80 degrés Celsius. Pour digérer les protéines alkylées après la précipitation par l'acide trichloroacétique, utilisez une solution d'urée un molaire dans 50 millimolaires de HEPES à pH 8,2 afin de resuspendre les protéines. Préparez une solution mère de Lys-C, d'endoprotéinase ou de ly C dans l'eau à une concentration de deux microgrammes par microlitre et ajoutez l'enzyme aux protéines digérées à une concentration finale de 10 nanogrammes par microlitre. Incubez les échantillons à température ambiante pendant six heures ou toute la nuit. Resuspendez 20 microgrammes de trypsine de qualité séquençage dans 40 microlitres d'acide acétique 50 millimolaire et ajoutez cinq microlitres à la réaction de digestion par le Lys-C.

Incuber pendant six heures à 37 degrés Celsius avec les protéines alkylées. Ajouter de l'acide trifluoroacétique ou TFA à une concentration finale de 0,5 %. Fixer une colonne C18 à un dispositif d'extraction. Ensuite, utiliser six millilitres d'acétonitrile ou ACN pour humidifier la colonne.

Ensuite, avec le débit le plus élevé possible, utilisez six millilitres de 80 % a CN 0,1 % TFA pour laver la colonne avant d'utiliser six millilitres de 0,1 % TFA pour équilibrer la colonne, arrêtez la pression sous vide et chargez 500 microgrammes de peptides sur la colonne à un débit d'environ un millilitre par minute. Une fois que les peptides sont liés à la colonne, réactivez le vide et, avec le débit le plus élevé possible, utilisez 0,1 % TFA suivi de trois millilitres de tampon d'acide citrique pour laver la colonne afin de réaliser la méthylation diméthylique réductrice ou le marquage prêt à l'emploi. Sous une hotte chimique, préparez 12 millilitres de tampons prêts à l'emploi légers et lourds chacun pour méthylater les peptides libres.

Ajouter 10 millilitres de tampon prêt à l'emploi, léger ou lourd, sur la colonne à un débit de un millilitre par minute. Après application d'une seconde aliquote de 10 millilitres, pour garantir le marquage, utiliser six millilitres de TFA à 0,1 %, suivis d'un millilitre d'acide acétique à 0,5 %.

Pour laver la colonne et éluer les protéines, arrêtez le vide et appliquez un millilitre de 40 % à un CN d'acide acétique 0,5 % à un débit de 0,5 millilitre par minute. Ajoutez ensuite un millilitre de 80 % à un CN d'acide acétique 0,5 %, en éluant avec une seringue de cinq millilitres si désiré. Mélangez les échantillons de peptides marqués lourds et légers selon un rapport un pour un et quantifiez-les par spectrométrie de masse afin de s'assurer que le marquage lourd et léger a été efficace. Fractionnez le mélange de peptides en l'appliquant d'abord sur une colonne C 18 HPLC.

Ensuite, après avoir utilisé 5 % de CN A pour laver la colonne pendant cinq minutes, appliquez un gradient de 5 à 35 % de CN A sur 60 minutes afin d'éluer les peptides en fractions égales. Dans une plaque de 96 puits, suivi de 90 % de CN A pendant une minute. Après quatre minutes supplémentaires de 90 % de CN A, utilisez 5 % de CN A pour rééquilibrer la colonne.

Ensuite, combiner les fractions de la manière suivante à l'aide d'un centrifugeuse à vide. Éliminer le solvant des fractions combinées. Puis utiliser 130 microlitres d'urée un molaire à 0,5 % de TFA pour la resuspension.

Suspendez les peptides provenant des fractions suivantes, et conservez l'ensemble des fractions à moins 20 degrés Celsius afin de réaliser une extraction stop and go sur les fractions resuspendues. Préparez des microcolonnes C18 à embout de type « stage tip » à partir de pointes de pipette de 200 microlitres en utilisant deux disques C18 d'un diamètre interne de 1,07 millimètre pour les tasser. Placez les embouts « stage tip » dans des tubes de microcentrifugeuse et ajoutez 130 microlitres de méthanol, puis effectuez une centrifugation.

Ensuite, ajouter 130 microlitres de 80 % ACN contenant 0,5 % d'acide acétique avant de centrifuger à nouveau après avoir utilisé 130 microlitres de TFA 0,1 % pour équilibrer les embouts, transférer le mélange de peptides vers les embouts et laver. D'abord avec 130 microlitres de TFA 0,1 %, suivis de 40 microlitres de TFA 0,1 %. Puis 40 microlitres d'acide acétique 0,5 % pour éluer les peptides.

Tout d'abord, ajoutez 20 microlitres de 40 % à un acide acétique à 0,5 %. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de 80 % à un acide acétique à 0,5 %. Combinez les IIT et le filtrat sous vide jusqu'à séchage pour effectuer une chromatographie liquide microcapillaire.

La spectrométrie de masse en tandem ou LC-MS-MS commence par l'utilisation d'acide formique à 5 % et d'ACN à 5 % pour resuspendre les protéines à une concentration d'environ un microgramme par microlitre. Appliquez environ un microgramme de peptides sur une colonne C18 en phase inverse de 100 micromètres par 20 centimètres et éluée à l'aide d'un gradient de 6 à 22 % d'ACN dans de l'acide formique 0,125 % à un débit d'environ 300 nanolitres par minute, appliqué sur une durée de 75 à 100 minutes.

Utilisez un spectromètre de masse à haute résolution et à haute précision de masse, et identifiez les peptides dans l'échantillon en comparant les fichiers bruts de spectres MS/MS à une base de données théorique à l'aide d'un algorithme tel que SEQUEST, en utilisant les paramètres indiqués ici avec la base de données des cadres de lecture ouverts dans les orientations directe et inverse. Filtrez les peptides à un taux de faux positifs de 1 % à l'aide d'une méthode telle que la cible piège. Pour quantifier les peptides identifiés, calculez les aires des paires lourdes et légères des chromatogrammes d'ions extraits en MS1 et les rapports signal sur bruit des peptides. N'incluez que les paires de peptides dont le rapport moyen signal sur bruit est supérieur à cinq. Quantifiez l'abondance relative d'un peptide dans les deux échantillons comme le rapport des aires des pics MS1 des versions lourde et légère du même peptide. Calculez les abondances protéiques relatives comme le rapport médian des aires des pics MS1 pour tous les peptides de la protéine, après filtration à un taux de faux positifs de 1 % au niveau peptide.

L'efficacité de marquage prête à l'emploi d'un mélange de c phyto ferment provenant de cultures marquées lourdes et légères contenant 11 194 séquences peptidiques uniques était de 98 %. Un lysat protéique visier non fractionné a été analysé de manière similaire. Les différences d'expression protéique reflètent de façon reproductible les rapports selon lesquels les échantillons lourds et légers ont été mélangés, sur une large gamme de rapports de mélange. Plus précisément, le changement d'abondance de 99 % des protéines était inférieur à 1,6 pour les échantillons mélangés un-à-un, ainsi que pour les échantillons dans des rapports un-à-dix et dix-à-un.

99 % des protéines se situaient à moins de 3,8 fois le rapport attendu, montrant une augmentation de l'écart type à distance plus grande d'un mélange un-à-un. Lorsque le marquage rapide a été appliqué au protéome de Clostridium phytofermentans, plus de 2000 protéines ont été quantifiées, 94 % des protéines mesurées se situant à moins du double pour des cultures réplicates croissant sur du glucose. Les variations observées pour les paires de cultures dupliquées étaient également fortement corrélées.

Ensemble, ces expériences montrent que la protéomique Ready est une méthode précise et reproductible pour quantifier les différences d'expression protéique entre des échantillons complexes. Étant donné que cette technique peut être appliquée à pratiquement tout type d'échantillon, elle a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la protéomique pour explorer les variations d'expression protéique dans toutes sortes d'échantillons, y compris des micro-organismes nouveaux, des cellules de poissons et de mammifères.