Amélioration de l’Application de poids moléculaire élevé biotinylé Dextran Amine pour la Projection de Thalamocortical suivi chez le Rat

L'objectif général de cette vidéo est de démontrer un protocole amélioré pour l'application de BDA de haut poids moléculaire afin d'étudier le marquage neuronal optimal dans le système nerveux central. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des réseaux neuronaux. En visualisant la structure en trame du marquage neuronal à travers les circuits neuronaux.

Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'initier l'étude des circuits neuronaux locaux et de leurs caractéristiques chimiques. Préparez une microsyringe d'un microlitre équipée d'une micropipette en verre, puis testez-la en aspirant du paraffine liquide. Après avoir anesthésié le rat selon un protocole approuvé, vérifiez une anesthésie profonde par l'absence de réaction à une pincée de la queue.

Ensuite, raser le sommet du crâne de l'animal à l'aide d'un rasoir électrique et nettoyer le site chirurgical avec de la bétadine à 10 %, suivie d'éthanol à 70 %. Fixer le rat sur l'appareil stéréotaxique en insérant des barres auriculaires contondantes dans les oreilles et en plaçant les incisives supérieures du rat dans le support buccal. Appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux.

Utilisez des gants chirurgicaux stériles et des champs opératoires pour maintenir les conditions stériles. Nettoyez à nouveau la peau de la tête au niveau du site chirurgical à l’aide d’éthanol à 70 %. Après avoir pratiqué une incision sagittale dans la peau à l’aide d’un scalpel, le long de la suture sagittale, utilisez des applicateurs stériles à embout en coton pour gratter le muscle et le périoste afin de les détacher du crâne.

À l'aide des coordonnées prédéfinies provenant d'un atlas, déterminer l'emplacement de la craniotomie. Réaliser une craniotomie à l'aide d'un foret à alése avec une mèche à extrémité ronde, en forant jusqu'à une profondeur d'environ un millimètre, jusqu'à ce que les méninges soient visibles. Enlever la dure-mère à l'aide de micro-forceps afin d'exposer le cortex cérébral au niveau du site d'injection.

Expulse le paraffine liquide de la microseringue, puis aspire une solution de BDA à 10 %. Monte la seringue sur l'appareil de microinjection et connecte la micropompe. Sous un microscope stéréo, manipule l'appareil de microinjection.

Insérez la micropipette en verre remplie dans le VPM par la surface corticale du cerveau, jusqu'à une profondeur de 5,8 millimètres. Ensuite, utilisez la micropompe pour injecter sous pression 100 nanolitres de BDA à 10 % dans le VPM, sur une période de trois minutes. Après cinq minutes, retirez lentement la pipette.

Refermer la plaie avec du fil stérile, puis placer le rat dans une zone de récupération chauffée, jusqu'à ce qu'il reprenne connaissance et soit complètement rétabli. Après l'euthanasie du rat, utiliser des ciseaux et une pince pour ouvrir la cavité thoracique du rat et accéder au cœur. Insérer un cathéter intraveineux dans le ventricule gauche, en direction de l'aorte, puis ouvrir l'oreillette droite.

Commencez par perfuser avec du sérum physiologique à 0,9 % à température physiologique, pendant environ une à deux minutes, jusqu'à ce que le sang sortant du cœur soit limpide. Ensuite, poursuivez avec 250 à 300 millilitres de paraformaldéhyde à 4 % dans un tampon phosphate 0,1 molaire. Post-fixez le cerveau disséqué dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant deux heures à température ambiante.

Ensuite, transférer le cerveau dans une solution de 30 % de saccharose dans du PBS 0,1 molaire et le cryoprotéger pendant trois jours à quatre degrés Celsius. Après trois jours, lorsque le cerveau a coulé dans la solution, diviser le cerveau en trois blocs dans le sens coronal à l’aide d’une matrice cérébrale. Le bloc central contient le noyau ventropostéro-médian du thalamus dans le cortex somatosensoriel primaire.

Monter le bloc central du cerveau sur la platine de congélation du microtome glissant pour la coupe en plan coronal et sectionner à 40 micromètres une fois congelé. Récolter les sections dans une boîte à six puits contenant du PBS 0,1 molaire. Commencer la coloration en rinçant les sections dans du PBS 0,1 molaire pendant environ une minute sous agitation.

Transférez ensuite les sections dans une solution mixte de streptavidine-AF594 et de colorant Nissl fluorescent vert AF500/525 dans du PBS 0,1 molaire contenant 0,3 % de Triton X-100, puis incubez pendant deux heures à température ambiante. Après la coloration, lavez les sections trois fois dans du PB 0,1 molaire avec agitation. Montez les sections sur des lames de microscope en utilisant des techniques histochimiques standard.

Laisser sécher les sections à l'air pendant environ une heure. Appliquer 50 % de glycérine dans de l'eau distillée sur les sections thorescentes et couvrir avec une lamelle avant d'acquérir les images des lames. Cette photomicrographie représentative montre le site d'injection de la BDA en rouge dans le noyau ventropostérieur médian du thalamus, sur fond de coloration Nissl verte.

L'étiquetage BDA thoréscence est montré ici, incluant les axones thalamocorticaux dans la couche quatre et les neurones thalamiques corticaux dans les couches cinq et six. À titre de comparaison, cette photomicrographie démontre que l'étiquetage BDA conventionnel, réalisé à l'aide d'une procédure standard de peroxydase avidine-biotine, révèle un motif similaire d'étiquetage neuronal à celui de l'étiquetage BDA thoréscence. Cette vue à plus fort grossissement d'une section marquée au BDA thoréscence montre en détail les arborisations axonales marquées de façon antérograde, en rouge.

Le corps cellulaire neuronal marqué de façon rétrograde, ainsi que les dendrites et les épines dendritiques, sont montrés ici en détail. Une fois maîtrisées, la craniotomie et l'injection stéréotaxique peuvent être réalisées en 20 à 30 minutes, si elles sont effectuées correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment appliquer le DAB de haut poids moléculaire afin de révéler les connexions neuronales et la structure détaillée du marquage neuronal.