Amélioration de l’Application de poids moléculaire élevé biotinylé Dextran Amine pour la Projection de Thalamocortical suivi chez le Rat

L’objectif général de cette vidéo est de démontrer un protocole affiné pour l’application de BDA de haut poids moléculaire pour l’étude du marquage neuronal optimal dans le système nerveux central. Cette mesure peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des réseaux neuronaux. En visualisant la structure du cadre du marquage neuronal à travers les circuits neuronaux.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre la possibilité de démarrer des circuits neuronaux locaux et leurs caractéristiques chimiques. Préparez une microseringue d’un microlitre, équipée d’un micropipet en verre, et testez-la en prélevant de la paraffine liquide. Après avoir anesthésié le rat à l’aide d’un protocole approuvé, confirmez l’anesthésie profonde par l’absence de réaction à un pincement de la queue.

Ensuite, rasez le haut de la tête de l’animal avec un rasoir électrique et frottez le site chirurgical avec 10 % de povidone iodée, suivie de 70 % d’éthanol. Fixez le rat dans le dispositif stéréotaxique en insérant des barres d’oreille émoussées dans les oreilles et en plaçant les incisives supérieures du rat dans le support buccal. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux.

Utilisez des gants chirurgicaux et des champs stériles pour maintenir des conditions stériles. Nettoyez à nouveau la peau de la tête du site chirurgical avec de l’éthanol à 70 %. Après avoir pratiqué une incision sagittale dans la peau à l’aide d’un scalpel, le long de la suture sagittale, utilisez des applicateurs stériles à bout de coton pour gratter le muscle et le périoste du crâne.

À l’aide des coordonnées prédéfinies d’un atlas, déterminez l’emplacement de la craniotomie. Effectuez une craniotomie à l’aide d’une perceuse à meules avec un embout à bout rond pour forer à une profondeur d’environ un millimètre jusqu’à ce que les méninges soient visibles. Exciser la dure-mère à l’aide d’une micro-pince pour exposer le cortex cérébral sur le site d’injection.

Expulsez la paraffine liquide de la microseringue, puis prélevez une solution de BDA à 10 %. Montez la seringue dans l’appareil de micro-injection et connectez la micropompe. Sous un stéréomicroscope, manipulez l’appareil de micro-injection.

Insérez la micropipette en verre rempli dans le VPM à travers la surface corticale du cerveau, jusqu’à une profondeur de 5,8 millimètres. Ensuite, utilisez la micropompe pour injecter sous pression 100 nanolitres de 10 % de BDA dans le VPM, sur une période de trois minutes. Au bout de cinq minutes, retirez lentement la pipette.

Suturez la plaie avec du fil stérile, puis placez le rat dans une zone de récupération chaude, jusqu’à ce qu’il reprenne conscience et soit complètement rétabli. Après avoir euthanasié le rat, utilisez des ciseaux et des pinces pour ouvrir la cavité thoracique du rat et accéder au cœur. Insérez un cathéter intraveineux dans le ventricule gauche, vers l’aorte, puis ouvrez l’oreillette droite.

Tout d’abord, perfuser avec une solution saline à 0,9 % à température physiologique, pendant environ une à deux minutes, jusqu’à ce que le sang sortant du cœur soit clair. Et puis continuez avec 250 à 300 millilitres de paraformaldéhyde à 4 %, dans un tampon de phosphate à 0,1 molaire. Post-fixez le cerveau disséqué dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant deux heures à température ambiante.

Ensuite, transférez le cerveau à 30 % de saccharose dans 0,1 molaire de PBS et cryoprotect pendant trois jours à quatre degrés Celsius. Après trois jours, lorsque le cerveau s’est enfoncé dans la solution, divisez le cerveau en trois blocs dans le sens coronal à l’aide d’une matrice cérébrale. Le bloc central contient le noyau postéromédian ventral du thalamus dans le cortex somatosensoriel primaire.

Montez le bloc central du cerveau sur la platine de congélation du microtome coulissant pour la coupe dans le plan coronal et la section à 40 microns lorsqu’il est congelé. Rassemblez les sections dans un plat à six puits, contenant 0,1 molaire de PBS. Commencez la coloration en rinçant les sections dans du PBS 0,1 molaire pendant environ une minute avec un balancement.

Transférez ensuite les sections dans une solution mixte de streptavidine-AF594 dans une coloration fluorescente Nissl verte AF500/525 dans du PBS 0,1 molaire contenant 0,3 % de Triton X-100, et incubez pendant deux heures à température ambiante. Après la coloration, lavez les sections trois fois en PB molaire 0,1 avec bascule. Montez les coupes sur les lames de microscope à l’aide de techniques histochimiques standard.

Faites sécher les sections à l’air libre pendant environ une heure. Appliquez 50 % de glycérine dans de l’eau distillée sur les sections thorescentes et couvrez-les avant d’imager les lames. Cette photomicrographie représentative montre le site d’injection de BDA en rouge du noyau postéromédial ventral du thalamus sur fond de coloration verte de Nissl.

marquage thorescent du BDA est montré ici, y compris les axones du corticol thalamylique dans la couche quatre et les neurones thalamiques corticaux dans les couches cinq et six. À titre de comparaison, cette photomicrographie démontre que le marquage conventionnel du BDA avec une procédure standard d’avidine-biotine peroxydase révèle un modèle similaire de marquage neural au marquage thorescent du BDA. Cette vue à plus fort grossissement d’une section thorescente marquée BDA montre les arborescences axonales marquées antérogradement en détail, en rouge.

Le corps cellulaire neuronal marqué rétrogradement, les dendrites et les épines dendritiques sont montrés en détail ici. Une fois maîtrisées, la craniotomie et l’injection stéréotaxique peuvent être effectuées en 20 à 30 minutes, si elles sont effectuées correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’appliquer du BDA de haut poids moléculaire pour raviver les connexions neuronales et la structure détaillée du marquage neuronal.