Juxtasomal Biocytin étiquetage pour étudier la structure-fonction de relation corticale individuelle neurones

L'objectif général de cette procédure est de relier l'activité potentielle d'action spécifique aux types cellulaires dans le cortex sensoriel pendant le traitement de l'information à l'identité morphologique des neurones enregistrés. Cela est réalisé en préparant d'abord chirurgicalement le rat pour des enregistrements juxta-somatiques. Une fois la préparation terminée, une électrode enregistre l'activité spontanée et induite par un stimulus sensoriel, et le neurone enregistré est chargé avec de la biocytine à l'aide de courant et d'injections.

Ensuite, le cerveau est traité pour la coloration par la biotine. Enfin, le neurone marqué par la biotine est reconstruit numériquement à partir de sections consécutives afin de classifier le type cellulaire. En définitive, les enregistrements juxta-somatiques de neurones individuels permettent l'étude du traitement sensoriel et des informations structurelles au sein du réseau cortical.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en neurosciences, comme quel est le rôle des différents types cellulaires et des couches pendant le traitement sensoriel ? En général, les personnes ayant besoin de cette méthode éprouvent des difficultés, car il est très facile de tuer les neurones durant la procédure de remplissage. Les chances de réussite du remplissage par biocytine augmentent grâce à la préparation de pipettes de qualité optimale, et par ailleurs, une observation expérimentée est nécessaire pour contrôler les injections de courant à bande étroite.

Par conséquent, il faut de l'expérience pour augmenter le taux de réussite de récupération de neurones bien remplis. Commencez par placer un rat wistar anesthésié sur un cadre stéréotaxique équipé d'un tapis chauffant. Confirmez la profondeur de la sédation en testant le réflexe de pincement des orteils.

Insérez ensuite une sonde rectale pour maintenir la température corporelle adéquate. Immobilisez la tête de l'animal et rasez les poils au niveau du site chirurgical. Appliquez un onguent sur les yeux afin d'éviter le dessèchement.

Attendre trois à cinq minutes après l'injection de lidocaïne au site opératoire, puis retirer la peau recouvrant la surface du crâne. Ensuite, éliminer tout tissu résiduel et nettoyer soigneusement le crâne avec du chlorure de sodium à 0,9 %. Déterminer les coordonnées du cortex somatosensoriel primaire de l'hémisphère gauche et marquer l'emplacement sur le crâne à l'aide d'un stylo marqueur chirurgical.

Utilisez une fraise dentaire pour gratter l'os provenant de la région d'intérêt. Poursuivez le grattage jusqu'à ce que l'os devienne transparent et que les vaisseaux sanguins soient clairement visibles. Ensuite, découpez une petite fenêtre dans le crâne mince à l’aide d’un scalpel.

En prenant soin de ne pas endommager la dure-mère et les vaisseaux sanguins. Marquer les bords de la craniotomie à l’aide d’un stylo marqueur chirurgical. Pour améliorer la visibilité, appliquer une fine couche de colle cyanoacrylate sur le crâne sec, puis du ciment dentaire afin de construire un bain.

Lors de la fermeture de la craniotomie, couper les vibrisses du côté controlatéral à exactement cinq millimètres afin d'en faciliter la visibilité. Mettre en évidence les vibrisses coupées à l'aide de mascara noir avant de commencer les enregistrements. Préparer les pipettes de patch à partir de verre Boro Silicic. La morphologie idéale de la pipette présente un affinement progressif et mince, un angle de cône faible et un diamètre interne de l'extrémité d'environ un micron.

Chargez la pipette de patch avec du ringer rad normal, supplémenté avec 2 % de biotine, puis montez la pipette de patch sur un support de pipette fixé à une tête porte-électrode et raccordé à un micromanipulateur. Pour cibler spécifiquement la colonne D deux du S un du rat, réglez l'angle du support d'électrode à 34 degrés par rapport au plan sagittal. Ensuite, positionnez la pipette de patch à proximité immédiate de la craniotomie.

Remplir le bain avec du chlorure de sodium à 0,9 %. En mode pont avec l'amplificateur, appliquer des impulsions carrées avec injection de courant positif pour déterminer la résistance de l'électrode. La résistance d'électrode optimale se situe entre trois et cinq méga.

Établir une surpression de 100 à 150 millibars et avancer la pipette de patch par pas d'un micron tout en appliquant un courant positif sous forme d'impulsions carrées. Surveiller le changement net de résistance lors de l'établissement du contact avec la dure-mère. À ce stade, régler les coordonnées du micromanipulateur à zéro afin de permettre des mesures de profondeur précises.

Avancez en mode pas de un micron jusqu'à ce que la pipette de patch pénètre la dure-mère, indiqué par une chute soudaine de la résistance de l'électrode. Supprimez la pression de maintien de la pipette. Ensuite, recherchez des unités individuelles tout en avançant par pas de un micron.

Surveillez continuellement la résistance de l'électrode en appliquant des impulsions de 200 millisecondes activées et désactivées ; une augmentation de la résistance de l'électrode indique généralement la proximité d'un neurone unique. Avancez l'électrode jusqu'à ce que des potentiels d'action de forme positive d'environ deux millivolts soient enregistrés. En option, enregistrez l'activité spontanée de décharge et déterminez l'activité de décharge liée aux vibrisses en déviant délicatement les vibrisses individuelles à l'aide d'un dispositif piézoélectrique afin d'obtenir des conditions optimales pour le remplissage juxtapérikaryotique.

Faire avancer l'électrode jusqu'à ce que la résistance soit comprise entre 25 et 35 mégohms et que les pics aient des amplitudes de trois à huit millivolts pour commencer le remplissage juxtapérikaryotique. Appliquer des impulsions de courant carrées positives en partant d'un nanoampère.

Augmentez lentement et progressivement le courant par paliers de 0,1 nanoampère tout en surveillant la forme d'onde et la fréquence des potentiels d'action. Surveillez l'ouverture membranaire par une augmentation nette de la fréquence des potentiels d'action pendant la phase « on » de l'impulsion de blocage ; la forme d'onde des pics lors du remplissage montre une largeur accrue et une hyperpolarisation post-synaptique réduite. Augmentez ou diminuez le courant pendant le remplissage afin de maintenir une perfusion stable de biotine, réduisez ou interrompez les impulsions de courant en cas d'augmentation soudaine de la fréquence des potentiels d'action, afin d'éviter une toxicité due à un excès d'entrée d'ions extracellulaires tels que les ions sodium.

Il est important de noter que chaque neurone réagira différemment au processus de remplissage. Par conséquent, les paramètres d'étiquetage juxta-somal doivent être ajustés en fonction des conditions d'enregistrement. Surveillez attentivement le signal après l'arrêt de l'injection de courant.

La forme du pic après une session de remplissage est généralement élargie et présente une hyperpolarisation post-synaptique fortement réduite, attendant la récupération du neurone, ce qui est visible lorsque la forme du pic retrouve ses propriétés initiales, afin de réduire toute contrainte mécanique exercée sur la cellule. Retracter la pipette de patch par paliers d’un micron jusqu’à ce que l’amplitude du pic diminue, puis attendre au moins une heure afin de permettre la diffusion intracellulaire de la biotine, tout en surveillant attentivement la température corporelle et la respiration de l’animal. Enfin, des échantillons cérébraux sont obtenus et traités afin de révéler la qualité du marquage juxtapérikarymatique.

Ces images montrent des neurones remplis par juxtaposition dans le cortex somatosensoriel primaire. Cette vue tangentielle d’un neurone paramétal met en évidence la différence de taille entre les dendrites et les axones. Dans cette reconstruction numérique d’un neurone marqué par juxtaposition somalienne, l’image de la projection neuronique est présentée à haute résolution, mais faible grossissement, avec une reconstruction numérique automatisée superposant l’axone en bleu et la dendrite en rouge respectivement.

Ici, la région de la boîte est agrandie pour montrer le bouton axonal sur toute la longueur de l'axone. Dans cette dernière animation, nous illustrons le pipeline de reconstruction pour un neurone épais ramifié de couche cinq du cortex somatosensoriel primaire du rat. Ce pipeline comprend la reconstruction de la morphologie dendritique et axonale à un grossissement de 100 fois et des contours des barils à un grossissement de 4 fois.

Le résultat est une reconstruction 3D complète, qui est par la suite recalibrée dans un repère standardisé afin d'effectuer une analyse quantitative des caractéristiques morphologiques. Ainsi, le marquage juxtapérikaryotique in vivo permet une qualité de marquage exceptionnelle pour une reconstruction fiable de la morphologie 3D complète. Ici, nous avons présenté la méthode sur des animaux anesthésiés à l'uréthane.

Cependant, les enregistrements juxta-somatiques peuvent également être utilisés chez des animaux éveillés maintenus en place par la tête afin d'étudier le rôle de types cellulaires et de couches spécifiques pendant l'exploration active de l'environnement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez mieux comprendre comment réaliser l'étiquetage au Biocidin sur des neurones individuels en vue de leur identification post mortem et de la reconstruction morphologique.