Juxtasomal Biocytin étiquetage pour étudier la structure-fonction de relation corticale individuelle neurones

L’objectif global de cette procédure est de relier le pic de potentiel d’action spécifique au type de cellule dans le cortex sensoriel pendant le traitement de l’information à l’identité morphologique des neurones enregistrés. Ceci est accompli en préparant d’abord chirurgicalement le rat pour les enregistrements juxta somal. Une fois préparée, une électrode enregistre l’activité spontanée et sensorielle évoquée, et le neurone enregistré est chargé de biocidine à l’aide de courant et d’injections.

Ensuite, le cerveau est traité pour la coloration à la biotine. Enfin, le neurone rempli de biotine est reconstruit numériquement à partir de coupes ultérieures pour la classification du type cellulaire. En fin de compte, les enregistrements juxtasomaux de neurones individuels permettent d’étudier le traitement sensoriel et les informations structurelles au sein du réseau cortical.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en neurosciences, telles que quel est le rôle des types et des couches cellulaires individuels pendant le traitement sensoriel ? En général, les personnes qui ont besoin de cette méthode auront du mal car il est très facile de tuer les neurones pendant la procédure de remplissage. Les chances de réussite du remplissage de biocidine sont augmentées par la préparation de pipettes de qualité optimale, et en outre, un œil exercé est nécessaire pour contrôler les injections de courant à bande étroite.

Par conséquent, il faut de l’expérience pour augmenter le taux de réussite de la récupération des neurones bien remplis. Pour commencer, placez un rat wistar anesthésié sur un cadre stéréotaxique équipé d’un coussin chauffant. Confirmez la profondeur de la sédation en testant le réflexe de pincement des orteils.

Insérez ensuite une sonde rectale pour maintenir la bonne température corporelle. Fixez la tête de l’animal et retirez les poils du site chirurgical. Appliquez une pommade sur les yeux pour prévenir le dessèchement.

Attendez trois à cinq minutes après l’injection de lidocaïne sur le site de l’opération et retirez la peau recouvrant la surface du crâne. Ensuite, nettoyez tous les tissus restants et nettoyez soigneusement le crâne avec du chlorure de sodium à 0,9 %. Déterminez les coordonnées du cortex somatosensoriel primaire sur l’hémisphère gauche et marquez l’emplacement sur le crâne avec un marqueur cutané chirurgical.

Utilisez une fraise dentaire pour gratter l’os de la région d’intérêt. Continuez à gratter l’os jusqu’à ce qu’il devienne transparent et que les vaisseaux sanguins soient clairement visibles. Ensuite, découpez une petite fenêtre dans le crâne mince avec un scalpel.

En prenant soin de ne pas endommager la dure-mère et les vaisseaux sanguins. Marquez les bords de la craniotomie à l’aide d’un marqueur cutané chirurgical. Pour améliorer la visibilité, appliquez une fine couche de super colle sur le crâne sec, puis du ciment dentaire pour construire un bain.

En fermant la craniotomie, coupez les moustaches du côté controlatéral à exactement cinq millimètres pour améliorer leur visibilité. Mettez en valeur les moustaches taillées avec du mascara noir avant de commencer les enregistrements, faites des pipettes patch en verre Boro Silicic. La morphologie idéale de la pipette est un cône mince et progressif, un faible angle de cône et un diamètre de pointe intérieur d’environ un micron.

Chargez la pipette patch avec une bague rad normale, complétée par 2 % de biotine, et montez la pipette patch sur un support de pipette, fixé à un étage de tête et connecté à un manipulateur microm. Pour cibler spécifiquement la colonne D deux de rat S un, réglez l’angle du porte-électrode à 34 degrés par rapport au plan sagittal. Ensuite, placez la pipette patch à proximité de la craniotomie.

Remplissez le bain avec du chlorure de sodium à 0,9 %. Avec l’amplificateur en mode pont, appliquez des impulsions carrées avec injection de courant positif pour déterminer la résistance de l’électrode. La résistance optimale de l’électrode se situe entre trois et cinq méga.

Établissez une surpression de 100 à 150 millibars et faites avancer la pipette patch par pas d’un micron tout en appliquant un courant positif sous forme d’impulsions carrées. Surveillez le changement de résistance robuste lors de l’établissement d’un contact avec la dure-mère. À ce stade, réglez les coordonnées du micromanipulateur à zéro pour permettre des mesures de profondeur précises.

Avancez en mode pas d’un micron jusqu’à ce que la pipette patch pénètre la dure-mère indiquée par une chute soudaine de la résistance de l’électrode. Retirez la pression de maintien de la pipette. Ensuite, recherchez des unités uniques tout en avançant par pas d’un micron.

Surveillez en permanence la résistance de l’électrode en appliquant 200 millisecondes sur les impulsions d’arrêt et l’augmentation de la résistance de l’électrode indique généralement la proximité d’un seul neurone qui avance l’électrode jusqu’à ce qu’elle soit positive. Des formes d’onde potentielles d’environ deux millivolts sont enregistrées. Enregistrez éventuellement l’activité de dopage spontanée et déterminez l’activité de dopage des moustaches révoquées en déchiquetant dignolément les moustaches individuelles à l’aide d’un appareil pizo électrique pour obtenir des conditions optimales pour le remplissage juxta-somal.

Avancez l’électrode jusqu’à ce que la résistance soit de 25 à 35. Les méga ohms et les pointes ont des amplitudes de trois à huit millivolts pour commencer le remplissage juxta. Appliquez des impulsions de courant carré positives à partir d’un nanoampère.

Augmentez lentement et progressivement le courant par pas de 0,1 nanoampères tout en surveillant la forme et la fréquence de l’onde AP. Surveillez l’ouverture de la membrane comme une nette augmentation de la fréquence AP pendant la phase de mise en marche de l’impulsion de bloc la forme d’onde de pointe pendant le remplissage montre une largeur accrue et réduite après l’hyperpolarisation augmenter ou diminuer le courant pendant le remplissage pour maintenir une perfusion de biotine stable, réduire ou arrêter les impulsions actuelles lors d’une augmentation soudaine de la fréquence AP. Pour éviter la toxicité par un afflux excessif d’ions extracellulaires tels que les ions sodium.

Il est important de noter que chaque neurone réagira différemment à la procédure de remplissage. Par conséquent, les paramètres de marquage juxta somal doivent être ajustés en fonction des conditions d’enregistrement. Surveillez de près le signal après l’arrêt de l’injection de courant.

La forme d’onde de pointe après une séance de remplissage est généralement élargie et montre une attente après hyperpolarisation fortement réduite pour la récupération du neurone, ce qui est apparent lorsque la forme d’onde de pointe revient à ses propriétés d’origine pour réduire toute contrainte mécanique sur la cellule. Rétractez la pipette patch par pas d’un micron jusqu’à ce que l’amplitude du pic diminue, attendez au moins une heure pour que la biotine se diffuse intracellulaire tout en surveillant de près la température corporelle et la respiration de l’animal. Enfin, des échantillons de cerveau sont prélevés et traités pour révéler la qualité du marquage juxtasomal.

Ces images montrent des images de neurones remplis juxta-médialement dans le cortex somatosensoriel primaire. Cette vue tangentielle d’un neurone paramétallique démontre la différence de taille entre les dendrites et les axones. Dans cette reconstruction numérique d’un neurone marqué en somali juxta, l’image de projection du neurone est montrée à haute résolution, mais à faible grossissement, et avec une reconstruction numérique automatisée superposée à l’axone en bleu et à la dendrite en rouge respectivement.

Ici, la région de la boîte est élargie pour montrer le bhuton de l’axone sur toute la longueur de l’axone. Dans cette dernière animation, nous illustrons le pipeline de reconstruction d’un neurone paramétallique touffu de couche cinq d’épaisseur à partir du cortex somatosensoriel primaire du rat. Le pipeline implique la reconstruction de la morphologie dendritique et axonale à un grossissement de 100 fois et des contours du canon à un grossissement de quatre fois.

Le résultat est une reconstruction 3D complète, qui est ensuite enregistrée dans un cadre de référence standardisé pour effectuer une analyse quantitative des caractéristiques morphologiques. Ainsi, le marquage juxta somal in vivo permet une qualité de marquage exceptionnelle pour une reconstruction fiable de la morphologie 3D complète. Ici, nous avons montré la méthode chez des animaux anesthésiés à l’uréthane.

Cependant, les enregistrements Jux Somal peuvent également être utilisés chez des animaux à la tête immobilisée pour étudier le rôle des types et des couches de cellules individuelles lors de l’exploration active de l’environnement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une meilleure compréhension de la façon d’effectuer le marquage de la biocidine sur des neurones individuels pour l’identification d’après-guerre et la reconstruction morphologique.