Etiquetage des neurones ciblés dans une fonction spécifique à micro-domaine du néocortex par combinaison du signal intrinsèque et à deux photons d'imagerie

L’objectif global de cette procédure est de cibler précisément des micro-domaines dans une carte fonctionnelle pour étudier la structure et la fonction des neurones à haute résolution. Ceci est accompli en effectuant d’abord une imagerie du signal intrinsèque sur une grande zone du cortex pour obtenir une carte de la caractéristique de stimulus d’intérêt. La deuxième étape consiste à déterminer l’emplacement précis sur la carte qui doit être ciblé pour l’imagerie haute résolution aux photons.

Ensuite, après avoir soigneusement positionné la pipette chargée de colorant fluorescent, les neurones sont marqués avec le marqueur fluorescent. Enfin, des images à haute résolution aux photons des réponses ou des structures neuronales sont collectées. En fin de compte, une carte de caractéristiques de signal intrinsèque peut être utilisée pour trouver une région d’intérêt, telle qu’une singularité d’orientation en moulinet qui peut ensuite être ciblée pour être étudiée à la résolution d’un seul neurone.

Le principal avantage de ce protocole est que l’on peut imager le cortex à différentes échelles spatiales en utilisant la même configuration de microscope avec seulement quelques ajustements rapides du système. Cela permet de combiner ces techniques pour utiliser la carte du signal intrinsèque de résolution de course comme guide pour choisir une région de neurones à marquer avec des sondes fluorescentes pour l’imagerie à haute résolution. L’animal a été anesthésié conformément à un protocole approuvé par un comité institutionnel de soins aux animaux, et le crâne a été exposé et nettoyé.

Le mélange de ciment dentaire a été utilisé pour fixer une plaque de tête en acier inoxydable avec une ouverture rectangulaire au centre du crâne. Une chambre métallique sur le dessus de la plaque de tête sert de réservoir pour l’imagerie avec l’objectif à immersion dans l’eau. La plaque de tête a été fixée sur une platine XY à l’aide de poteaux métalliques.

Utilisez une perceuse dentaire pour amincir une grande zone d’os dans l’ouverture rectangulaire de la plaque de tête. L’application de cires osseuses était nécessaire pour arrêter les saignements occasionnels. La zone mince doit s’étendre au-delà des limites de la craniotomie prévue.

Ensuite, percez un contour carré de deux millimètres sur deux dans l’os pour la craniotomie. Rincez périodiquement la chambre avec du liquide céphalo-rachidien artificiel frais pour éliminer les éclats d’os et minimiser la dissipation de chaleur vers le cortex sous-jacent. Maintenant, soulevez l’os avec une pince numéro trois.

À l’aide d’une pince numéro cinq et de ciseaux à ressort Vana, vous pouvez retirer les couches supérieures de la dure-mère, en laissant la couche inférieure intacte. La dernière couche de dura est transparente et les récipients de pelage doivent être clairement visibles à travers celle-ci. Appliquez une goutte d’aéros tiède à 2 % dissous dans un LCR et placez immédiatement un verre de protection sur la craniotomie.

Tout d’abord, une mousse de gel imbibée d’un LCR autour de l’extérieur du verre de couverture pour empêcher les agros de sécher lors de l’imagerie du signal intrinsèque. Fixez ensuite la caméra CCG d’imagerie du signal intrinsèque au port de monture C standard sur le dessus des deux microscopes photo et placez une source lumineuse éclairante sur la table à air près de la position de la platine XY et fixez le guide de lumière sur la craniotomie. Rétractez le dichroïque primaire et le miroir sous le port du mont sous-marin afin que la lumière rouge réfléchie nécessaire aux signaux intrinsèques passe directement de la craniotomie à la caméra CCD.

Insérez un filtre infrarouge dans le trajet de la lumière pour empêcher le cortex de chauffer. Placez ensuite un filtre qui laisse passer la lumière verte et enregistrez une image de référence numérique des vaisseaux sanguins de la surface corticale. Ensuite, déplacez le foyer Z à 500 microns sous la surface corticale.

Remplacez le filtre vert par un filtre rouge pour éclairer le cortex afin de mesurer les signaux intrinsèques. Assurez-vous que le cortex est uniformément éclairé. Protégez la craniotomie de la lumière produite par l’affichage des stimuli visuels et présentez une séquence de stimuli visuels et enregistrez des images de données de réflectance pour générer une carte d’orientation Dans les 10 minutes, collectez des données correspondant à quatre répétitions d’une séquence de huit stimuli avec quatre orientations et deux directions pour chaque orientation.

Analysez maintenant les données du signal intrinsèque pour générer une carte de couleurs de fausse orientation, comme on le voit ici. Sélectionnez ensuite les régions cibles potentielles pour le marquage à deux photons des neurones. Par exemple, l’orientation des singularités en moulinet pointe dans la carte l’endroit où convergent toutes les orientations préférées.

Ensuite, superposez la carte d’orientation et l’image du système vasculaire de la surface corticale et utilisez la disposition des domaines fonctionnels et l’emplacement des gros vaisseaux de surface pour sélectionner une cible, en évitant les emplacements avec de gros vaisseaux sanguins et artériels. Préparez les solutions fluorescentes D et tirez une pipette à cône long conformément aux instructions du protocole écrit. Chargez cinq microlitres du mélange de colorant dans la pipette.

Retirez ensuite la dernière couche de dure-mère pour faciliter l’insertion de la pipette et obtenir des images à deux photons de la plus haute qualité, comme illustré par ce schéma. La pipette doit être enfoncée dans le cortex à un angle de 30 degrés pour passer entre la chambre et l’objectif. Par conséquent, l’emplacement de la surface corticale de la position d’entrée de la pipette ne se fera pas directement au-dessus de la région d’intérêt ciblée.

Par exemple, pour marquer une région cible à 200 microns sous la surface corticale, la position d’entrée de la pipette sur la surface corticale sera d’environ 350 microns latéralement à la position cible. Déplacez la platine XY pour centrer la position d’entrée de la surface corticale sous l’objectif 20 x ou 40 x. Une fois la position d’entrée centrée sous l’objectif, augmentez la position Z de l’objectif de deux millimètres.

Ensuite, allumez la lumière verte d’épifluorescence, visualisez le colorant rouge Alexa dans la pipette et déplacez la pipette jusqu’à ce que la pointe soit au-dessus de la position d’entrée de la surface corticale. Tout en observant la pointe de la pipette à travers les oculaires du microscope avec éclairage en fond clair, abaissez la pipette jusqu’à ce qu’elle atteigne la position d’entrée souhaitée sur la surface corticale. Ensuite, retirez l’objectif et utilisez des lances d’absorption non pelucheuses pour évacuer l’excès de liquide céphalo-rachidien de la craniotomie et sécher l’os adjacent.

Appliquez ensuite une goutte de 3 % d’arose chaud, dissous dans un LCR pour stabiliser le cortex. Une fois que l’aros s’est solidifié, insérez un objectif 40 x et remplissez la chambre avec un LCR. Ensuite, utilisez l’axe diagonal du micromanipulateur pour déplacer la pipette jusqu’à ce que la pointe atteigne la profondeur souhaitée dans le cortex.

Des bouffées occasionnelles d’éjection par pression du mélange DI réduiront la probabilité que la pointe de la pipette se bouche lorsque la pipette atteint la couche deux, trois petites bouffées du mélange DI illumineront l’espace cellulaire supplémentaire et révéleront un assemblage dense de corps cellulaires circulaires comme des ombres sombres pour charger les corps neuronaux dans une sphère de cortex de 300 à 600 microns de diamètre. Injecter le mélange Dix dans l’espace extracellulaire à l’aide de 30 à 90 impulsions. Chaque impulsion une seconde, deux à 10 PSI.

Une fois l’injection terminée, attendez quelques minutes, puis retirez la pipette et l’objectif. L’indicateur de calcium fluorescent sera entièrement absorbé par les neurones en une heure. Enfin, retirez les aros utilisés pour le téléchargement et rincez la chambre d’enregistrement.

Mettez une petite goutte de deux à 3 % sur la surface et placez rapidement un verre de couverture sur la craniotomie. Insérez un objectif à NA élevé de 20 x dans le support d’objectif et recentrez la région corticale étiquetée sous l’objectif. À l’aide de l’étape XY, protégez la craniotomie des sources de lumière étrangère et collectez des images haute résolution des neurones marqués in vivo.

Alternativement, l’électroporation à cellule unique peut être utilisée pour étudier la morphologie dendritique ou l’imagerie fonctionnelle des dendrites. Dans cette méthodologie, les DI sont préparés selon le protocole écrit. Ensuite, au moment approprié de la procédure, la pointe de la pipette est positionnée à côté de la membrane d’un corps de cellules neuronales et un axo est utilisé pour appliquer une à trois impulsions.

Le remplissage immédiat du neurone avec un colorant est facilement visualisé avec la microscopie à deux photons. Cette image montre une zone imageée à deux photons montrant des corps cellulaires marqués avec l’indicateur de calcium fluorescent OGB 1:00 AM dans la couche deux trois du cortex visuel, la barre d’échelle représente 100 microns. Cette image montre la préférence d’orientation des corps cellulaires neuronaux individuels du même site que celui montré dans l’image précédente.

Une carte organisée de l’orientation préférée du stimulus est visible autour de la singularité du moulin à vent qui était centrée dans la région imagée. Ici, nous voyons la carte d’orientation obtenue avec l’imagerie du signal intrinsèque. Le carré noir correspond à la région montrée dans l’image à deux photons précédente.

Cette image montre les dendrites et le corps cellulaire d’un seul neurone superposés à la carte d’orientation. Le neurone a été électroporé avec Alexa floor 5 94 sous guidage à deux photons. Comme l’empilement Z a été collecté in vivo et que les processus dendritiques ont été tracés hors ligne à l’aide de neuro lucid comme logiciel.

La carte d’orientation a été obtenue à l’aide de l’imagerie du signal intrinsèque avant l’électroporation d’une seule cellule. La barre d’échelle représente 100 microns. Cette projection Z de 10 microns à partir de la première couche corticale montre des dendrites apicales.

Les flèches rouges montrent des épines le long des dendrites tandis que ces projections Z de 10 microns à partir de la couche corticale deux trois montrent des dendrites basales avec des épines indiquées par des flèches rouges et des axones indiqués par des flèches blanches. Cette méthode est utile pour étudier les cartes fonctionnelles du cortex à différentes échelles spatiales et pour cibler précisément les neurones dans un domaine d’intérêt spécifique. Dans la carte, nous avons démontré l’application de la méthode pour examiner les cartes sélectives d’orientation, mais elle peut être étendue à d’autres cartes de caractéristiques visuelles telles que la rétine, la toppie, la dominance oculaire et la direction, ou à d’autres modalités sensorielles qui ont des cartes organisées fonctionnellement telles que celles qui codent la sensation ou l’audition somato.