Name: Etiquetage des neurones ciblés dans une fonction spécifique à micro-domaine du néocortex par combinaison du signal intrinsèque et à deux photons dimagerie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-12T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Découvrez l'étiquetage de neurones dans des micro-domaines fonctionnels du néocortex par imagerie du signal intrinsèque et microscopie à deux photons. Cette méthode permet d'étudier la structure neuronale à haute résolution.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été soutenu par des subventions du National Eye Institute R01EY017925 et R21EY020985 et le financement de la Fondation Dana et Whitehall au PK Nous remercions également Matthieu Petrella de l&#39;aide pour les procédures chirurgicales, Grace Dion pour tracer les dendrites indiquées sur la figure 5A, et Pratik Chhatbar pour commentaires sur le manuscrit.

1. Préparation chirurgicale <ol><li> Induire une anesthésie et surveiller en permanence le rythme cardiaque, la fin de la marée CO 2, EEG, et de la température. Toutes les procédures ont été approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation de la Medical University of South Carolina et étaient basées sur celles que nous avons déjà publié 9,15. </li><li> Exposer la surface dorsale du crâne en coupant la peau avec une lame de scalpel. Disséquer les tissus conjonctifs qui recouvrent l&#39;os à l&#39;aide d&#39;une curette Brudon. Nettoyez l&#39;os en utilisant des applicateurs à embout de coton et gaze de coton. Appliquez la cire à os (au besoin) pour le crâne, pour arrêter les saignements occasionnels à travers de petites veines émissaires. </li><li> Attacher une plaque en titane ou en acier inoxydable tête en acier au crâne (sur la région d&#39;intérêt où la craniotomie sera effectué) à l&#39;aide de ciment dentaire mélangé avec de la peinture noire (voir Matériels). Une ouverture rectangulaire dans le centre de la plaque de tête permet d&#39;accéder à la craniotomie et d&#39;imagerie optique. Attacher une chambre de métal sur le dessus de la plaque de tête. Cette chambre se servir de réservoir de fluide pour l&#39;imagerie avec la lentille d&#39;objectif à immersion d&#39;eau. </li><li> Fixez la plaque de tête à un stade xy en utilisant des poteaux métalliques. </li><li> Amincir une grande surface de l&#39;os à l&#39;intérieur de l&#39;ouverture rectangulaire de la plaque de tête à l&#39;aide d&#39;une fraise de dentiste. La zone à être dilué doit s&#39;étendre bien au-delà des limites de la craniotomie prévu. Le crâne épais de non-rongeurs mammifères doivent être éclaircis si des images haute résolution sont à acquérir auprès du néocortex, car sur le site de craniotomie, l&#39;épaisseur de l&#39;os va dicter l&#39;épaisseur de la gélose entre la lamelle et la surface du néocortex (voir ci-dessous) . </li><li> Percer un trou de 2 x 2 mm contour carré dans l&#39;os de la craniotomie. Rincer la chambre périodiquement avec des produits frais liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) pour enlever des éclats d&#39;os et de minimiser la dissipation de la chaleur vers le cortex sous-jacent. Appliquez la cire à os selon les besoins, pour arrêter les saignements occasionnels. </li><li> Lift le volet osseux avec une pince n ° 3. </li><li> Retirez tous, mais la couche inférieure de durée à l&#39;aide d&#39;une amende pince (# 5CO) et des ciseaux à ressort Vannas. La dure-mère en non-mammifères rongeurs est épaisse et opaque, mais peut être enlevé en couches distinctes. Le saignement est rare mais peut être arrêté avec Gelfoam et tout résidu de sang doit être doucement retiré de la couche restante de durée en utilisant une pince et un rinçage à l&#39;ACSF. La dernière couche de dure-mère est transparente et les vaisseaux pie-mère doit être clairement visible à travers elle. En sortant de cette dernière couche de durée intacte lors de l&#39;imagerie signal intrinsèque augmente le taux de réussite de chargement en vrac des indicateurs de calcium fluorescentes pour la phase d&#39;imagerie à deux photons ultérieure de l&#39;expérience (voir discussion). </li><li> Appliquez une goutte d&#39;eau tiède agarose à 2% (dissous dans ACSF) et placer immédiatement une lamelle sur la craniotomie. Vérifiez la craniotomie pour s&#39;assurer que les pulsations respiratoires et cardiovasculaires sont minimes à l&#39;aide d&#39;un microscope chirurgical de dissection ou les oculaires des deux-microscope photonique à champ lumineux mode. </li></ol> 2. Intrinsèque du signal d&#39;imagerie optique <ol><li> Ajouter gel-mousse imbibée d&#39;ACSF autour de l&#39;extérieur du couvre-objet pour empêcher l&#39;agarose de séchage au cours de l&#39;imagerie de signal intrinsèque. </li><li> Fixer le signal de formation d&#39;image CCD intrinsèque à la norme monture C orifice sur le dessus du microscope à deux photons (figure 1). Placez la source de lumière d&#39;éclairage sur la table de l&#39;air près de la scène xy (figure 1A). Positionner et fixer les guides de lumière sur la craniotomie et plaque de tête / chambre (figure 1B). Rétracter la dichroïque primaire et le miroir au-dessous de l&#39;orifice de montage C de sorte que la lumière réfléchie rouge nécessaire pour des signaux intrinsèques passera directement de la craniotomie de la caméra CCD (figure 1C-D). Utilisation de l&#39;objectif 4x air (0,13 NA, 17 mm WD), un champ de 2 x 2 mm de vue est disponible pour l&#39;imagerie signal intrinsèque. </li><li> Insérer un filtre de chaleur dans la light chemin pour éviter le cortex de chauffage. Utilisez un filtre qui laisse passer la lumière verte (546 nm centre λ) et enregistrer une image numérique de référence des vaisseaux sanguins de surface corticale. </li><li> Déplacer le focus z à 500 um en dessous de la surface corticale. Utiliser un filtre rouge (630 nm centre λ) pour illuminer le cortex pour mesurer des signaux intrinsèques. Positionner les guides de lumière de telle sorte que la surface corticale est éclairé de façon uniforme. Protéger la craniotomie de la lumière produite par le stimulus visuel d&#39;affichage. Présenter une séquence de stimuli visuels et d&#39;enregistrer des images de réflectance de données. Pour générer une carte d&#39;orientation à l&#39;intérieur de 10 min, collecter des données correspondant à 4 répétitions d&#39;une séquence de stimuli 8 (4 orientations et deux directions pour chaque orientation). </li><li> Analyser les données de signal intrinsèque pour générer une carte en fausses couleurs orientation. Sélectionnez régions cibles potentielles pour les deux photons étiquetage des neurones, par exemple, l&#39;orientation des singularités moulinet - points dans la carte oùtoutes les orientations préférentielles convergent (Figure 2A). Superposer la carte et l&#39;orientation de l&#39;image de la vascularisation de la surface corticale (figure 2B-C). Utiliser la mise en page de domaines fonctionnels et l&#39;emplacement des bateaux de grandes surfaces pour sélectionner une cible en évitant les endroits les gros vaisseaux sanguins et des artérioles 15. </li></ol> 3. Chargement en vrac des indicateurs de calcium fluorescentes <ol><li> Préparer une solution de Pluronic 20% / DMSO en ajoutant 1 Pluronic g dans 5 ul de DMSO. Chauffer le mélange à 60 ° C pendant 10 min pour dissoudre complètement le Pluronic. Laissez le mélange refroidir à température ambiante. Ajouter 4 pl du mélange Pluronic / DMSO dans un flacon de 50 mg de calcium de l&#39;indicateur fluorescent Oregon Green 488 BAPTA-1 AM (OGB-1 AM). Puis ajoutez 1 ul d&#39;un colorant rouge (Alexa Fluor 594, solution mère 2 mM) et 35 ul de solution de la pipette (voir Matériel) pour une concentration finale de 1 mM OGB-1 AM. Soniquer la solution pendant une demi-heure dansun bain d&#39;eau glacée, puis centrifuger avec un filtre de 0,45 um pour éliminer les impuretés. </li><li> Tirez une pipette cône long avec un diamètre extérieur de 2,0 à 2.5 pointe um. Chargez 5 ul du mélange de colorants dans la pipette. </li><li> Enlever la couche finale de durée pour faciliter l&#39;insertion de pipette et obtenir la meilleure qualité d&#39;images à deux photons. </li><li> Déterminer l&#39;emplacement exact sur la surface corticale que la pipette doit être placé de manière à atteindre son objectif dans la couche corticale 2/3. Notre cible prédéterminée corticale est une singularité moulinet dans le plan d&#39;orientation (figure 2). La pipette doit être enfoncé dans le cortex à un angle de 30 ° pour passer entre la paroi de la chambre et l&#39;objectif. Ainsi, pour marquer la zone cible 200 um en dessous de la surface corticale, la position d&#39;entrée de pipette sur la surface corticale sera d&#39;environ 350 um latérales de la position de consigne (figure 3 AB). </li><li> Déplacer la table XY (sur lequel l&#39;animal et le pmicromanipulateur ipette sont placés) au centre de la position de l&#39;entrée de la surface corticale titre de l&#39;objectif (figure 3C). Utilisez un objectif 20x ou 40x avec une distance de travail (WD) d&#39;au moins 3 mm (voir Matériel) pour s&#39;assurer que la pipette sera facilement entrer dans le cortex sans toucher l&#39;objectif ou de l&#39;os le long de la paroi de la craniotomie. Une fois la position d&#39;entrée est centrée titre de l&#39;objectif, relever la position Z de l&#39;objectif de 2 mm (figure 3D). Avec l&#39;épi-fluorescence verte de lumière activé pour visualiser le colorant rouge Alexa dans la pipette, l&#39;utilisation de l&#39;axe diagonal de la micromanipulateur pour déplacer la pipette jusqu&#39;à ce que sa pointe est centrée (et concentrée) de l&#39;objectif au dessus de la position d&#39;entrée de la surface corticale ( Figure 3E). </li><li> Abaissez la verticale pipette (le long de l&#39;axe z) jusqu&#39;à ce que la pipette atteint la surface corticale (figure 3F), tout en continuant à visualiser la pointe de pipette à travers le oculars du microscope. Utilisation éclairage sur fond clair, les vaisseaux sanguins de surface corticales et autres membranes méningées (pie-mère et arachnoïde) sont facilement visibles dans la pipette se rapproche de la surface corticale. Si la pipette ne pas atteindre la position souhaitée d&#39;entrée, augmenter la pipette et recalibrer le ciblage sur la base des repères vasculaires sur la surface corticale. </li><li> Retirez l&#39;objectif, mèche excès de liquide céphalorachidien de la craniotomie et sécher l&#39;os adjacent en utilisant des lances d&#39;absorption non pelucheux. Appliquez une goutte d&#39;eau tiède 3% d&#39;agarose (dissous dans ACSF) pour stabiliser le cortex qui est visible à travers la craniotomie (figure 3G). Chez les non-rongeurs, agarose à 3% est nécessaire pour amortir les pulsations de l&#39;absorption réussie de colorants fluorescents par des neurones. Pour l&#39;imagerie optique intrinsèque signal de seulement 2% d&#39;agarose est nécessaire parce que la combinaison de 2% d&#39;agarose et la lamelle assure la stabilité nécessaire. Ici, pas de couvre-objet est utilisé pour l&#39;étape de chargement afin de colorant 3% d&#39;agarose estnécessaire. Après l&#39;agarose est solidifié, insérer un objectif 40x (0,8 NA, 3,3 mm DEO) et re-remplir la chambre avec ACSF. </li><li> Passez du champ lumineux à deux photons de visualisation et de localiser la pointe de la pipette. À l&#39;aide de l&#39;axe diagonal de la micromanipulateur, déplacer la pipette jusqu&#39;à ce que son extrémité atteint la profondeur désirée dans le cortex (figure 3H). Occasionnelles bouffées d&#39;éjection de pression du mélange de colorants (un peu psi, chaque impulsion 0,1 sec) aidera à prévenir la pointe de la pipette de colmatage. Car OGB-1 heures ne devient visible lors de l&#39;entrée des cellules, le rouge Alexa colorant est critique pour la visualisation de la pointe de la pipette à l&#39;intérieur du cortex. </li><li> Avant d&#39;essayer de charger des neurones dans la couche corticale 2/3 avec la pleine dose de colorant, re-concentrer sur l&#39;objectif de la surface corticale pour confirmer la profondeur de la pointe de pipette et faire en sorte que la pointe se trouve à l&#39;emplacement cible en fonction de la disposition des les vaisseaux sanguins de surface. Si la pipette est dans la couche 2/3, de petites bouffées du mélange de colorants devraient éclairer laespace extracellulaire et de révéler un ensemble dense de corps cellulaires circulaires que les ombres sombres. </li><li> Pour le chargement de corps cellulaires neuronaux dans une sphère de diamètre 300-600 um cortex, injecter le mélange de colorants dans l&#39;espace extracellulaire en utilisant 30-90 impulsions, chaque impulsion 1,0 s, 2-10 psi. Les impulsions de pression ne doit pas être si forte que le tissu se déplace. Après l&#39;injection est terminée, attendez quelques minutes, puis retirer la pipette et objective. Attendez pendant 1 heure pour permettre à l&#39;OGB-1 AM à être pleinement prises en livraison par les neurones. </li><li> Retirer l&#39;agarose utilisé pour la charge de colorant et rincer la chambre d&#39;enregistrement. Mettez une petite goutte de 2-3% d&#39;agarose sur la surface et placer rapidement une lamelle sur la craniotomie. Parce que les colorants fluorescents sont sensibles à la lumière, évitez de surexposer le cortex de champ lumineux ou épi-lumière fluorescente. Insérer une grande ouverture numérique (1,0) 20x objectif dans la monture d&#39;objectif et recentrer la région corticale marquée titre de l&#39;objectif en utilisant la scène xy. Protégez la craniotomie de l&#39;exdes sources de lumière, par exemple des traneous affichage stimulus visuel, en utilisant des couches multiples de matériau panne. </li></ol> 4. Une seule cellule électroporation de colorants fluorescents <ol><li> Pour étudier la morphologie dendritique, préparer une solution de 100 uM Alexa Fluor 594 (dilution 1:20 dans ACSF de 2 mM Alexa Fluor 594 actions). Pour l&#39;imagerie fonctionnelle des dendrites d&#39;un sel d&#39;OGB peuvent être utilisées 16,17. </li><li> Tirez une pipette cône de long avec un diamètre de buse de 1 um et charger 5 ul de colorant dans la pipette. Toutes les autres étapes de cibler un domaine fonctionnel sont identiques à la méthode de chargement en vrac (figures 1-3). Pour positionner la pointe de pipette adjacente à une membrane le corps des cellules neuronales, de surveiller l&#39;augmentation de l&#39;impédance d&#39;électrode et d&#39;appliquer des bouffées de pression de colorant pour éclairer l&#39;espace extracellulaire et de voir les corps cellulaires comme des ombres au cours de deux photons d&#39;imagerie. </li><li> Lorsque la pointe de la pipette est adjacente à une membrane de cellule neuronale corps, utiliser le 800A Axoporator à appliquerImpulsions 1-3 (-8 à -10 V, 10 ms d&#39;impulsion). Le remplissage immédiat du neurone avec le colorant est facilement visualisées avec microscopie à deux photons. Retirer la pipette et de recueillir des images haute résolution des dendrites et des axones in vivo. </li></ol>

<ol><li>Blasdel, G. G., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dyes+reveal+a+modular+organization+in+monkey+striate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex.</a> Nature. 321, 579-585 (1986).</li>
<li>Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li>
<li>Bonhoeffer, T., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iso-orientation+domains+in+cat+visual+cortex+are+arranged+in+pinwheel-like+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns.</a> Nature. 353, 429-431 (1991).</li>
<li>Ohki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+ordered+arrangement+of+single+neurons+in+orientation+pinwheels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels.</a> Nature. 442, 925-928 (2006).</li>
<li>Shmuel, A., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+for+direction+of+motion+and+its+relationship+to+orientation+maps+in+cat+area+18%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18.</a> J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).</li>
<li>Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+with+cellular+resolution+reveals+precise+micro-architecture+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex.</a> Nature. 433, 597-603 (2005).</li>
<li>Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience+with+moving+visual+stimuli+drives+the+early+development+of+cortical+direction+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity.</a> Nature. 456, 952-956 (2008).</li>
<li>Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+layout+of+functional+domains+in+area+17+and+across+the+area+17%2F18+border+in+cat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).</li>
<li>Kara, P., Boyd, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micro-architecture+for+binocular+disparity+and+ocular+dominance+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex.</a> Nature. 458, 627-631 (2009).</li>
<li>da Costa, N. M., Martin, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whose+Cortical+Column+Would+that+Be%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Whose Cortical Column Would that Be.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16(2010).</li>
<li>Kaschube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universality+in+the+evolution+of+orientation+columns+in+the+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex.</a> Science. 330, 1113-1116 (2010).</li>
<li>Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+organization+in+area+21a+of+the+cat+revealed+by+optical+imaging%3A+comparison+with+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex.</a> Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).</li>
<li>Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+mapping+of+single+spines+in+cortical+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo.</a> Nature. 475, 501-505 (2011).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).</li>
<li>Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artery-specific+fluorescent+dye+for+studying+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling.</a> Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).</li>
<li>Nevian, T., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+indicator+loading+of+neurons+using+single-cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%22%5BJournal%5D)">Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation.</a> Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).</li>
<li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+patch-clamp+recordings+and+single-cell+electroporation+of+unlabeled+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).</li>
<li>Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+valproic+acid+exposure+alters+functional+organization+in+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex.</a> Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).</li>
<li>Bock, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+anatomy+and+in+vivo+physiology+of+visual+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons.</a> Nature. 471, 177-182 (2011).</li>
<li>Rochefort, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+direction+selectivity+in+mouse+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of direction selectivity in mouse cortical neurons.</a> Neuron. 71, 425-432 (2011).</li>
<li>Mrsic-Flogel, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+regulation+of+eye-specific+responses+in+visual+cortex+during+ocular+dominance+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity.</a> Neuron. 54, 961-972 (2007).</li>
<li>Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonhoeffer%2C+T+%22Brain+mapping%3A+The+Methods%22">Brain mapping: The Methods</a>. Toga, A. W., Mazziotta, J. C. , Academic Press. San Diego. 55-97 (1996).</li>
<li>Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+input+and+output+of+neocortical+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Imaging input and output of neocortical networks in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).</li>
<li>Hofer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+connectivity+and+response+dynamics+of+excitatory+and+inhibitory+neurons+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex.</a> Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous présentons une méthode pour cibler l&#39;étiquetage des corps cellulaires neuronaux (ou dendrites et axones) dans prédéterminées fonctionnels micro-domaines du néocortex. Fusion d&#39;imagerie optique intrinsèque du signal avec la microscopie à deux photons offre la possibilité de déterminer lequel des synapses et des cellules de contribuer au domaine des micro-carte selon l&#39;une quelconque fonctionnel, que ce soit les corrélats neuronaux de sélectivité avec l&#39;emplacement du neurone dans un plan fonctionnel,...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 1. Soutien de la vie / expérience de préparation </td></tr><tr><td> L&#39;isoflurane </td><td> Vet Webster </td><td> NDC 57319-474-05 </td><td></td></tr><tr><td> Vaporisateur isoflurane </td><td> Midmark </td><td> VIP 3000 </td><td></td></tr><tr><td> Couverture chauffante Commentaires réglementé </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 50-7079F </td><td></td></tr><tr><td> Moniteur ECG </td><td> Digicare biomédicale </td><td> LifeWindow Lite </td><td></td></tr><tr><td> Amplificateur EEG </td><td> Systèmes AM </td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td> Moniteur d&#39;affichage EEG </td&gt; <td> Hewlett Packard </td><td> 78304A </td><td></td></tr><tr><td> En fin d&#39;expiration CO 2 moniteur </td><td> Respironics </td><td> Novametrix Capnoguard 1265 </td><td> Optimiser la ventilation </td></tr><tr><td> Les bavures de perçage en carbure pour perçage os </td><td> Henry Schein </td><td> fin (0,5 mm pointe) et grossière (1,25 mm pointe) </td><td></td></tr><tr><td> Ciment pour plaque de tête / chambre </td><td> Dentsply </td><td> 675571, 675572 </td><td></td></tr><tr><td> Black Powder Tempera Peinture </td><td> Sargent Art Inc </td><td> 22-7185 </td><td> Ajouter au ciment pour améliorer la protection contre la lumière et réduire les reflets </td></tr><tr><td> Agarose - type III-A </td><td> Sigma </td><td> A9793 </td><td> Pour minimiser les pulsations pendant le signal intrinsèque et à deux photons d&#39;imagerie </td></tr><tr><td> Lamelle: 5 ou 8 mm de diamètre, 0,17 mm d&#39;épaisseur </td><td> Précision Monde eninstruments </td><td> 502040, 502041 </td><td> Pour minimiser les pulsations pendant l&#39;imagerie, la lamelle peut être découpé selon les besoins </td></tr><tr><td> Curettes Brudon </td><td> George Tiemann </td><td> 105-715-0, 105-715-3 </td><td> Nettoyage de surface du crâne </td></tr><tr><td> La cire à os </td><td> Ethicon </td><td> W31G </td><td> Rapidement arrêter le saignement </td></tr><tr><td> Coton-tige </td><td> Sciences microscopie électronique </td><td> 72308-05 </td><td> Surface de l&#39;os propre et sec </td></tr><tr><td> Dumont # 5co forceps </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11295-20 </td><td> Prenez différentes couches de dure-mère ou pia </td></tr><tr><td> Vannas Ciseaux Spring </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15000-03 </td><td> Cut-mère </td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pfizer </td><td> 09-0396-05 </td><td> Pour arrêter le saignement sur la durée </td></tr><tr><td> Lances d&#39;absorption</td><td> Outils Fine Science </td><td> 18105-01 </td><td> Mèche ultra-rapide et non pelucheux du CSF </td></tr><tr><td> Matériau Blackout </td><td> Thorlabs </td><td> BK5 </td><td> Bouclier craniotomie </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2. Teindre préparation / injection </td></tr><tr><td> Le diméthylsulfoxyde (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 BAPTA-une heures </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td> Indicateur de calcium </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A10438 </td><td></td></tr><tr><td> Filtre centrifuge (0,45 um taille des pores) </td><td> Millipore </td><td> UFC30HV00 </td><td> Pour éliminer les impuretés avant l&#39;injection </td></tr><tr><td> Verre pipette extracteur </td><td> Sutter Instruments </td><td> P97 </td><td></td></tr><tr><td> Verre borosilicaté filamenter capillaire (1,5 mm de diamètre extérieur) </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B150F-4 </td><td> Pipette d&#39;éjection Dye </td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956 003 </td><td> Pour charger un colorant dans pipette </td></tr><tr><td> Micromanipulateur </td><td> Sutter Instruments </td><td> MP-285 </td><td> Pour positionner la pipette </td></tr><tr><td> Contrôleur d&#39;impulsion de pression </td><td> Parker Hannifin </td><td> PicoSpritzer III </td><td> Pour l&#39;injection sous pression de la teinture </td></tr><tr><td> Une seule cellule électroporateur </td><td> Molecular Devices </td><td> Axoporator 800A </td><td> Pour l&#39;électroporation de la teinture </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 3. Intrinsèque imaGing </td></tr><tr><td> Objectif 4x (0,13 NA, 17 mm WD) </td><td> Olympe </td><td> UPLFLN4X </td><td></td></tr><tr><td> Matériel intrinsèque / logiciel </td><td> Optical Imaging Inc </td><td> Imager 3001 / VDAQ </td><td> VDAQ logiciel est utilisé pour l&#39;imagerie épisodique </td></tr><tr><td> Caméra CCD </td><td> Adimec </td><td> Adimec-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Voyant d&#39;alimentation source de </td><td> KEPCO </td><td> ATE 15-15M </td><td></td></tr><tr><td> Source lumineuse </td><td> Optical Imaging Inc </td><td> HAL 100 </td><td> L&#39;intensité lumineuse à la surface corticale est de 3-5 mW </td></tr><tr><td> Filtre vert (pour image vasculaire) </td><td> Optical Imaging Inc </td><td> λ = 546 nm (bande passante 30 nm) </td><td> Pour une image de référence de la vascularisation de surface </td></tr><tr><td> Filtre Rouge (pour le signal intrinsèque) </td><td> Imagi optiqueng Inc </td><td> λ = 630 nm (bande passante 30 nm) </td><td> Pour collecter des signaux intrinsèques </td></tr><tr><td> Heat filtre </td><td> Optical Imaging Inc </td><td> KG-1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 4. À deux photons rig / imagerie </td></tr><tr><td> Microscope à deux photons et les logiciels </td><td> Technologies des Prairies </td><td></td><td> Voir Shen et al. 2012 pour trajet de la lumière, les filtres et la puissance du laser </td></tr><tr><td> Laser Ti: Saphir </td><td> Spectra-Physics </td><td> Mai Tai XF </td><td></td></tr><tr><td> 20x (0,5 NA; 3,5 mm WD) </td><td> Olympe </td><td> UMPLFLN20X </td><td> 0,5 NA objectif est utilisé uniquement pour l&#39;alignement de la pipette au-dessus de la craniotomie (pas de deux photons d&#39;imagerie) </td></tr><tr><td> 20x (1,0 NA; 2,0 mm WD) </td><td> Olympe </td><td> XLUMPLFLN20X </td><td></td></tr><tr><td> 40x (0,8 NA; 3,3 mm WD) </td><td> Olympe </td><td> LUMPLFLN40X/IR </td><td></td></tr><tr><td> Table pneumatique </td><td> Newport </td><td> ST-200 </td><td> Isole la préparation de vibrations externes </td></tr><tr><td> XY </td><td> Mike Machine Co. (Attleboro, MA) </td><td></td><td> Sujet expérimental et micromanipulateur Sutter placés sur scène xy </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Recettes </td></tr><tr><td> Artificielle liquide céphalo-rachidien </td><td> NaCl (135 mM), KCl (5,4 mM), MgCl 2 (1,0 mM), CaCl 2 (1,8 mM), HEPES (5 mM), pH 7,4 </td></tr><tr><td> Solution Pipeter 14 </td><td> NaCl (150 mM), KCl (2,5 mM), HEPES (10 mM), pH 7,4 </td></tr></tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

etiquetage des neurones ciblés dans une fonction spécifique à micro-domaine du néocortex par combinaison du signal intrinsèque et à deux photons d&#39;imagerie

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

Dans le cortex visuel primaire de non-rongeurs mammifères, les neurones sont regroupés en fonction de leur préférence pour les fonctions de relance comme l&#39;orientation 1-4, direction 5-7, dominance oculaire 8,9 et la disparité binoculaire 9. Sélectivité orientation est la caractéristique la plus largement étudiée et une application continue avec une mise en quasi-périodique pour l&#39;orientation préférée est présent sur ​​l&#39;ensemble du cortex visuel primaire 10,11. Intégrant les apports synaptiques, cellulaires et le réseau qui conduisent à des réponses de stimulation sélective de ces cartes fonctionnelles nécessite l&#39;hybridation des techniques d&#39;imagerie qui couvrent sub-micron au millimètre échelles spatiales. À l&#39;imagerie optique intrinsèque signal conventionnel, la disposition générale de cartes fonctionnelles sur toute la surface du cortex visuel peut être déterminé 12. Le développement in vivo de microscopie à deux photons à l&#39;aide de calcium colorants sensibles permet de déterminer la SYNAPTentrée ic arriver à épines dendritiques individuelles 13 ou enregistrement d&#39;activité simultanément à partir des centaines de différents corps cellulaires neuronaux 6,14. Par conséquent, en combinant l&#39;imagerie signal intrinsèque à la résolution spatiale submicronique de microscopie à deux photons offre la possibilité de déterminer exactement quels segments dendritiques et des cellules de contribuer au domaine des micro-carte fonctionnelle de tout dans le néocortex. Ici, nous démontrons une méthode à haut rendement permettant d&#39;obtenir rapidement une carte d&#39;orientation corticale et en ciblant un micro-domaine de cette carte fonctionnelle pour l&#39;étiquetage des neurones avec des colorants fluorescents chez un mammifère non-rongeur. Avec le même microscope utilisé pour l&#39;imagerie à deux photons, nous avons d&#39;abord générer une carte d&#39;orientation à l&#39;aide d&#39;imagerie optique intrinsèque du signal. Ensuite, nous montrons comment cibler un micro-domaine d&#39;intérêt en utilisant une micropipette chargée avec de la teinture d&#39;étiquette soit une population de corps cellulaires neuronaux ou l&#39;étiquette d&#39;un seul neurone tels que des dendrites et des axones, les épines sont visibles dansvivo. Nos améliorations par rapport aux méthodes antérieures de faciliter l&#39;examen des neurones relations structure-fonction avec sub-cellulaire résolution dans le cadre du néocortex architectures fonctionnelles.

Pour illustrer la précision de nos méthodes de marquage colorant, nous avons ciblé le plus petit micro-domaine d&#39;une carte fonctionnelle connue dans le néocortex non-rongeur. Peu ponctué toute la carte d&#39;orientation dans le cortex visuel primaire sont des singularités. Ils se produisent en des points où convergent toutes les orientations privilégiées telles que les cartes en fausses couleurs de l&#39;orientation préférée, les régions autour de la singularité regard comme &quot;moulinets&quot; (Figure 2A-...

On décrit une méthode pour l&#39;étiquetage des neurones avec des colorants fluorescents dans prédéterminées fonctionnels micro-domaines du néocortex. Tout d&#39;abord, l&#39;imagerie optique intrinsèque de signal est utilisé pour obtenir une carte fonctionnelle. Puis microscopie à deux photons est utilisée pour l&#39;étiquette et les neurones d&#39;image dans un domaine micro-de la carte.

Etiquetage des neurones ciblés dans une fonction spécifique à micro-domaine du néocortex par combinaison du signal intrinsèque et à deux photons d&#39;imagerie

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

L’objectif global de cette procédure est de cibler précisément des micro-domaines dans une carte fonctionnelle pour étudier la structure et la fonction des neurones à haute résolution. Ceci est accompli en effectuant d’abord une imagerie du signal intrinsèque sur une grande zone du cortex pour obtenir une carte de la caractéristique de stimulus d’intérêt. La deuxième étape consiste à déterminer l’emplacement précis sur la carte qui doit être ciblé pour l’imagerie haute résolution aux photons.Ensuite, après avoir soigneusement positionné la pipette chargée de colorant fluorescent, les neurones sont marqués avec le marqueur fluorescent. Enfin, des images à haute résolution aux photons des réponses ou des structures neuronales sont collectées. En fin de compte, une carte de caractéristiques de signal intrinsèque peut être utilisée pour trouver une région d’intérêt, telle qu’une singularité d’orientation en moulinet qui peut ensuite être ciblée pour être étudiée à la résolution d’un seul neurone.Le principal avantage de ce protocole est que l’on peut imager le cortex à différentes échelles spatiales en utilisant la même configuration de microscope avec seulement quelques ajustements ra

targeted-labeling-neurons-specific-functional-micro-domain-neocortex

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Pour comprendre la dynamique des réseaux de microcircuits du néocortex, il est indispensable d'enregistrer simultanément l'activité d'un grand nombre de neurones. L'imagerie in vivo de calcium à deux photons est la seule méthode qui permet d'enregistrer l'activité d'une population dense de neurones avec une seule cellule de résolution.

In Vivo 2-Photon Imaging calcium dans la couche 2 / 3 de souris

Cet article présente une approche consistant à combiner photostimulation à balayage laser avec des enregistrements de cellules entières dans des souris transgéniques exprimant la GFP dans les populations limitées neurone inhibiteur. La technique permet de cartographie étendue et l'analyse quantitative des locaux des circuits synaptiques inhibitrices spécifiques des neurones corticaux.

Cartographie inhibitrice circuits neuronaux par balayage laser photostimulation

Transport rétrograde de colorant fluorescent marque une sous-population de neurones en fonction de projection anatomique. Axones marqués peuvent être ciblés...

Marquage fluorescent rétrograde Permet ciblée extracellulaire seule unité d&#39;enregistrement de neurones identifiés<em&gt; In vivo</em

Expérience dépendant des changements moléculaires dans les neurones sont essentiels pour la capacité du cerveau à s'adapter en réponse à des problèmes de comportement.

In Vivo Imagerie biphotonique d&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

L’imagerie en accéléré chez l’animal vivant fournit des informations précieuses sur la réorganisation structurelle du cerveau intact. Ici, nous introduisons une préparation de crâne aminci qui permet l’imagerie transcrânienne de structures synaptiques marquées par fluorescence dans le cortex de souris vivantes par microscopie à deux photons.

Deux-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des épines dendritiques dans le cortex de souris utilisant un crâne-Diluée Préparation

Nous décrivons la combinaison de l'effet des UV focal photo-activation de composés neuro-actif avec la cellule entière de patch-clamp et de l'imagerie multi-photons de transitoires de sodium intracellulaire dans les dendrites et les épines de neurones de l'hippocampe dans les tranches de tissu aiguë du cerveau de la souris.

Multi-photon intracellulaire Imaging sodium Combiné avec uncaging focale médiation-UV de glutamate dans CA1 pyramidale neurones

Cette vidéo montre la procédure de craniotomie qui permet l’imagerie chronique des neurones dans le cortex rétrosplénial de souris à l’aide de la microscopie à deux photons in vivo dans la lignée transgénique Thy1-GFP. Cette approche est combinée à l’injection d’un virus adéno-associé exprimant mCherry dans l’hippocampe dorsal. Ces techniques permettent un suivi à long terme de la plasticité structurelle dépendante de l’expérience dans les RSC.

Simultanée à deux photons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie d&#39;entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

Nous présentons une méthode combinant les enregistrements de patch-clamp de la cellule entière et deux photons d’imagerie pour enregistrer des transitoires de Ca2 + en dendrites neuronales dans des tranches de cerveau aiguë.

Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

Ici, nous décrivons une procédure pour la compensation des tissus, marquage fluorescent et l’imagerie à grande échelle du tissu de cerveau de souris qui, ainsi, permet la visualisation de l’organisation en trois dimensions des types de cellules dans le néocortex.

Imagerie tridimensionnelle à grande échelle de l’organisation cellulaire dans le néocortex de souris

Lorsqu’elle est intégrée à une plaque de tête et à une conception optique compatible avec les microscopes à un ou deux photons, la lentille à microprisme présente un avantage significatif pour mesurer les réponses neuronales dans une colonne verticale dans diverses conditions, y compris des expériences bien contrôlées dans des états de tête fixe ou des tâches comportementales naturelles chez des animaux en mouvement libre.

Imagerie à long terme de populations neuronales identifiées à l’aide de microprismes chez des animaux se déplaçant librement et avec la tête fixe

Ce protocole fournit une description complète d’une méthode permettant l’enregistrement simultané des signaux calciques provenant des neurones et des astrocytes à travers plusieurs régions cérébrales liées à la mémoire et démontre son application dans un paradigme d’apprentissage et de comportement mémoire.

Une méthode de photométrie à fibres bicolores pour enregistrer l’activité astrocyte-neurone dans plusieurs régions cérébrales lors de l’apprentissage et des comportements de mémoire

Découvrez l'étiquetage de neurones dans des micro-domaines fonctionnels du néocortex par imagerie du signal intrinsèque et microscopie à deux photons. Cette méthode permet d'étudier la structure neuronale à haute résolution.

Etiquetage des neurones ciblés dans une fonction spécifique à micro-domaine du néocortex par combinaison du signal intrinsèque et à deux photons dimagerie (Vidéo) | JoVE Journal

Etiquetage des neurones ciblés dans une fonction spécifique à micro-domaine du néocortex par combinaison du signal intrinsèque et à deux photons d'imagerie

Explorer plus de vidéos