Microscopie épiscopique à haute résolution (HREM) - Protocoles simples et robustes pour le traitement et la visualisation des matières organiques

L’objectif global de cette procédure est de générer des données numériques sur le volume des matériaux organiques. Il s’agit par exemple d’embryons et de tissus embryonnaires d’organismes modèles biomédicaux, de blocs de tissus prélevés sur des animaux adultes et des humains, y compris des biopsies cutanées ou musculaires et des matériaux tels que du papier non couché et des substituts cutanés. HREM aide à répondre à des questions fondamentales dans les domaines de la médecine et de la recherche biomédicale.

Il permet l’analyse et la visualisation tridimensionnelles d’organes et de tissus, par exemple d’embryons de souris génétiquement modifiés ou d’embryons de poussins manipulés. Il permet également d’analyser des modèles de cancer ainsi que des biopsies prélevées sur des tissus humains ou animaux. Le principal avantage de HREM est qu’il offre un moyen simple de générer des piles d’images de qualité histologique.

L’implication de cette technique s’étend à la recherche sur la cicatrisation des plaies à l’aide de modèles animaux, ainsi qu’à la filature et à la réparation de pathologies tissulaires chez l’homme. BMR Marlene Rodler et Johannes Gunther feront la démonstration de la procédure. Tous deux de l’Université de médecine de Vienne, Division d’anatomie.

Commencez par des embryons fixes ou du tissu embryonnaire d’au plus 5 x 5 x 5 millilitres cubes. Retirez le fixateur. Et ajoutez PBS.

Laver à quatre degrés Celsius avec basculement constant pendant 24 heures. Ajoutez de l’éthanol à 70 % dans les tubes contenant le tissu et placez les échantillons sur un rotateur à quatre degrés Celsius. Après deux à trois heures, continuez à déshydrater les échantillons dans des solutions d’éthanol de concentration croissante pendant deux à trois heures à chaque fois.

Pendant que les échantillons se déshydratent, préparez la solution d’infiltration en ajoutant 0,3125 gramme de peroxyde de benzoyle et 0,1 gramme d’ESN à 25 millilitres de solution A dans un bécher. Agitez sur une plaque d’agitation magnétique à quatre degrés Celsius pendant deux à trois heures jusqu’à ce que l’ESN et le catalyseur soient complètement dissous. Placez les échantillons dans une solution d’infiltration.

Et basculez ou faites pivoter les échantillons pendant 12 à 24 heures à quatre degrés Celsius. Commencez par préparer la solution d’enrobage. Ajouter un millilitre ou une solution B à 25 millilitres de solution d’infiltration fraîche.

Après avoir préparé les plateaux de gobelets de moulage, remplissez la cavité profonde des moules avec une solution d’enrobage. Transférez les échantillons dans les moules à l’aide d’une cuillère. Assurez-vous que l’échantillon est entièrement recouvert d’une solution d’enrobage pour éviter de piéger l’air.

Orientez l’échantillon à l’intérieur du moule à l’aide d’aiguilles ou de pinces. Il est essentiel d’optimiser l’orientation de l’échantillon lors de l’enrobage et de marquer sa position précise sur la surface du bloc. De cette façon, la région d’intérêt peut être réduite et l’objectif avec le grossissement le plus élevé possible peut être utilisé.

Dès que la solution d’enrobage commence à devenir visqueuse, placez un support de bloc sur le moule et ajoutez la solution d’enrobage par le trou central du support de bloc jusqu’à ce que la solution d’enrobage s’élève à un à deux millimètres au-dessus de la base du support de bloc. Scellez le plateau de la tasse de moulage en le recouvrant de cire de paraffine liquide et attendez qu’il soit durci avant de le déplacer. Laissez les blocs terminer la polymérisation en stockant les plateaux de gobelets de moulage scellés pendant un à deux jours à température ambiante.

Pour le traitement de post-polymérisation, placez les plateaux de moulage avec les blocs polymérisés dans un four de laboratoire standard et faites cuire à 70 à 80 degrés Celsius pendant au moins un à deux jours. Retirez les blocs des moules. Identifiez ensuite le champ de vision en dirigeant la lumière blanche obliquement vers la surface du bloc.

Tracez l’ombre de l’échantillon avec le marqueur noir sur la surface du bloc. Montez le bloc de résine avec le champ de vision indiqué sur le microtome et déplacez le support de bloc jusqu’à sa position d’arrêt. Démarrez l’appareil photo numérique et le logiciel de génération de données et acquérez une image en direct.

Choisissez un objectif avec un grossissement approprié pour couvrir la région d’intérêt. Déplacez l’optique de haut en bas et le microtome latéralement jusqu’à ce que la région d’intérêt corresponde au champ de vision affiché sur l’écran de l’ordinateur. Sectionnez le bloc jusqu’à ce que les premières structures de l’échantillon deviennent visibles.

Déplacez le microtome pour disposer la surface du bloc dans le plan focal de l’optique. Choisissez une épaisseur de section comprise entre 0,5 et cinq microns. Ensuite, après avoir configuré le logiciel selon les instructions du fabricant, démarrez le logiciel et commencez la capture des données.

Cette image de coupe HREM montre une coupe sagittale à travers un embryon de souris récolté au jour embryonnaire 9,5. Ce modèle 3D rendu en volume montre la surface de cet embryon. Cette image montre une coupe sagittale virtuelle à travers un modèle de rendu volumique du cou de l’embryon de souris récolté au jour embryonnaire 15,5.

Le modèle de surface met en évidence la lumière du système cardiovasculaire dans un rendu volumique de tous les tissus d’un embryon de poulet, un stade de développement Hamburger Hamilton 18. Cette image montre une coupe HREM à travers un nerf humain. L’incrustation agrandit la section de cette image.

Cette image montre une partie d’une coupe de la HREM à travers le foie porcin. Cette image montre un modèle 3D rendu en volume d’une biopsie prélevée sur un coussinet de pouce humain. Cette image montre les modèles de surface des artères dermiques, des veines et des nerfs devant une résection virtuelle grâce aux données HREM.

Cette animation montre un modèle rendu en volume de la peau épaisse d’un coussinet de pouce humain. Différents seuils et donc différentes structures dermiques, telles que les vaisseaux sanguins, les fibres nerveuses, les glandes sudoripares et les canaux des glandes sudoripares. HREM permet une visualisation rapide de l’architecture du matériau fibreux.

Cette image montre un modèle de rendu en volume de matériau de substitution cutanée natif. Cette animation montre le modèle rendu en volume du matériau de substitution cutanée. Notez la forme différente et le calibre des fibres.

Les échantillons doivent être déshydratés, infiltrés et noyés dans de la résine, de sorte que l’ensemble de la procédure peut prendre jusqu’à plusieurs jours, mais ne comprend que deux à trois heures de travail opérationnel pour préparer les solutions, changer les solutions, etc. La génération de données elle-même est entièrement automatisée sur l’appareil HREM et 1000 images peuvent être produites en deux à trois heures. Après son développement, HREM a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du développement pour noter avec précision le phénotype d’embryons de souris mutantes.

Un exemple est le projet DMDD où le HREM est utilisé pour phénotyper, des embryons de souris à létalité embryonnaire dans les détails encore inconnus. Il s’est avéré que la HREM est également une excellente alternative à la microscopie optique positionnelle pour examiner l’architecture des vaisseaux sanguins, des nerfs ou des fibres dans des échantillons de tissus humains.