Quantification des microorganismes à des Concentrations faibles en utilisant la microscopie holographique numérique (DHM)

L’objectif global de cette expérience est de démontrer la détection de micro-organismes à de très faibles niveaux à l’aide de la microscopie holographique numérique. Cette technique est plus sensible que la microscopie optique traditionnelle et fournit des informations en temps réel sur les comportements bactériens. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines biologiques et cosmologiques, telles que la recherche d’organismes pathogènes dans l’eau ou la vie dans notre système solaire sur les lunes glacées.

Le principal avantage de cette technique est que la DHM est une technique volumétrique, ce qui signifie que nous pouvons capturer instantanément des informations tridimensionnelles sur notre échantillon sans avoir besoin de nous recentrer physiquement. Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic des infections de la circulation sanguine ou du liquide céphalo-rachidien en raison de sa capacité à détecter de faibles concentrations bactériennes. Pour commencer cette procédure, le jour de l’expérience, prenez une lecture spectrophotométrique de la culture mère bactérienne qui devrait être dans la plage de 0,6 à 0,7.

Ensuite, prélevez un échantillon de la culture mère et comptez les cellules directement à l’aide d’une chambre de comptage Petroff-Hausser pour dénombrer les cellules vivantes et mortes. Transférez un échantillon de 10 microlitres de la culture non diluée à l’aide d’une micropipette dans la chambre. Imagez-le sous un microscope à objectif sec élevé en utilisant le contraste de phase.

Par la suite, comptez les bactéries dans au moins 20 carrés et faites-en la moyenne. Calculez la concentration comme étant la moyenne de 20 carrés multipliée par le facteur de dilution. Pour n’énumérer que les cellules vivantes, effectuez une dilution en série de chacun des échantillons bactériens sélectionnés avec une solution saline stérile à 0,9 % en transférant 20 microlitres de la solution bactérienne dans un autre puits et en la diluant avec 180 microlitres de solution saline.

Répétez la procédure jusqu’à ce que la concentration la plus basse soit d’environ 10 à trois cellules par millilitre. Ensuite, prélevez 100 microlitres d’échantillons d’au moins deux dilutions et placez-les sur les plaques de milieu solide appropriées. Étalez-les à l’aide d’un épandeur stérile et effectuez au moins trois répétitions de chaque dilution.

Après cela, incubez-les à une température appropriée pendant la nuit ou jusqu’à ce que les colonies grandissent. Comptez ensuite les colonies. Calculez les unités formant colonies et calculez la moyenne de celles-ci sur les répétitions.

Dans cette procédure, effectuez des dilutions en série de la culture mère pour le comptage DHM et post-DHM des UFC sur des plaques de milieu de bouillon Lysogeny. Diluez les bactéries dans 25 millilitres d’un milieu minimal qui favorisera la motilité mais inhibera la division cellulaire afin que la concentration des cellules ne change pas sensiblement pendant l’expérience. Pour enregistrer des vidéos DHM, à l’aide d’une seringue stérile, aspirez environ 10 millilitres de la dilution d’intérêt.

Connectez ensuite la seringue à la chambre d’échantillonnage DHM à l’aide de raccords et de tubes stériles. Faites couler l’échantillon de la seringue à travers la chambre d’échantillonnage en continu à l’aide d’un pousse-seringue. Au fur et à mesure que l’échantillon s’écoule dans la chambre d’échantillonnage, acquérez des hologrammes consécutivement à une fréquence d’images appropriée.

Prévoyez suffisamment de temps pour que la totalité des 10 millilitres de l’échantillon s’écoule à travers le DHM. Pour s’assurer que les bactéries ne se développent pas ou ne meurent pas pendant les expériences, inoculez les plaques de milieux enrichis avec 100 microlitres de milieux usagés après la capture d’image DHM en les étalant à l’aide d’un épandeur stérile. Ensuite, incubez-les à la bonne température pendant 24 heures avant de compter les colonies.

Il est essentiel de disposer d’un comptage précis des cellules pour déterminer quantitativement les limites de détection. Il est important d’effectuer toutes les dilutions avec le plus grand soin à l’aide de micropipettes calibrées et de confirmer tous les comptages par densité optique, placage et comptage direct dans la chambre de Petroff-Hausser. Pour analyser les données de présence bactérienne dans les vidéos d’hologrammes acquises, effectuez un filtrage soustrait du support en convertissant d’abord les images au format 32 bits.

Calculez ensuite la valeur médiane du pixel. Enfin, soustrayez cette valeur médiane de chaque pixel respectif pour éliminer les artefacts stationnaires dans l’hologramme. Après cela, comptez manuellement le nombre d’anneaux de zone visible et de cellules nettes.

Chaque série d’hologrammes sera accompagnée d’un fichier d’horodatage. Utilisez le fichier d’horodatage pour calculer la quantité totale d’échantillon pompée au moment de la capture de l’image. Par la suite, calculez la densité cellulaire en divisant le nombre total de cellules détectées par le volume total de l’échantillon imagé.

Faites la moyenne de cinq à 10 images pour obtenir des statistiques précises. Ce graphique montre les cellules prédites par champ de vision sur la base d’un volume d’échantillon de 365 micromètres sur 365 micromètres sur un millimètre. Pour les concentrations où le nombre de cellules par champ de vision est inférieur à un, plusieurs images sont nécessaires pour obtenir la détection.

Il s’agit d’une séquence d’hologramme DHM d’une culture de Serratia marcescens à 2 100 cellules par millilitre mesurée par numération sur plaque. La séquence montre une cellule toutes les une à deux secondes environ, ce qui correspond parfaitement à la prédiction. Et il s’agit d’une autre séquence d’hologramme DHM d’une culture de Serratia marcescens à 620 cellules par millilitre mesurée par numération sur plaque.

Cette séquence montre une cellule toutes les six à sept secondes environ. Lorsque vous utilisez la microscopie holographique numérique pour imager des cellules, n’oubliez pas d’utiliser des techniques de stérilisation par filtre pour préparer toutes les solutions. Cela évitera d’introduire des particules dans l’instrument.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de préparer des cultures de cellules saines et d’avoir à portée de main un milieu de croissance, des plaques et un milieu de motilité supplémentaires. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la coloration fluorescente peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le pourcentage de cellules vivantes par rapport aux cellules mortes. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la microbiologie pour explorer la motilité tridimensionnelle dans les cellules cultivées et les échantillons environnementaux.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de dénombrer les bactéries à l’aide de la microscopie holographique et de valider les résultats à l’aide d’autres techniques de comptage. N’oubliez pas que travailler avec des cultures bactériennes peut être extrêmement dangereux. Des précautions de biosécurité appropriées doivent toujours être prises lors de la culture et de la manipulation d’organismes vivants.