Name: Imagerie multimodale de hiérarchique de coupes sériées, pour trouver les cibles cellulaires spécifiques au sein de grands Volumes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Découvrez l'imagerie multimodale hiérarchique pour identifier des cibles cellulaires spécifiques dans de grands volumes tissulaires. Cette méthode combine microscopie optique et microscopie électronique à balayage pour visualiser l'ultrastructure cellulaire avec une résolution nanométrique.

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KIT a reçu des remboursements par Boeckeler Instruments pour la fourniture d’un modèle fonctionnel de la porte-substrat. Marlene Thaler est employé de ZEISS microscopie GmbH, fabricant des systèmes microscope mentionnées dans cet article. En outre, ZEISS propose certaines solutions comme les packages de solution ZEISS Atlas pour un large éventail d’applications en grande surface, 3D imagerie pour instruments SEM et FIB-SEM. Tous les autres auteurs n’ont rien à divulguer.

Un flux de travail afin de cibler des cellules spécifiques dans un tissu par multimodale AT hiérarchique a été démontrée : un échantillon enrobées dans la résine est tranché vers le haut dans les tableaux de coupes sériées, qui sont placés sur un substrat conducteur à l’aide d’un porte-substrat sur-mesure. Après marquage avec un fluorophore et imagerie de la FLM, le volume reconstruit est utilisé pour sélectionner les cellules cibles. Après que coloration supplémentaire tours avec des métaux lourds qui va présenter le contraste, ces objectifs sont imagés sur plusieurs sections de centaines à résolution nanométrique dans une SEM à l’aide d’une plate-forme logicielle automatisée.
Pour produire des tableaux avec plusieurs longs rubans, un porte-substrat similaire à celle décrite ici est nécessaire. Une personne habile et patiente peut être en mesure de fixer plusieurs rubans sur un substrat de silicium, semi immergé dans le bateau de couteau et de récupérer le tableau en abaissant progressivement le niveau d’eau jusqu'à ce que les rubans sont assis sur le substrat. Toutefois, dans le notre expérience, on a tendance à éclater en formation lorsque le substrat est en contact avec n’importe quelle partie du bateau couteau (cf. Remarque dans la section 1.3.2 dans le protocole). En outre, cette procédure est beaucoup plus difficile avec des substrats enduits ITO : (1) grâce à la transparence du verre-ITO, il est difficile de voir le bord de l’eau où les extrémités des rubans doivent être joints ; et (2) parce que la surface enduite ITO est beaucoup plus rude que la plaquette de silicium poli, les rubans ont tendance à casser pendant le levage et petits fragments composé de quelques tronçons peuvent flotter, détruisant ainsi l’ordre des sections.
Le workflow entier est aussi possible et sans corrélation avec les données de la FLM. Dans ce cas, la collecte de données dans le SEM peut-être avoir à accomplir lors de plusieurs séances. Une reconstruction 3D initiale ou du moins l’évaluation des données de faible ou moyenne résolution peut être nécessaire d’identifier les cibles. En outre, les colorants histologiques conventionnels pour fond clair LM (FLM pas exigeant) peuvent être appliqués. Bien sûr, les autres options6,,7,8 sont anticorps étiquettes apposées sur les tableaux, comme déjà démontré dans le document initial sur18, ou génétiquement codé protéines fluorescentes (XFPs) ou enrobage préalable d’étiquetage avec préservation de la fluorescence au cours de la préparation de l’échantillon.
Une limitation générale de la méthode discutée est l’utilisation de sections d’une certaine épaisseur et l’échantillonnage discret résultant du volume 3D : résolution en Z ne peut être aussi bonne que l’épaisseur des sections puisque la SEM recueille des seules données de la surface de section (d elon l’énergie énergie primaire/atterrissage sélectionné). Cela signifie que le volume 3D a voxels anisotropes, par exemple., 5 x 5 x 100 nm3 si 100 sections nm et une taille de pixel d’image de 5 nm sont utilisés. Pour les très petites entités dans une portée de taille inférieure à 1 µm, cela peut-être pas suffisante pour obtenir une vraie description ultrastructurale. Une limitation plus technique est la précision de la scène utilisée dans la SEM pour automatisé d’imagerie. Pour cette raison, il est nécessaire de choisir un retour sur investissement dépasse les spécifications de la précision de la scène afin de garantir que la zone cible complet est photographiée.
Par rapport à la SBF-SEM et FIB-SEM comme méthodes d’imagerie de l’îlot, corrélatif AT a le désavantage définitif de voxels anisotrope, tel que décrit ci-dessus. Avec FIB-SEM, des voxels isotropiques de 5 x 5 x 5 nm3 peut être obtenus lorsqu’une correction de dérive appropriée est en place.
Les lacunes dans le volume reconstruit en raison de la perte des articles lors de la préparation des tableaux peuvent être aussi un sujet de préoccupation qui n’est pas rencontrée avec SBF-SEM ou FIB-SEM Avec stabilisation bon ruban de colle, c’est habituellement seulement une question pour la dernière section d’un ruban : il pourrait être endommagé lorsque dégageant de la lame des couteaux à l’aide de la cil. Toutefois, selon notre expérience, la perte d’une section dans chaque sections de 20 à 50 n’influence pas d’image.
En revanche, la possibilité de colorer les tableaux confère bon signal et contraste pour l’imagerie SEM, même sur des échantillons faiblement métallisés comme l’anticyclone congelés apex racinaires illustré ici. Par conséquent, il n’est pas nécessaire de compromettre la préservation optimale de nombreuses fixation chimique et les étapes de la métallisation. En outre, des échantillons de routine du laboratoire de pathologie avec des degrés intermédiaires de métallisation livrer excellentes données10. Une telle amélioration du contraste après incorporation n’est pas possible pour SBF-SEM et FIB-SEM en général. En outre, étant donné que ces méthodes sont destructeurs, c'est-à-direconsommer l’échantillon pendant l’imagerie, hiérarchique d’imagerie sur sites et différentes résolutions ou imagerie répété aux points plus tard dans le temps est impossible. En principe, volumes illimités, composé de grandes FOVs (p. ex., jusqu'à plusieurs millimètres de cerveaux de souris tout en connectomics) créé par piqûre des mosaïques, et grand nombre de sections peut être acquise par AT, tandis qu’en FIB-SEM, FOVs au-delà de 100 µm x 100 µm sont difficiles à atteindre avec des instruments courants.
Une automatisation supplémentaire du AT-workflow décrit serait un avantage certain, car les méthodes susmentionnées SBF-SEM et FIB-SEM effectuent de sectionnement et d’imagerie au sein d’un même instrument d’une manière entièrement automatisée. Il existe une sorte d’automatisation de sectionnement : The ATUMtome12 peut générer et collecter des milliers d’articles, mais l’utilisation de ruban Kapton comme un substrat fait de tels tableaux difficiles à l’image dans un FLM. Sur les lamelles de ITO-enduit utilisé ici, l’imagerie même Super-résolution devrait être possible. Une cible de plus, très souhaitable pour l’automatisation serait l’enregistrement des piles de données FLM. En revanche, automation peut être coûteuse et sauf pour le porte-substrat, le flux de travail présentée ici s’appuie (en termes de matériel) que sur l’instrumentation habituellement disponible dans une routine EM laboratoire ou core installation, rendant faible niveau d’accès.

Pour la reconstruction de grandes quantités de tissus à résolution ultrastructurale, un certain nombre de différentes méthodes d’imagerie basée sur SEM ont été utilisés1: révisions complètes sont disponibles par exemple., de SBF-SEM2, FIB-SEM3et tableau Tomographie (AT)4. Alors que pour cette dernière méthode, le matériau de l’échantillon est conservé sous forme de tableau de coupes sériées sur un substrat, SBF-SEM et FIB-SEM sont des méthodes destructives, travaillant sur le bloc de l’échantillon et qui la consomme en imagerie. En raison de la charge de la résine dans le SEM, elles dépendent aussi fortement métallisé échantillon blocs5.
D’autre part, identifier certaines cellules ou structures d’intérêt au sein d’un échantillon de tissu peut bénéficier en particulier lumière corrélative et microscopie électronique (CLEM)6,7,8. À l’aide de FLM afin de cibler empêche l’application de grandes quantités de métaux lourds, car cela serait étancher le signal de fluorescence9. Pour ces seuls échantillons légèrement métallisés, AT est la méthode de choix car les tableaux peuvent être facilement après tachées et heavy metal, après imagerie LM. En outre, presque n’importe quel type d’échantillon peut être utilisé pour AT, des échantillons de même routine de la pathologiste au Trésor poitrine10.
Un autre grand avantage de la TA est la possibilité de hiérarchique11 ou multirésolution d’imagerie12: il n’est pas nécessaire de tout à haute résolution d’image, comme cibles peuvent être sélectionnés dans une modalité différente (par exemple, FLM) ou en images de basse résolution SEM. Seules les régions intéressantes d’une population de tissus ou de cellules à haute résolution d’imagerie économise de l’espace de stockage de données numériques et produit des petits ensembles de données d’image, qui sont plus faciles à gérer. Ici, le flux de travail AT est démontrée en utilisant un échantillon assez faiblement métallisé : haute pression gelé les racines des plantes (Arabidopsis thaliana) incorporé en résine hydrophile.
Les baies sont préparés, colorés et imagés en FLM et SEM et découvrez comment les piles d’image sont enregistrés sont expliqués. Aussi, comment la reconstruction 3D du volume FLM peut être utilisée pour sélectionner des cellules spécifiques pour l’imagerie de la SEM à résolution nanométrique est illustrée.

<table><tbody><tr><td>Instrumentation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>RMC</td><td>PT-PC</td><td>Alternative : Support</td>de</tr><tr><td>substrat</td><td>Leica</td> UC7 RMC <td>ASH-100</td><td>Alternative :</td></tr><tr><td>Nettoyeur plasma</td> maison <td>Diener</td><td>Zepto 40kHz</td><td>Alternatives : Ted Pella Pelco ou autre nettoyeur plasma de paillasse Exemples de paramètres pour Diener Zepto avec générateur 40kHz (0-100W) ; 0,5 mbar, 5 sccm (Air), 10 % de performance&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microscope optique à fluorescence grand champ</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer.Z1</td><td>Alternatives : Leica, Nikon, Olympus</td></tr><tr><td>Jeu de filtres à fluorescence</td><td>Zeiss</td><td>43 HE (Cy3/DsRed)</td><td></td></tr><tr><td>Objectif</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Neofluar 40x</td><td>&nbsp ; 0,75 NA</td></tr><tr><td>Station de travail décente capable de gérer des données</td><td></td><td></td><td></td>d’image de la taille d’un Go</tr><tr><td>FESEM</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 55</td><td>Alternatives : FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Sectioning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir</td><td>Plano</td><td>T585-V</td><td></td></tr><tr><td>Couteau diamanté pour la taille 45&deg ;</td><td>Diatome</td><td>DTB45</td><td></td></tr><tr><td>Couteau diamanté pour la taille 90&deg ;</td><td>Diatome</td><td>DTB90</td><td></td></tr><tr><td>Couteau diamant Jumbo pour le sectionnement</td><td>Diatome</td><td>DUJ3530</td><td></td></tr><tr><td>Plaquette de silicium (pièces)</td><td>Si-Mat</td><td>Dopage sur mesure</td><td> : P/Bor, orientation : < 100>, épaisseur : 525 &plusmn ; 25 et micro ; m, résistivité : 1-30 &Omega ;-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html</td></tr><tr><td>lamelles revêtues d’ITO</td><td>Balzers</td><td>Type Z</td><td>22 &times ; 22 &times ; 0,17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html</td></tr><tr><td>Support en aluminium</td><td>Custom Made</td><td></td><td>76 &times ; 26 mm</td></tr><tr><td>Pince à plaquettes</td><td>Ideal-tek</td><td>34A.SA</td><td></td></tr><tr><td>Pince à talons</td><td>Dumont</td><td>0103-2E1/2-PO-1</td><td>Dumoxel-H 2E 1/2</td></tr><tr><td>Diamond scriber</td><td>Plano</td><td>T5448</td><td></td></tr><tr><td>Cils/poil de chat très doux</td><td>Selfmade</td><td></td><td>Alternative : Plano</td></tr><tr><td>Brush</td><td>Selfmade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pattex adhésif de contact Pattex</td><td></td><td>PCL3C</td><td>Kraftkleber Classic (le jaunâtre)</td></tr><tr><td>Fixogum</td><td>Marabu</td><td>290110001</td><td>pour la fixation du support sur support</td></tr><tr><td>Ruban adhésif</td><td>3M</td><td>851</td><td>pour la fixation du support sur le support</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Bernd Kraft</td><td>07029.4000</td><td></td></tr><tr><td>Xylène</td><td>Carl Roth</td><td>4436</td><td>diluant pour mélange de colle</td></tr><tr><td>Rotihistol</td><td>Carl Roth</td><td>6640</td><td>alternative, à base de limonène, diluant</td></tr><tr><td><fort>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Traitement d’images</td><td>Open source</td><td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td><td></td></tr><tr><td>Acquisition d’images</td><td>Zeiss</td><td>Atlas 5 AT (module pour Zeiss SEM)</td><td>Alternative pour l’acquisition automatique d’images : WaferMapper : https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Solution mère : 1,5 mM dans de l’azoture de sodium à 0,1 %</td></tr><tr><td>Uranylacétate</td><td>Science Services</td><td>E22400</td><td></td></tr><tr><td>Nitrate de plomb (II)</td><td>Merck</td><td>107398</td><td></td></tr><tr><td>Citrate trisodique Dihydraté</td><td>Merck</td><td>106448</td> Pastilles de NaOH Merck 106469 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1M</td><td>Bernd Kraft</td><td>01030.3000</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en verre</td><td>Duran</td><td>23 755 56</td><td></td></tr><tr><td>Nom</strong</td><td>>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Mounting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stubs</td><td>Plano</td><td>G301F</td><td></td></tr><tr><td>Patins en carbone</td><td>Plano</td><td>G3347</td><td></td></tr><tr><td>Ruban de cuivre</td><td>Plano</td><td>G3397</td><td>adhésif double face, conducteur</td></tr><tr><td>Peinture argent</td><td>Plano</td><td>G3692</td><td>Acheson Elektrodag 1415M</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires</td></tr><tr><td>Solutions/mélanges</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mélange adhésif pour l’enrobage des blocs</td><td></td><td></td><td>Colle de contact Pattex /xylène comme diluant, rapport 1:3, (Alternative pour le xylène : Rotihistol)</td></tr><tr><td>Citrate</td><td></td><td></td> de plomb Reynolds <td>50 mL : Dissoudre 1,33 g de nitrate de plomb(II) dans 10 mL de mélange dH2O. Dissoudre 1,76 g de citrate trisodique dihydraté dans 10 ml de mélange dH2O. les deux et ajouter 1 M d’hydroxyde de sodium jusqu’à ce que la solution soit claire. Remplir de dH2O jusqu’à 50 mL.</td></tr><tr>Solution <td></td><td></td><td>de coloration à l’iodure de propidium</td><td>Préparer une dilution 1:1500 à partir du stock dans dH2O. Vortex pour un mélange adéquat.</td></tr><tr>Acétate <td></td><td></td><td>d’uranyle aqueux</td><td>Dissoudre 3 % d’acétate d’uranyle dans dH2O (bien mélanger).</td></tr></tbody></table>

imagerie multimodale de hiérarchique de coupes sériées, pour trouver les cibles cellulaires spécifiques au sein de grands volumes

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Cibler des cellules spécifiques à résolution ultrastructurale au sein d’une population de cellules mixtes ou un mouchoir en papier est possible en imagerie hiérarchique à l’aide d’une combinaison de microscopie photonique et électronique. Échantillons embarqués en résine sont sectionnées en tableaux composé de rubans de centaines de coupes ultrafines et déposés sur des morceaux de tranche de silicium ou de lamelles en liaison conductrice avec enduit. Les tableaux sont imagés à basse résolution à l’aide un consommateur numérique comme appareil smartphone ou microscope photonique (LM) pour avoir un aperçu rapide de grande surface ou un microscope à fluorescence grand champ (microscopie photonique de fluorescence (FLM)) après marquage avec des fluorophores. Après coloration par des métaux lourds, les baies sont imagés dans un microscope électronique à balayage (SEM). Sélection des cibles n’est possible de reconstructions 3D générées par FLM ou de reconstructions 3D issues les piles SEM d’image à résolution moyenne, si aucun des marqueurs fluorescents ne sont disponibles. Pour les analyses ultrastructurales, cibles choisies sont tournées enfin la SEM à haute résolution (quelques pixels de l’image de nanomètre). Un outil de gestion ruban qui peut être modifié à n’importe quel ultramicrotome est démontré. Il aide à la production de tableau et enlèvement de substrat du bateau sectionnement de couteau. Une plate-forme logicielle qui permet l’imagerie automatisée des tableaux dans le SEM est discutée. Par rapport aux autres méthodes de production de données de grand volume EM, comme îlot série SEM (SBF-SEM) ou faisceau ionique focalisé SEM (FIB-SEM), cette approche présente deux avantages principaux : (1) l’échantillon enrobées dans la résine est conservée, mais dans une version en tranches. Il peut être teinté de différentes manières et imagé avec des résolutions différentes. (2) ainsi que les sections peuvent être soit des traités, il n’est pas nécessaire d’utiliser des échantillons fortement colorés à bloc avec des métaux lourds pour introduire le contraste pour l’imagerie SEM ou blocs de rendu de tissu conducteur. Cela rend la méthode applicable à une grande variété de matériaux et de questions biologiques. Matériaux particulièrement préfixée par exemple, de banques de biopsie et les laboratoires de pathologie peuvent directement être incorporé et reconstruit en 3D.

Le flux de travail décrit ici (Figure 1) commence avec un échantillon incorporé dans un bloc de résine. Au cours de la préparation de l’échantillon, certains métaux lourds devraient être introduit dans les tissus, mais il n’est pas nécessaire d’utiliser les protocoles optimisés pour métallisation assez forte. Figure 1 a montre une racine de plante (cress) bloc coloré classiquement avec 1 % OsO4 et 1 % acétate d’uranyle, tandis que la racine de l’Arabidopsis dans la Figure 1 b est seulement faiblement métallisé en utilisant l’acétate d’uranyle 0,5 %. Le type de ce dernier exemple est plus adapté pour approches corrélatifs comme certains métaux lourds ont tendance à étouffer la fluorescence. Avec un support dédié de substrat (Figure 2), les tableaux de centaines de plusieurs sections peuvent être produites (Figure 1). Après marquage fluorescent, tels tableaux est imagés dans un FLM de grand-angulaire standard (Figure 1), puis colorées avec des solutions de métaux lourds et photographiée sur un SEM à différentes résolutions (Figure 1E–G).
Des outils importants pour la génération reproductible des tableaux, en particulier lorsque vous placez plusieurs rubans de bateau couteau du microtome sur un substrat, sont le porte-substrat (Figure 2 a, conçu sur mesure en laboratoire des auteurs) et un diamant de Jumbo couteau avec un bateau assez grand pour accueillir des lames de microscope (Figure 2 b). Un ménisque plat, permettant la bonne observation des rubans, est nécessaire et peut être réalisé par plasma, nettoyage du substrat : une petite goutte d’eau distillée ne devrait pas constituer une structure en forme de lentille sur le substrat comme dans la Figure 2 (substrat non traitée), mais un film mince (Figure 2D, substrat de plasma activé). Dans ces conditions, les rubans attachés à la partie sèche d’une lamelle couvre-objet revêtu ITO sont facilement visualisée (Figure 2E) et peut être observée et contrôlée pendant la levée du substrat de l’eau.
À titre d’exemple, tableaux colorés à l’iodure de propidium d’étiqueter les parois cellulaires des plantes ont été photographié avec un champ large standard FLM (Figure 3 a). Les sections étant seulement 100 nm d’épaisseur, même trop de coloration comme indiqué ici introduit peu flou. Après l’enregistrement, les deux cellules encaissées dans le volume reconstruit ont été choisis dans la pile d’image (Figure 3 b) pour l’imagerie haute résolution en 3D (voir aussi le Supplément S1 du film). Après coloration supplémentaire avec citrate d’uranyle de l’acétate et le plomb, les baies ont été photographiés dans la SEM. Figure 3 C montre une vue d’ensemble, enregistré avec 60 pixels de l’image nm ; le carré sombre dans le centre de l’image indique la position où les fonctions de mise au point automatique ont été exécutées, et la dose supplémentaire a conduit à une légère contamination. Échéant des ROIs dans ces coupes sériées (tranches 51 à 248 de 435 tranches au total) contenant des cellules de deux cibles choisis dans la pile de la FLM étaient alors enregistrés avec une taille de pixel d’image nm 5 (Figure 3D; Voir aussi Supplemental film S2).
Automatisé imagerie hiérarchique des tableaux dans le SEM décrit ici a été fait avec la solution de plate-forme de logiciel/matériel ZEISS Atlas 5. Tout d’abord, un aperçu de l’ensemble a été créé à l’aide du détecteur SE, avec très grand (1 000 nm) image pixels et temps de demeure très faible (Figure 4 a). Un retour sur investissement décrivant uniquement les tissus a été placé sur la première section, puis propagée à toutes les autres sections du tableau. Cet ensemble de section est ensuite enregistré avec 60 pixels de l’image nm à l’aide d’un plus long temps de pause (Figure 4 b). Enfin, un ensemble de site, contenant les cellules deux cibles plus un « couche » qui entoure les cellules pour tenir compte de l’imprécision de la scène, a été mis en place avec les paramètres suivants : détecteur de ESB (rétrodiffusion sélective de l’énergie), image de nm 5 pixels, très longues (40 µs) habitent le temps ( Figure 4). Zoomer sur une telle image montre en détail subcellulaire (Figure 4) tels que les vacuoles (V), les mitochondries (M), noyau (N) et le réticulum endoplasmique (flèches). Voir aussi le S3 de film supplémentaire pour zoom avant d’un aperçu de l’ensemble au détail subcellulaire d’une cellule cible.
Le tableau ci-contre (200 articles) plus un supplément de 250 sections a pris environ 8 h pour produire, une nuit sur la tache pour LM et un jour enregistrer (manuellement) à la FLM. Après coloration prend environ 1-2 h au total, selon le nombre de tableaux individuels. Pour l’enregistrement de la SEM, quelques heures sont nécessaires pour configurer l’exécution de l’Atlas, et enregistrement automatisé a été de 3 à 4 h pour l’ensemble de section résolution moyenne (taille de pixel de 60 nm) (200 sections, 450 x 200 µm2) et environ 5 jours pour la haute résolution (5 nm taille en pixels) ROI contenant des cellules de deux cibles (200 sections, 55 x 30 µm2). Notez qu’en raison de la faible teneur en métal de l’exemple montré ici, une vitesse de balayage très lente devait être utilisée pour atteindre une bonne détection de signal-bruit, qui implique (pour le détecteur actuellement disponible) un temps de pause de 40 µs pour le ROI à haute résolution.
Il existe plusieurs étapes dans le workflow entier sujettes aux pièges : idéalement rubans devraient être plus ou moins droite et placé dans le bon ordre (Figure 5 a). Cependant, bent (Figure 5 b), courbe (Figure 5) ou même cassés rubans sont souvent produites. Ceci peut aboutir en raison de parage incorrect (attaque et bords de fuite pas parfaitement parallèles) ou adhésif non uniformément appliquée, mais aussi d’un échantillon d’asymétrique ou inégalement infiltré. Sont particulièrement gênants des échantillons contenant des composants douces et très durs. Les derniers éléments peuvent être difficiles à infiltrer tels que la paroi cellulaire des plantes racines ci-contre (Figure 5). Dans ce cas, les plis (pointes de flèches) peuvent facilement être causées par variable compression et détente pendant la découpe. Automatisé d’imagerie dans le SEM, rubans courbes ne sont pas un grand problème, puisque la ROIs peuvent être tournée pour tenir compte de la courbure du ruban.
La coloration est une autre étape essentielle dans le protocole : lavage insuffisant peut entraîner des résidus sur la section (Figure 5E, F) et dans le pire des cas, recouvrir la surface plus intéressante (cercle sur l’une des cellules deux cibles Figure 5F). En outre, poussière (Figure 5, les particules de diffusion de la lumière fortement) introduit dans le bateau de couteau, par exemple, avec un transporteur de substrat sale, peut causer de sérieux problèmes : dans la FLM, la poussière peut être très fluorescent (cf. quelques tranches dans film supplémentaire S1) à tel point que certains algorithmes d’enregistrement ne fonctionnent pas. La fonction « aligner » dans TrakEM17 , toutefois, peut gérer ces piles comme illustré dans le Supplément S1 du film.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig1.jpg"> Figure 1 : Workflow pour l’imagerie hiérarchique corrélatif. À partir d’un échantillon incorporés dans un bloc de résine (A, échantillon fortement métallisé), l’échantillon est premier Paré (B, échantillon faiblement métallisé) et ensuite les tableaux consistant en plusieurs rubans de coupes sériées (C), placé ici sur un ITO-enduit lamelle couvre-objet, sont fabriqués avec un ultramicrotome. Après coloration avec un colorant fluorescent, piles d’images sont enregistrées dans un grand champ FLM (D). Après que coloration plus rondes et heavy metal, sels, les piles sont imagés dans un SEME–(G) à différentes résolutions (tailles pixel d’image). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig2.jpg"> Figure 2 : outils pour la préparation de tableaux de. Porte-substrat assemblés à partir de micromanipulateurs avec sept axes de mouvement attaché à un ultramicrotome standard (A) : les vis, a mis en évidence avec des cercles, sont pour la verticale (1) et (2) déplacement horizontal et inclinaison (3) du transporteur substrat . Le couteau diamant jumbo avec un bateau surdimensionné pour accueillir de grands substrats (flèche), ici avec un morceau de gaufrette de silicium activé par plasma monté sur un support aluminium taille lame (B). 20 gouttes µL d’eau distillée placée sur un substrat de gaufrette de silicium non traitées (C) ou sur un substrat activé par plasma (D). Quatre rubans flottant dans le bateau de couteau, attaché à une lamelle de ITO-enduit par leurs extrémités inférieures. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig3.jpg"> Figure 3 : corrélation des données avec des données SEM LM. Vue d’ensemble (A, C) et des cellules cibles (B, D) enregistrement avec FLM (A, B) et SEM (C, D). (B) est un zoom de logiciel et les données d’origine ont été enregistrées avec une lentille d’objectif X 40 sur une puce de 1 388 x 1 040 pixels appareil photo, tandis que (C) est enregistré avec 60 taille de pixel image nm et (D) avec 5 nm pixel taille de l’image illustrant le vrai augmentation de la résolution dans la SEM. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig4.jpg"> Figure 4 : hiérarchique d’imagerie dans le SEM à l’aide de ZEISS Atlas 5 AT. Vue d’ensemble d’un tableau enregistré avec 1 000 pixels de l’image nm en utilisant le détecteur SE (A). L’article définit avec le ROI placé sur le tissu dans chaque section et enregistré avec 60 pixels de l’image nm (B). Site des ensembles avec un retour sur investissement série placés sur des cellules cibles et enregistré avec 5 pixels de l’image nm (C). Lorsque vous zoomez dans ces images à haute résolution (D), compartiments de membrane intracellulaire comme vacuoles (V), noyau (N), (M) les mitochondries et le réticulum endoplasmique (flèches) deviennent visibles. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig5.jpg"> Figure 5 : problèmes typiques. 1. compte tenu du processus de découpe : rubans placés sur les lamelles ITO-enduit compression sont idéalement droite (A), mais irrégulière au cours de la section peuvent causer un bent (B) ou rubans courbes (D) ou même des plis (C). 2. causés par la manipulation de substrat et rubans dans l’eau, par exemple, lors de coupes et de coloration : diffusion de particules sur le substrat (D) de la lumière, jante de gouttelettes sur la section (cercle E) ou de la saleté barbouillé dehors sur des tissus due à l’insuffisance lavage après coloration (F). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
S1 de film supplémentaire : pile FLM image. 435 images alignement en Fidji16 à l’aide de TrakEM17 et enregistré en tant que fichier vidéo (.avi). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS1.avi">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
S2 de film supplémentaire : pile d’image SEM. 210 images alignées en Fidji16 à l’aide de TrakEM17. Le tapis de départ (300 images) de cet ensemble de données a été 15GO. Pour réduire la pile de 3,3 Go (après l’alignement et le recadrage à seulement deux cellules ciblent), il a été mis à l’échelle en x et y d’un facteur de 0,2 à l’aide de Fidji et puis enregistré sous film .avi. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS2.avi">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
S3 de film supplémentaire : zoom avec niveaux de résolution différente dans la SEM. Film créé en et exportés du logiciel Atlas 5 au format .mp4. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS3.mp4">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

Ce protocole cible les cellules dans le tissu pour l’imagerie à l’échelle nanométrique de résolution à l’aide d’un microscope électronique à balayage (SEM). Un grand nombre de coupes sériées de matériel biologique enrobées dans la résine est imagé tout d’abord dans un microscope photonique à identifier la cible, puis de façon hiérarchique dans le SEM.

Imagerie multimodale de hiérarchique de coupes sériées, pour trouver les cibles cellulaires spécifiques au sein de grands Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

L’objectif global de ce flux de travail est d’identifier certaines cibles pour l’imagerie ultrastructurale dans un tissu à l’aide de la microscopie optique suivie d’une imagerie 3D dans un MEB à très haute résolution. Le flux de travail d’imagerie présenté ici peut aider à répondre à des questions clés sur l’ultrastructure cellulaire ou tissulaire dans un certain nombre de domaines, tels que la biologie cellulaire, la biologie du développement, les neurosciences ou même la pathologie. Le principal avantage de la technique, qui est en fait basée sur la tomographie en réseau, est que le découpage des tissus en réseaux de sections en série facilite l’identification des structures cibles, même lorsqu’elles sont initialement enfouies à l’intérieur du volume d’échantillon d’origine.La tomographie par réseau a été introduite à l’origine dans un contexte de neurosciences, mais elle peut également être appliquée à un large éventail d’autres systèmes, y compris les bactéries, les plantes, les animaux et même les échantillons de patients dans un contexte de pathologie. Les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il est très difficile de collecter de nombreuses sections en série. Travailler sans support supplémentaire peut entraîner la perte de sections ou le désarrangement des rubans.À l’aide d’une minuscule brosse formée de quelques poils fixés à un cure-dent, enduire soigneusement les côtés avant et arrière d’un bloc pré-coupé d’un mélange adhésif. Effectuez cette étape rapidement car le solvant de ce mélange s’évapore en quelques secondes. Pendant que les échantillons sèchent, coupez des morceaux de plaquettes de silicium à une taille qui s’adapte au bateau du couteau et marquez-les avec un traceur en diamant.Ensuite, nettoyez manuellement la plaquette de silicium avec de l’isopropanol et un chiffon non pelucheux. Fixez le substrat à une extrémité de la plaque de support à l’aide d’un adhésif amovible. Une fois pris, le plasma active le substrat en utilisant une décharge luminescente avec de l’air pour obtenir une surface hydrophile.Avec le substrat monté plus près du tranchant du couteau, insérez le support dans la pince du support de substrat. Ensuite, insérez un couteau diamanté jumbo dans le porte-couteau et réglez l’angle de dégagement à zéro degré. Ensuite, remplissez le bateau à couteaux avec de l’eau distillée.Approchez-vous du couteau de manière à ce qu’il soit à un à deux millimètres de l’échantillon. Ensuite, abaissez le substrat dans l’eau à l’aide des vis un à trois du support de substrat. Vérifiez que la ligne d’eau est située dans le tiers supérieur du substrat.Comme il est difficile de voir la garde au sol lorsque vous utilisez une plaquette de silicium, abaissez le substrat jusqu’à ce qu’il touche le sol. Ensuite, soulevez un peu le substrat. Assurez-vous que ni le substrat ni le support ne toucheront le bateau à couteaux pendant la coupe.Ensuite, utilisez une seringue ou une pipette pour régler le niveau d’eau dans le bateau. Tout en observant à l’aide des jumelles, ajoutez ou retirez de l’eau jusqu’à ce que toute la surface de l’eau présente une réflexion homogène de l’éclairage lumineux supérieur de l’ultramicrotome. Une fois la configuration terminée, commencez à sectionner l’échantillon.Lorsqu’un certain nombre de sections ont été coupées, arrêtez le processus de sectionnement et libérez le ruban du bord du couteau en caressant doucement le bord du couteau avec un cil ou un poil de chat très doux. Manipulez le ruban vers le substrat et poussez doucement la première section du ruban pour le fixer à la partie sèche du substrat. Continuez à sectionner l’échantillon et à fixer les rubans au substrat.Commencez d’un côté du substrat et déplacez-vous progressivement vers l’autre à chaque nouveau ruban. Lorsque le substrat est complètement recouvert de rubans, soulevez doucement le substrat du bateau à couteaux à l’aide des vis du micromanipulateur du support de substrat. Laissez sécher le réseau de rubans, puis rangez-le dans un environnement à l’abri de la poussière.Après séchage, retirez le substrat monté sur adhésif dès que possible du support. Ensuite, colorez votre échantillon pour la microscopie optique comme décrit dans le protocole de texte ci-joint et effectuez l’imagerie. Ensuite, colorez l’échantillon pour la microscopie électronique et montez-le sur des talons en aluminium avec un tampon de carbone collant.Imagez maintenant ces réseaux au microscope électronique à balayage à émission de champ. Pour éviter la charge, utilisez des énergies électroniques primaires de trois kV ou moins et un courant de faisceau compris entre 50 et 800 picoampères. Lors de l’utilisation de lamelles en verre revêtu d’ITO, connectez la surface conductrice au support du microscope avec du ruban adhésif en cuivre et de la peinture argentée.La première étape de la cascade d’imagerie hiérarchique consiste à générer une vue d’ensemble du réseau de manière à ce que les sections individuelles puissent être reconnues. Définissez d’abord les quatre coins de votre réseau en représentant graphiquement une image de chaque coin à faible grossissement, environ 100x, puis créez un retour sur investissement englobant l’ensemble du réseau. Attribuez un protocole d’imagerie à ce retour sur investissement avec les paramètres suivants.Utilisez le détecteur d’électrons secondaire pour une imagerie à grande vitesse en utilisant un temps de séjour court d’environ 0,2 microseconde. Choisissez une grande taille de pixel d’image et une taille de tuile de 2000 par 2000 pixels. Le résultat est une image très bruyante, mais même ici, le tissu à l’intérieur de la section est visible.Ensuite, générez un ensemble de sections en créant une région d’intérêt, en décrivant uniquement le tissu de la première section. Clonez-le dans toutes les sections suivantes à l’aide de l’outil de tamponnage. Faites pivoter les zones d’intérêt si nécessaire afin de tenir compte des rubans pliés.Attribuez un protocole à la section présentant le mieux la sous-structure du tissu. Ici, une taille de pixel intermédiaire de 60 nanomètres, une taille de tuile de 12000 par 12000 pixels et un temps de séjour de 3,2 microsecondes ont été utilisés. En raison de la mauvaise qualité, une deuxième section décrivant quelques cellules sélectionnées a été créée à l’aide d’une taille de pixel plus petite et d’un détecteur plus sensible.Maintenant, il est possible de très bien reconnaître les deux cellules cibles. Créez un ensemble de sites dans l’ensemble de sections contenant la structure cible pour l’imagerie MEB à haute résolution. Faites en sorte que la région d’intérêt soit suffisamment grande pour tenir compte de la précision étagée.Vérifiez et ajustez les positions des sites. Le réglage automatique est nécessaire lorsque de nombreuses sections sont imagées. Il est important de placer les régions d’intérêt de manière à ce que le centre ne repose pas sur un matériau vide sans détails structurels, par exemple des vacuoles.Ensuite, définissez les paramètres de mise au point automatique et vérifiez les performances d’imagerie sur toute la longueur d’un ruban sur une petite région d’intérêt proche du site qui sera imagé. Ensuite, définissez un protocole d’imagerie pour l’acquisition MEB haute résolution. Pour voir les compartiments de membrane, choisissez une taille de pixel d’image comprise entre trois et cinq nanomètres.Sélectionnez un temps d’arrêt en fonction du détecteur afin que l’image ne soit pas trop bruyante. Étant donné que la scène doit parcourir une grande distance entre l’enregistrement de cette section et celle de cette section, définissez les valeurs de focus sur au moins la première section de chaque ruban à l’aide de l’option de vérification du protocole. Démarrez ensuite l’imagerie MEB automatisée sur l’ensemble de la série de régions cibles d’intérêt.Une fois terminé, exportez les données acquises sous forme de série d’images, de préférence au format TIF. Importez des séries d’images dans Fidji sous forme de pile virtuelle. Ensuite, recadrez la pile pour un traitement ultérieur en taillant la zone aussi près que possible de la structure d’intérêt.Ajustez également la luminosité et le contraste et enregistrez la pile. Une fois recadré et optimisé, ouvrez un nouveau TrakEM à partir du menu Fichier. Faites un clic droit dans le champ de l’image et importez la pile dans TrakEM sous la forme d’une tranche par couche.En cliquant avec le bouton droit, choisissez Aligner les calques. Choisissez les moindres carrés comme mode, définissez la plage du premier au dernier et choisissez aucun comme référence. Ensuite, sélectionnez les valeurs de paramètre par défaut et choisissez Rigide comme transformation souhaitée.Une fois l’enregistrement terminé et satisfaisant, enregistrez l’ensemble de données aligné en cliquant avec le bouton droit de la souris et en choisissant Exporter. Créez une image plate, définissez la plage de la première à la dernière image et laissez le logiciel afficher la pile résultante. Lorsque vous avez terminé, enregistrez la pile au format TIF.Après préparation, le tableau de sections apparaît sous la forme d’un tableau composé de plusieurs rubans de sections de série. Cette section montre une vue d’ensemble de l’extrémité d’une racine d’arabidopsis, colorée à l’iodure de propidium. Les sections séquentielles de cet échantillon ont été alignées comme décrit dans le protocole et combinées pour afficher l’échantillon en 3D sous la forme d’un seul fichier vidéo.Ici, on peut voir les deux cellules cibles qui seront plus tard imagées à une résolution nanométrique dans le MEB. Après une coloration supplémentaire à l’acétate d’uranyle et au citrate sanguin, les réseaux ont été imagés au microscope électronique. Cette image statique montre la section de l’échantillon d’abord imagée à une résolution de 20 nanomètres et lors de la deuxième série d’imagerie, à une résolution de cinq nanomètres.Ici, 210 images séquentielles du microscope électronique ont été alignées et recadrées comme décrit dans le protocole. La vidéo ne cible que deux cellules et montre comment les vacuoles à l’intérieur des cellules sont disposées et parfois connectées en 3D. L’imagerie hiérarchique automatisée des réseaux dans le MEB illustré ici peut fournir une cartographie transparente à différents niveaux de résolution, allant d’une vue d’ensemble de l’ensemble du réseau aux détails subcellulaires.Au grossissement le plus élevé, les vacuoles, les mitochondries, le noyau et le réticulum endoplasmique sont reconnaissables. Une fois maîtrisé, le placement de rubans de section côte à côte sur un substrat typique peut se faire en quelques heures s’il est effectué correctement. Cela peut fournir des centaines de coupes sur un substrat pour l’imagerie.Le temps d’imagerie pour un si grand nombre de coupes peut varier d’un microscope à l’autre, d’autant plus si vos instruments d’imagerie préférés ont différents niveaux d’automatisation. Il est intéressant de noter que le flux de travail général peut facilement être combiné avec d’autres techniques d’imagerie, telles que la coloration histo standard ou même la candoluminescence, ou qu’il peut simplement être utilisé comme outil autonome pour l’imagerie arthostructurelle de grands volumes. Un autre aspect de ce flux de travail est la facilité d’accès.Les études initiales sont réalisables sans outils supplémentaires ni automatisation, c’est-à-dire sans gros investissement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée du flux de travail et de la façon dont l’imagerie multimodale et hiérarchique peut être utilisée pour cibler et imager des structures intéressantes dans un grand volume 3D à différents niveaux de résolution.

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