Imagerie multimodale de hiérarchique de coupes sériées, pour trouver les cibles cellulaires spécifiques au sein de grands Volumes

L’objectif global de ce flux de travail est d’identifier certaines cibles pour l’imagerie ultrastructurale dans un tissu à l’aide de la microscopie optique suivie d’une imagerie 3D dans un MEB à très haute résolution. Le flux de travail d’imagerie présenté ici peut aider à répondre à des questions clés sur l’ultrastructure cellulaire ou tissulaire dans un certain nombre de domaines, tels que la biologie cellulaire, la biologie du développement, les neurosciences ou même la pathologie. Le principal avantage de la technique, qui est en fait basée sur la tomographie en réseau, est que le découpage des tissus en réseaux de sections en série facilite l’identification des structures cibles, même lorsqu’elles sont initialement enfouies à l’intérieur du volume d’échantillon d’origine.

La tomographie par réseau a été introduite à l’origine dans un contexte de neurosciences, mais elle peut également être appliquée à un large éventail d’autres systèmes, y compris les bactéries, les plantes, les animaux et même les échantillons de patients dans un contexte de pathologie. Les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il est très difficile de collecter de nombreuses sections en série. Travailler sans support supplémentaire peut entraîner la perte de sections ou le désarrangement des rubans.

À l’aide d’une minuscule brosse formée de quelques poils fixés à un cure-dent, enduire soigneusement les côtés avant et arrière d’un bloc pré-coupé d’un mélange adhésif. Effectuez cette étape rapidement car le solvant de ce mélange s’évapore en quelques secondes. Pendant que les échantillons sèchent, coupez des morceaux de plaquettes de silicium à une taille qui s’adapte au bateau du couteau et marquez-les avec un traceur en diamant.

Ensuite, nettoyez manuellement la plaquette de silicium avec de l’isopropanol et un chiffon non pelucheux. Fixez le substrat à une extrémité de la plaque de support à l’aide d’un adhésif amovible. Une fois pris, le plasma active le substrat en utilisant une décharge luminescente avec de l’air pour obtenir une surface hydrophile.

Avec le substrat monté plus près du tranchant du couteau, insérez le support dans la pince du support de substrat. Ensuite, insérez un couteau diamanté jumbo dans le porte-couteau et réglez l’angle de dégagement à zéro degré. Ensuite, remplissez le bateau à couteaux avec de l’eau distillée.

Approchez-vous du couteau de manière à ce qu’il soit à un à deux millimètres de l’échantillon. Ensuite, abaissez le substrat dans l’eau à l’aide des vis un à trois du support de substrat. Vérifiez que la ligne d’eau est située dans le tiers supérieur du substrat.

Comme il est difficile de voir la garde au sol lorsque vous utilisez une plaquette de silicium, abaissez le substrat jusqu’à ce qu’il touche le sol. Ensuite, soulevez un peu le substrat. Assurez-vous que ni le substrat ni le support ne toucheront le bateau à couteaux pendant la coupe.

Ensuite, utilisez une seringue ou une pipette pour régler le niveau d’eau dans le bateau. Tout en observant à l’aide des jumelles, ajoutez ou retirez de l’eau jusqu’à ce que toute la surface de l’eau présente une réflexion homogène de l’éclairage lumineux supérieur de l’ultramicrotome. Une fois la configuration terminée, commencez à sectionner l’échantillon.

Lorsqu’un certain nombre de sections ont été coupées, arrêtez le processus de sectionnement et libérez le ruban du bord du couteau en caressant doucement le bord du couteau avec un cil ou un poil de chat très doux. Manipulez le ruban vers le substrat et poussez doucement la première section du ruban pour le fixer à la partie sèche du substrat. Continuez à sectionner l’échantillon et à fixer les rubans au substrat.

Commencez d’un côté du substrat et déplacez-vous progressivement vers l’autre à chaque nouveau ruban. Lorsque le substrat est complètement recouvert de rubans, soulevez doucement le substrat du bateau à couteaux à l’aide des vis du micromanipulateur du support de substrat. Laissez sécher le réseau de rubans, puis rangez-le dans un environnement à l’abri de la poussière.

Après séchage, retirez le substrat monté sur adhésif dès que possible du support. Ensuite, colorez votre échantillon pour la microscopie optique comme décrit dans le protocole de texte ci-joint et effectuez l’imagerie. Ensuite, colorez l’échantillon pour la microscopie électronique et montez-le sur des talons en aluminium avec un tampon de carbone collant.

Imagez maintenant ces réseaux au microscope électronique à balayage à émission de champ. Pour éviter la charge, utilisez des énergies électroniques primaires de trois kV ou moins et un courant de faisceau compris entre 50 et 800 picoampères. Lors de l’utilisation de lamelles en verre revêtu d’ITO, connectez la surface conductrice au support du microscope avec du ruban adhésif en cuivre et de la peinture argentée.

La première étape de la cascade d’imagerie hiérarchique consiste à générer une vue d’ensemble du réseau de manière à ce que les sections individuelles puissent être reconnues. Définissez d’abord les quatre coins de votre réseau en représentant graphiquement une image de chaque coin à faible grossissement, environ 100x, puis créez un retour sur investissement englobant l’ensemble du réseau. Attribuez un protocole d’imagerie à ce retour sur investissement avec les paramètres suivants.

Utilisez le détecteur d’électrons secondaire pour une imagerie à grande vitesse en utilisant un temps de séjour court d’environ 0,2 microseconde. Choisissez une grande taille de pixel d’image et une taille de tuile de 2000 par 2000 pixels. Le résultat est une image très bruyante, mais même ici, le tissu à l’intérieur de la section est visible.

Ensuite, générez un ensemble de sections en créant une région d’intérêt, en décrivant uniquement le tissu de la première section. Clonez-le dans toutes les sections suivantes à l’aide de l’outil de tamponnage. Faites pivoter les zones d’intérêt si nécessaire afin de tenir compte des rubans pliés.

Attribuez un protocole à la section présentant le mieux la sous-structure du tissu. Ici, une taille de pixel intermédiaire de 60 nanomètres, une taille de tuile de 12000 par 12000 pixels et un temps de séjour de 3,2 microsecondes ont été utilisés. En raison de la mauvaise qualité, une deuxième section décrivant quelques cellules sélectionnées a été créée à l’aide d’une taille de pixel plus petite et d’un détecteur plus sensible.

Maintenant, il est possible de très bien reconnaître les deux cellules cibles. Créez un ensemble de sites dans l’ensemble de sections contenant la structure cible pour l’imagerie MEB à haute résolution. Faites en sorte que la région d’intérêt soit suffisamment grande pour tenir compte de la précision étagée.

Vérifiez et ajustez les positions des sites. Le réglage automatique est nécessaire lorsque de nombreuses sections sont imagées. Il est important de placer les régions d’intérêt de manière à ce que le centre ne repose pas sur un matériau vide sans détails structurels, par exemple des vacuoles.

Ensuite, définissez les paramètres de mise au point automatique et vérifiez les performances d’imagerie sur toute la longueur d’un ruban sur une petite région d’intérêt proche du site qui sera imagé. Ensuite, définissez un protocole d’imagerie pour l’acquisition MEB haute résolution. Pour voir les compartiments de membrane, choisissez une taille de pixel d’image comprise entre trois et cinq nanomètres.

Sélectionnez un temps d’arrêt en fonction du détecteur afin que l’image ne soit pas trop bruyante. Étant donné que la scène doit parcourir une grande distance entre l’enregistrement de cette section et celle de cette section, définissez les valeurs de focus sur au moins la première section de chaque ruban à l’aide de l’option de vérification du protocole. Démarrez ensuite l’imagerie MEB automatisée sur l’ensemble de la série de régions cibles d’intérêt.

Une fois terminé, exportez les données acquises sous forme de série d’images, de préférence au format TIF. Importez des séries d’images dans Fidji sous forme de pile virtuelle. Ensuite, recadrez la pile pour un traitement ultérieur en taillant la zone aussi près que possible de la structure d’intérêt.

Ajustez également la luminosité et le contraste et enregistrez la pile. Une fois recadré et optimisé, ouvrez un nouveau TrakEM à partir du menu Fichier. Faites un clic droit dans le champ de l’image et importez la pile dans TrakEM sous la forme d’une tranche par couche.

En cliquant avec le bouton droit, choisissez Aligner les calques. Choisissez les moindres carrés comme mode, définissez la plage du premier au dernier et choisissez aucun comme référence. Ensuite, sélectionnez les valeurs de paramètre par défaut et choisissez Rigide comme transformation souhaitée.

Une fois l’enregistrement terminé et satisfaisant, enregistrez l’ensemble de données aligné en cliquant avec le bouton droit de la souris et en choisissant Exporter. Créez une image plate, définissez la plage de la première à la dernière image et laissez le logiciel afficher la pile résultante. Lorsque vous avez terminé, enregistrez la pile au format TIF.

Après préparation, le tableau de sections apparaît sous la forme d’un tableau composé de plusieurs rubans de sections de série. Cette section montre une vue d’ensemble de l’extrémité d’une racine d’arabidopsis, colorée à l’iodure de propidium. Les sections séquentielles de cet échantillon ont été alignées comme décrit dans le protocole et combinées pour afficher l’échantillon en 3D sous la forme d’un seul fichier vidéo.

Ici, on peut voir les deux cellules cibles qui seront plus tard imagées à une résolution nanométrique dans le MEB. Après une coloration supplémentaire à l’acétate d’uranyle et au citrate sanguin, les réseaux ont été imagés au microscope électronique. Cette image statique montre la section de l’échantillon d’abord imagée à une résolution de 20 nanomètres et lors de la deuxième série d’imagerie, à une résolution de cinq nanomètres.

Ici, 210 images séquentielles du microscope électronique ont été alignées et recadrées comme décrit dans le protocole. La vidéo ne cible que deux cellules et montre comment les vacuoles à l’intérieur des cellules sont disposées et parfois connectées en 3D. L’imagerie hiérarchique automatisée des réseaux dans le MEB illustré ici peut fournir une cartographie transparente à différents niveaux de résolution, allant d’une vue d’ensemble de l’ensemble du réseau aux détails subcellulaires.

Au grossissement le plus élevé, les vacuoles, les mitochondries, le noyau et le réticulum endoplasmique sont reconnaissables. Une fois maîtrisé, le placement de rubans de section côte à côte sur un substrat typique peut se faire en quelques heures s’il est effectué correctement. Cela peut fournir des centaines de coupes sur un substrat pour l’imagerie.

Le temps d’imagerie pour un si grand nombre de coupes peut varier d’un microscope à l’autre, d’autant plus si vos instruments d’imagerie préférés ont différents niveaux d’automatisation. Il est intéressant de noter que le flux de travail général peut facilement être combiné avec d’autres techniques d’imagerie, telles que la coloration histo standard ou même la candoluminescence, ou qu’il peut simplement être utilisé comme outil autonome pour l’imagerie arthostructurelle de grands volumes. Un autre aspect de ce flux de travail est la facilité d’accès.

Les études initiales sont réalisables sans outils supplémentaires ni automatisation, c’est-à-dire sans gros investissement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée du flux de travail et de la façon dont l’imagerie multimodale et hiérarchique peut être utilisée pour cibler et imager des structures intéressantes dans un grand volume 3D à différents niveaux de résolution.