Name: Caractérisation de la Migration cellulaire dans les trois dimensions In Vitro plaie environnements (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Découvrez une méthode reproductible pour analyser la migration cellulaire dans une matrice de fibrine 3D. Cette technique permet d'étudier les effets de facteurs pro- et anti-migratoires sur la cicatrisation des plaies.

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Financement de ce travail a été fourni par le biais de l’American Heart Association (16SDG29870005) et la North Carolina State University Research et le financement de démarrage de l’Innovation.

1. jour 1 : cellule et préparation du réactif Remarque : toutes les préparations cellulaires et réactif doivent être effectuée sous une hotte pour prévenir la contamination des échantillons de sécurité biologique.
<ol><li>Chaud filtré Dulbecco &#39; s Modified Eagle &#39; s moyen (DMEM), sérum fœtal (SVF), L-glutamine et la pénicilline/streptomycine dans un bain-marie à 37 ° C.</li>
	<li>Médias néonatale fibroblastes dermiques humains (HDFn) Prepare par complétant réchauffement DMEM avec 10 % FBS, pénicilline/streptomycine de 1 % et 1 % L-glutamine.</li>
	<li>Décongeler un flacon de gelée HDFns et centrifuger pendant 8 min à 200 x g à éliminer le milieu de la cryoconservation. Remettre en suspension des cellules dans des milieux de HDFn préparés à une densité de 1 x 10 6 cellules/mL et graines dans un flacon de culture de T-75.</li>
	<li>Ballon de Place dans un incubateur (37 ° C, 5 % de CO 2) pour permettre la prolifération cellulaire.</li>
	<li>Store HDFn médias à 4 ° C.</li>
	<li>Préparer les pro - et anti - migratory réactifs si nécessaire.</li>
</ol> 2. Jour 3 : Préparation de sphéroïde <ol><li>effectuez les opérations suivantes dans une hotte de culture pour éviter la contamination des échantillons de.</li>
	<li>Lorsque les cellules atteignent 80 % confluence, aspirer les médias et ajouter 5 mL de 0,25 % trypsine-EDTA. Fiole de magasin dans un incubateur à 37 ° C pendant 5 min détacher complètement les cellules de la surface de la fiole.</li>
	<li>Ajouter 5 mL de médias réchauffée dans le ballon pour neutraliser la trypsine.</li>
	<li>Dans un tube de microcentrifuge, mélanger 10 μL de bleu Trypan et 10 μl de la suspension cellulaire.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire original pendant 8 min à 200 x g.</li>
	<li>Tandis que la suspension cellulaire est être centrifugée, ajouter 10 μL de la suspension cellulaire bleu Trypan à un hémocytomètre et effectuer un comptage cellulaire.</li>
	<li>Après centrifugation, aspirer les médias sans déloger le culot cellulaire. Resuspendre le culot de cellules à une concentration de 1,25 x 10 5 cellules/mL.</li>
	<li>Ajouter 5 mL de sérum physiologique stérile tamponnée au phosphate (PBS) au fond d’une boîte de Pétri pour maintenir un environnement hydraté durant la croissance de sphéroïde de 10 cm.</li>
	<li>Inverser le couvercle de la boîte de Pétri. Ajouter quelques 20 μL gouttes de la suspension de cellules sur la surface intérieure du couvercle de la boîte de Pétri.</li>
	<li>Rapidement inverser le couvercle à nouveau et remettez-la sur le fond du plat, en veillant à ne pas déloger les gouttes de pendaison. la figure 1 illustre les gouttes suspendues correctement formé.</li>
	<li>Soigneusement placer la capsule dans un incubateur à 37 ° C et laisser les sphéroïdes à grandir dans un accrochage déposer culture pendant une période de 72 h.</li>
</ol> 3. Jour 6 : Intégrer les sphéroïdes dans matrice 3D <ol><li>effectuez les opérations suivantes dans une hotte de culture pour éviter la contamination des échantillons de.</li>
	<li>Pour la formation de la première couche de fibrine, créez une solution de caillot d’un volume suffisant d’ajouter 100 μL de solution caillot / puits puits autant que nécessaire (1 sphéroïde / puits). Les caillots sont composés de 10 % 10 X HEPES tampons par volume (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl 2, pH 7,4), fibrinogène humain 2 mg/mL et thrombine alpha humain de 0,1 U/mL. Le reste du volume caillot se compose de l’eau ultrapure.
	<ol><li>Ajouter la thrombine dernière et rapidement ajouter solution aux puits désirées dans une plaque de 48 puits afin d’empêcher la polymérisation avant d’être ajouté aux puits de caillots.</li>
	</ol></li> <li>Doucement agiter/robinet plaque puits pour s’assurer que mélange de caillot de fibrine est enduit tout le bien et puis placez la plaque bien dans l’incubateur pendant 1 h permettre à la couche inférieure de caillot à polymériser. Ne secouez pas la plaque bien assez dur pour induire la formation de bulles ; plaque de roche simplement que nécessaire jusqu'à ce que l’intégralité du puits est enduite. Si de plus grands volumes de caillot sont utilisées, cette étape n’est peut-être pas nécessaire.</li>
	<li>Transfert des sphéroïdes à la couche de fibrine.
	Plaque <ol><li>enlever le puits et la boîte de Pétri contenant des sphéroïdes à la pendaison abandonner la culture de l’incubateur et examinez les sphéroïdes sous un microscope. Puis placez le plat sur le capot de la culture.</li>
		<li>Inverser soigneusement le couvercle de la boîte de Pétri pour permettre l’accès à la pendaison drop cultures.</li>
		<li>à l’aide d’une aiguille de 21 G attachée à une seringue de 1 mL, transvaser avec soin une goutte du couvercle inversé dans le centre de chaque bien, en prenant soin de ne pas pour percer la couche de fibrine polymérisée revêtement du fond du puits. Pour transférer efficacement la chute, tirez lentement sur la chute dans l’aiguille. Arrêter de tirer le piston arrière dès que la chute de l’ensemble est à l’intérieur de l’aiguille ; tirant la baisse trop loin peut introduire des bulles d’air, qui peuvent perturber le transfert efficace de sphéroïde ou imagerie ultérieure.</li>
		<li>Examiner la plaque bien sous microscope pour s’assurer que les sphéroïdes ont correctement transférées dans des puits tout désirées.</li>
	</ol></li> <li>Pour la formation de la deuxième couche de fibrine, créez une autre solution de caillot à l’aide de la même préparation que ci-dessus pour la création de la première couche de fibrine (étape 3.2). Soigneusement distribuer 100 μL sur chaque goutte contenant du sphéroïde et examiner sous un microscope pour vérifier que les sphéroïdes sont toujours intacts et n’ont pas été poussés jusqu’aux bords des puits.</li>
	<li>Retourner la plaque bien dans l’incubateur et autoriser la deuxième couche polymériser pendant 1 h.</li>
</ol> 4. Jour 6 : Ajout de Pro-migrateurs ou de facteurs inhibiteurs <ol><li>médias HDFn chaud à 37 ° C.</li>
	<li>Effectuez les opérations suivantes dans une cagoule pour éviter la contamination.</li>
	<li>Préparer les milieux pour chaque groupe, y compris les concentrations appropriées d’agents pro/anti-migratory à évaluer.</li>
	<li>Enlever la plaque bien de l’incubateur et le placer dans une hotte de culture.</li>
	<li>Ajouter 500 μl de support standard dans chaque puits du groupe témoin sphéroïde, 500 μL d’inhibiteur médias dans chaque puits du groupe inhibées par migration sphéroïde et 500 μL des médias pro-migrateurs dans chaque puits du groupe migration améliorée sphéroïde.</li>
	<li>Remettez la plaque bien dans l’incubateur.</li>
	<li>Médias de changement chaque 48 h.</li>
</ol> 5. Jours 6-9 : évaluation de la Migration cellulaire et la prolifération <ol><li>Image sphéroïdes microscope à fond clair immédiatement après l’ajout de médias (0 h) et ensuite toutes les 24 h pendant 72 h. facultatif : à chaque point dans le temps, prendre une image de z-pile afin de déterminer si migration se produit dans des plans à l’extérieur le principal domaine d’activité. Dans notre expérience, cela ne fonctionne pas ; Toutefois, il est utile de s’assurer que c’est le cas dans chaque expérience.</li>
	<li>Utilisation ImageJ pour déterminer l’excroissance cellulaire dans chaque puits en analysant les pourcentages d’augmentation dans la zone pour chaque ellipsoïde en traçant la bordure de cellule pour chaque ellipsoïde à chaque point de temps successifs et en utilisant la &#34; mesure &#34; fonction pour obtenir le domaine.</li>
</ol>

<ol><li>Chester, D., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+biophysical+properties+of+provisional+matrix+proteins+in+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair.</a> Matrix Biol. , (2016).</li>
<li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cells+during+wound+repair%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li>
<li>Lin, B., Yin, T., Wu, Y. I., Inoue, T., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+chemotaxis+and+contact+inhibition+of+locomotion+determines+exploratory+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Interplay between chemotaxis and contact inhibition of locomotion determines exploratory cell migration.</a> Nat Commun. 6, 6619(2015).</li>
<li>Ngalim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+Adhesive+and+Soluble+Gradients+for+Imaging+Cell+Migration+with+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole permet l’examen de la migration cellulaire dans la cicatrisation des plaies entraînées SEGDA via un modèle 3D in vitro . Une étape cruciale dans la bonne exécution de la procédure est le bon développement des sphéroïdes de fibroblastes ; la concentration cellulaire au cours de la préparation a été optimisée pour donner une concentration initiale de 2 500 cellules/drop, permettant des sphéroïdes à forme fiable sur une période d’incubation de 72 h. Si un nombre suffisant de cellules est utilisé, les s...

La cicatrisation est un processus complexe qui se traduit par la restauration de l’intégrité des tissus après une blessure. Cette démarche est subdivisée en quatre étapes qui se chevauchent par hémostase, inflammation, prolifération et le remodelage, qui font chacun l’objet par une combinaison complexe de signaux solubles, interactions cellule-matrice et les cellules communications. 1 , 2 l’orchestration de ces repères gère une multitude de réactions cellulaires dans la cicatrisation des plaies dont, surtout, la migration cellulaire. 3 , 4 la migration cellulaire est un processus très dynamique dépendant sur les propriétés biochimiques et biophysiques du milieu extracellulaire et les phénotypes cellulaires. 5 cellules sonder en permanence leur environnement de matrice extracellulaire par des voies induite par l’intégrine ; Ce processus permet aux cellules de détecter une large gamme de propriétés de la matrice dont la topographie, de rigidité et de confinement. Bidimensionnelle (2D) analyse de la migration cellulaire démontre que la migration est entraînée par formation de lamellipodia à la pointe grâce à la génération de faisceaux de filaments d’actine. Formation subséquente des adhérences focales à la fine pointe, en combinaison avec l’actomyosine piloté par la contraction et la rentrée sur le bord de fuite, pousse la cellule vers l’avant. 6 la migration cellulaire tridimensionnelle (3D) n’est actuellement pas bien comprise, cependant, des études récentes démontrent que la migration 3D est nettement différente de l’afore décrit le mécanisme en 2D et est probablement entraînée par des mécanismes altératif. Par exemple, des études récentes par Petrie et al. démontré que, en fonction des propriétés de l’ECM, cellules dans des matrices 3D peuvent basculer entre lamellipodium et lobopodium par les mécanismes de la migration. 7 migration cellulaire étant un élément essentiel de la réponse de cicatrisation, des modèles 3D de la migration cellulaire sont essentiels pour la compréhension des réponses physiologiques à divers stimuli pendant la cicatrisation. Bien que le comportement migrateur cellule sur une surface 2D s’est avéré varient considérablement d’un migration dans des matrices 3D, des modèles in vitro plus actuels de la migration cellulaire durant la processus, y compris le dosage zéro bien établi, de cicatrisation utilisent 2D cultures monocouches. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 tests développés plus récemment ont utilisé une matrice 3D, mais encore la culture des cellules dans une monocouche sur le dessus de la matrice, ce qui limite la possibilité de véritablement récapituler la tridimensionnalité de l’environnement de la cellule in vivo. 15
Le but de la méthode décrite ici est d’étudier la migration cellulaire dans un modèle 3D physiologiquement pertinent, plutôt que sur une surface 2D, afin d’acquérir une compréhension plus robuste de réponses de migration associés avec les stimuli appliqués. Cette méthode permet l’évaluation de la migration cellulaire dans une matrice de caillot de fibrine 3D en présence de facteurs qui activer ou inhiber les voies associés à la migration cellulaire. Une matrice de fibrine a été choisie pour cette méthode en raison du rôle critique fibrine joue dans les premiers stades de la cicatrisation des plaies ; après une blessure, un caillot de fibrine est formée dans les environnements de la plaie pour enrayer la perte de sang et sert comme un échafaudage pour l’infiltration de la cellule initiale au cours de la réparation des tissus et le remodelage. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 en outre, fibrine est utilisé en clinique comme mastic chirurgical et la composition de l’étanchéité a été liée à la migration cellulaire et ultimate résultats de guérison. Une étude antérieure par Cox et al. a étudié la migration des fibroblastes avec caillots de fibrine composés de fibrine variable et des concentrations de thrombine pour optimiser une fibrine. Dans ces études, la migration des cellules hors les caillots de fibrine sur la vaisselle en plastique a été quantifiée. 20 nous présentons ici une méthode qui permet à la quantification de la migration des cellules dans l’environnement 3D de fibrine. Tandis que la méthode décrite dans le présent protocole spécifiquement utilise fibrine, ce modèle peut facilement être modifié pour utiliser des matériaux à matrice alternative comme vous le souhaitez, comme le collagène ou d’autres matrices 3D. En outre, nous présentons l’utilisation des sphéroïdes de fibroblastes dans ce test parce que la migration des fibroblastes dans le lit de la plaie est d’une importance primordiale à la synthèse de la matrice extracellulaire et réparation/remodelage des tissus. Cependant, au cours de la réparation processus neutrophiles sont le premier type de cellule à migrer dans le lit de la plaie, suivi par les macrophages. Fibroblastes commencent alors à s’infiltrer dans l’environnement de la plaie environ 48 heures après la lésion initiale, au début de la phase proliférative de la processus de cicatrisation. 19 ce dosage peut être facilement modifié pour inclure les neutrophiles, les macrophages ou autres types de cellules afin d’évaluer l’incidence des altérations de structure de caillot de fibrine sur migration de ces types de cellules. 21
Pour implémenter ce dosage, tout d’abord, un sphéroïde de fibroblastes se forme à l’aide d’une modification des techniques décrites précédemment pour la culture de cellules souches. 22 la sphéroïde de fibroblastes est transférée par la suite dans une matrice de fibrine 3D et excroissance ensuite facilement surveiller et quantifié sur plusieurs jours. Ce protocole prend en compte la 3D des systèmes physiologiques en incorporant des sphéroïdes cellule 3D au sein d’une matrice de fibrine, évitant ainsi les limitations en pertinence provoquée par un en utilisant une surface de croissance 2D avec une monocouche de cellules au comportement migratoire de modèle, tandis que en permettant l’évaluation du comportement des cellules dans un milieu hautement contrôlé en vitro .

<table><tbody><tr><td>Matériaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, 4,5 g/L de glucose, avec pyruvate de sodium, sans L-glutamine</td><td>VWR</td><td>VWRL0148-0500</td><td>Le DMEM contenant déjà de la L-glutamine peut également être utilisé</td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire de 100 mm, non traitée, stérilisée, non pyrogène</td><td>VWR</td><td>10861-594</td><td>Des plats de n’importe quelle taille peuvent être utilisés pour la culture de gouttes suspendues&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal provenant de pays approuvés par l’USDA, inactivé par la chaleur, filtré stérilement, testé en culture cellulaire</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1680149</td><td>Non nécessaire si vous utilisez du DMEM qui contient déjà de la L-glutamine&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine Solution stabilisée, stérile-filtrée, avec 10 000 unités de pénicilline et 10 mg de streptomycine/mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastes dermiques humains, néonatals</td><td>Thermo Fisher</td><td>C0045C</td><td>Peut être remplacé par un autre type de cellule d’intérêt</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2' aiguille</td><td>BD&nbsp ;</td><td>305167</td><td>aiguilles de 22 G x 1 1/2 feront également l’affaire</td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL</td><td>VWR</td><td>89174-491</td><td>Des seringues de n’importe quel volume peuvent être utilisées</td></tr><tr><td>Plaques multipuits de culture cellulaire, polystyrène, Greiner Bio-One (enveloppé individuellement) (48 puits)</td><td>VWR</td><td>82051-004&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogène humain - Plasminogène, facteur de von Willebrand et Laboratoires</td><td>de recherche sur les enzymes</td> appauvries en fibronectine <td>FIB 3</td><td>Peut être remplacé par une protéine matricielle d’intérêt Laboratoires de recherche sur l’enzyme</td></tr><tr><td>alpha-thrombine humaine</td><td></td><td>HT 1002a</td><td>Peut ne pas être nécessaire en fonction de la protéine matricielle d’intérêt</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Hotte <td></td><td></td><td></td><td>de culture cellulaire BSL2</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td></td><td></td><td></td>de culture cellulaire</tr><tr><td>Microscope inversé avec objectif</td><td></td><td></td><td></td>10X</tr><tr><td>Compatible avec les centrifugeuses avec tubes</td><td></td><td></td><td></td> de 15 mL</tr></tbody></table>

caractérisation de la migration cellulaire dans les trois dimensions in vitro plaie environnements

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Actuellement, la plupart in vitro des modèles de la cicatrisation, notamment des essais de gratter bien établies, impliquent l’étude cell migration plaie fermeture et sur une surface à deux dimensions. Cependant, l’environnement physiologique dans lequel in vivo de cicatrisation se déroule est en trois dimensions plutôt que deux dimensions. Il devient de plus en plus évident que le comportement cellulaire diffère grandement en deux dimensions par rapport à des environnements en trois dimensions ; par conséquent, il y a un besoin pour plus physiologiquement pertinents en vitro modèles pour l’étude des comportements de migration cellulaire dans la fermeture de la plaie. La méthode décrite ici permet l’étude de la migration cellulaire dans un modèle en trois dimensions qui reflète mieux les conditions physiologiques que tests gratter deux dimensions précédemment établies. Ce modèle vise à évaluer l’excroissance cellulaire par l’intermédiaire de l’examen de la migration cellulaire loin un sphéroïde de corps incorporé dans une matrice de fibrine en présence de facteurs de pro - ou anti - migratory. En utilisant cette méthode, excroissance cellulaire du corps sphéroïdes dans une matrice tridimensionnelle peut être observée et est facilement quantifiable au fil du temps via fond clair microscopie et analyse d’une partie du corps sphéroïde. L’effet de facteurs pro-migrateurs et/ou inhibitrices sur la migration cellulaire peut également être évaluée dans ce système. Cette méthode fournit aux chercheurs avec une méthode simple d’analyse de la migration cellulaire dans la plaie tridimensionnelle associée matrices in vitro, ce qui accroît la pertinence de in vitro cellule études avant l’utilisation d’in vivo de l’animal modèles.

Culture de l’ellipsoïde peut être utilisée pour évaluer correctement l’effet d’agents pro et anti-migrateurs sur la migration des fibroblastes in vitro Sphéroïdes de fibroblastes 3D peuvent être formés par chute de culture en suspension sur une période de 72 h (Figure 1). Après la période de culture, sphéroïdes sont intégrés au sein de la matrice de caillot et imagés microscope à fond clair (Figure 2). Les pre...

Ce protocole vise à évaluer l’effet des facteurs pro - et anti - migratory sur la migration cellulaire dans une matrice de fibrine en trois dimensions.

Caractérisation de la Migration cellulaire dans les trois dimensions In Vitro plaie environnements

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

L'objectif général de cette procédure est d'observer l'effet de traitements spécifiques d'intérêt sur la migration cellulaire dans un échafaudage tridimensionnel de fibrine associé à une plaie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la cicatrisation des plaies, notamment sur la manière dont les modifications de la structure du réseau de fibres influencent la migration cellulaire vers les caillots de fibrine présents sur les sites de plaie. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'elle fournit une méthode simple et reproductible pour analyser la migration cellulaire au sein de caillots de fibrine en 3D. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car le transfert des sphéroïdes peut s'avérer délicat.Commencez par réchauffer un flacon de fibroblastes dermiques humains néonatals congelés dans un bain d'eau à 37 °C. Lorsque les cellules sont juste décongelées, récupérez-les par centrifugation et remettez en suspension le culot dans un milieu frais pour fibroblastes dermiques humains néonatals à une concentration de 1 × 10⁶ cellules par millilitre. Ensuite, semez les cellules dans un flacon de culture T75 et incubez-les pendant 72 heures à 37 °C et sous 5 % de dioxyde de carbone.Lorsque la culture atteint une confluence de 80 %, détacher les cellules à l’aide de cinq millilitres de trypsine-EDTA. Après cinq minutes à 37 degrés Celsius, neutraliser la trypsine avec cinq millilitres de milieu préchauffé et mélanger 40 microlitres de cellules avec du bleu de trypan en rapport 1:1. Réserver un aliquot de 10 microlitres de cellules pour le comptage.Récupérez les cellules par centrifugation et resuspendez le culot à une concentration de 1,25 x 10⁵ cellules par millilitre. Ensuite, recouvrez le fond d'une boîte de Pétri de 10 centimètres avec cinq millilitres de PBS stérile. Puis retournez le couvercle de la boîte de Pétri et ajoutez plusieurs gouttes de 20 microlitres de la suspension cellulaire sur la face interne du couvercle.Lorsque toutes les gouttes ont été déposées, remettez le couvercle à l’envers sur la boîte, en prenant soin de ne pas déloger les gouttes suspendues, puis placez délicatement la boîte dans une étuve à 37 degrés Celsius pendant 72 heures. À la fin de l’incubation, ajoutez 100 microlitres de solution de caillot par sphéroïde et par puits, dans une plaque de 48 puits, puis agitez et tapez doucement sur la plaque afin de garantir que le mélange de caillot de fibrine recouvre entièrement chaque puits. Placez la plaque à l’étuve pendant une heure.Une fois que la couche de caillot a polymérisé, vérifiez la présence de sphéroïdes dans la culture en goutte pendante au microscope optique, puis transférez la plaque de 48 puits et la boîte de culture en goutte pendante dans une hotte de culture cellulaire. Retournez soigneusement le couvercle de la boîte de Pétri afin d'accéder aux cultures en goutte pendante, puis utilisez une seringue d'un millilitre équipée d'une aiguille de calibre 21 pour transférer une goutte dans chaque puits revêtu de fibrine. Je fais particulièrement attention lors de l'aspiration et du semis des sphéroïdes, car l'étape la plus délicate et critique du processus consiste à transférer les sphéroïdes sans les endommager.Examinez la plaque au microscope afin de confirmer que les sphéroïdes ont été correctement semés dans les puits appropriés. Superposez délicatement 100 microlitres de solution de caillot fraîchement préparée sur chaque goutte contenant des sphéroïdes, puis réexaminez les sphéroïdes au microscope pour confirmer qu'ils sont toujours intacts et situés au centre de chaque puits. Replacez ensuite la plaque 48 puits dans l'incubateur afin de permettre la polymérisation de la deuxième couche de fibrine.Après une heure, ajoutez 500 microlitres du milieu approprié pour chaque groupe de sphéroïdes expérimentaux dans chaque puits et replacez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius. Acquérez des images des sphéroïdes par microscopie en champ clair toutes les 24 à 72 heures, en utilisant un balayage en z pour visualiser des sections transversales successives du modèle de culture cellulaire en 3D. Ensuite, à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image approprié, délimitez la frontière cellulaire de chaque sphéroïde à chaque point temporel successif et utilisez la fonction de mesure pour déterminer le pourcentage d’augmentation de la surface pour chaque sphéroïde.Après leur culture en présence de l'agent pro- ou anti-migratoire d'intérêt, les surfaces initiales des sphéroïdes peuvent être déterminées par imagerie en microscopie à champ clair et utilisées comme référence pour évaluer le degré de migration cellulaire ultérieure hors des corps sphéroïdaux à chaque point temporel successif. Dans cette expérience représentative, les sphéroïdes exposés à un agent pro-migratoire ont présenté un degré de migration significativement accru hors du corps sphéroïdal d'origine par rapport aux sphéroïdes exposés à un agent inhibiteur de la migration ou à un agent témoin. Inversement, les sphéroïdes exposés à un agent anti-migratoire ont montré un degré de migration significativement réduit hors du corps sphéroïdal initial, comparé aux sphéroïdes traités par le contrôle.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures et demie, hors temps de culture cellulaire, si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment cultiver et inclure des sphéroïdes cellulaires pour des essais de migration cellulaire in vitro en trois dimensions. Après cette procédure, d'autres méthodes comme l'histologie et l'immunohistochimie peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires sur la manière dont la structure du réseau de fibrine au sein du caillot ou l'alignement de l'actine dans les cellules du sphéroïde correspondent à une migration cellulaire accrue ou réduite.N'oubliez pas que le travail avec des cultures cellulaires et des aiguilles peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port d'équipements de protection appropriés et le travail sous une hotte stérile, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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