Caractérisation de la Migration cellulaire dans les trois dimensions In Vitro plaie environnements

L’objectif global de cette procédure est d’observer l’effet de traitements spécifiques d’intérêt sur la migration cellulaire dans un échafaudage de fibrine associé à une plaie tridimensionnelle. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la cicatrisation des plaies, sur la façon dont les altérations de la structure du réseau de fibres influencent la migration cellulaire et vers les caillots de fibrine au niveau des sites de plaie, le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une méthode simple et reproductible pour analyser la migration cellulaire dans les caillots de fibrine en 3D. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car le transfert des sphéroïdes peut être difficile.

Commencez par réchauffer une fiole de fibroblaste dermique humain néonatal congelé dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules sont tout juste décongelées, collectez-les par centrifugation et remettez la pastille en suspension dans un milieu de fibroblastes dermiques humains néonatals frais à raison de 1 x 10 à la 6e cellule par millilitre. Ensuite, ensemencez les cellules dans un flacon de culture T75 pour une incubation de 72 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Lorsque la culture atteint 80 % de confluence, détachez les cellules avec cinq millilitres de trypsine EDTA. Après cinq minutes à 37 degrés Celsius, neutralisez la trypsine avec cinq millilitres de milieu réchauffé et mélangez 40 microlitres de cellules avec du bleu de trypan dans un rapport de 1:1. Réservez une aliquote de 10 microlitres de cellules pour le comptage.

Récupérez les cellules par centrifugation et remettez en suspension la pastille à une concentration de 1,25 x 10 à la 5e cellule par millilitre. Ensuite, placez le fond d’une boîte de Pétri de 10 centimètres avec cinq millilitres de PBS stérile. Ensuite, retournez le couvercle de la boîte de Pétri et ajoutez plusieurs gouttes de 20 microlitres de suspension cellulaire sur la surface intérieure du couvercle.

Lorsque toutes les gouttes ont été placées, retournez le couvercle sur le plat, en prenant soin de ne pas déloger les gouttes suspendues et placez doucement le plat dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 72 heures. À la fin de l’incubation, ajoutez 100 microlitres de solution de caillot par sphéroïde et par puits, dans une plaque de 48 puits et secouez doucement et tapotez la plaque pour vous assurer que le mélange de caillots de fibrine recouvre tout le puits. Placez la plaque dans l’incubateur pendant une heure.

Lorsque la couche de caillot s’est polymérisée, confirmez la présence de sphéroïdes dans la culture de gouttes suspendues, sous un microscope optique et transférez la plaque à 48 puits et la boîte de culture de gouttes suspendues dans un capot de culture cellulaire. Retournez soigneusement le couvercle de la boîte de Pétri pour accéder aux cultures de gouttes suspendues et utilisez une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 21, pour transférer une goutte dans chaque fibrine bien enrobée. Je fais très attention lors de l’aspiration et du placage des sphéroïdes, car l’étape la plus difficile et la plus critique du processus est de transférer les sphéroïdes sans les détruire.

Examinez la plaque au microscope pour confirmer que les sphéroïdes ont été correctement ensemencés dans les puits appropriés. Superposez doucement 100 microlitres de solution de caillot fraîchement préparée sur chaque sphéroïde contenant une goutte et réexaminez les sphéroïdes au microscope, pour confirmer qu’ils sont toujours intacts et au centre de chaque puits. Remettez ensuite la plaque à 48 puits dans l’incubateur pour permettre à la deuxième couche de fibrine de polymériser.

Après une heure, traitez chaque puits avec 500 microlitres du milieu approprié pour le groupe sphéroïde expérimental correspondant et remettez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius. Obtenez des images des sphéroïdes par microscopie à champ clair toutes les 24 à 72 heures, en utilisant une pile z pour visualiser les coupes efficaces successives de la culture cellulaire 3D. Ensuite, dans le logiciel d’analyse d’images approprié, tracez la bordure de cellule de chaque sphéroïde à chaque point temporel successif et utilisez la fonction de mesure pour accéder au pourcentage d’augmentation de surface pour chaque sphéroïde.

Suite à leur culture, chez l’agent pro ou anti-migratoire d’intérêt, les zones initiales des sphéroïdes peuvent être déterminées par imagerie microscopique en fond clair et utilisées comme référence pour déterminer le degré de croissance cellulaire ultérieure des corps sphéroïdes à chaque point temporel successif. Dans cette expérience représentative, les sphéroïdes qui ont été exposés à un agent pro-migrateur ont montré un degré de migration significativement accru loin du corps sphéroïde d’origine par rapport aux sphéroïdes exposés à un inhibiteur de migration ou à un agent de contrôle. À l’inverse, les sphéroïdes exposés à un agent anti-migrateur ont montré un degré de migration significativement réduit loin du corps sphéroïde d’origine, par rapport aux sphéroïdes traités par le contrôle.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures et demie, hors temps de culture cellulaire, si elle est réalisée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver et d’intégrer des sphéroïdes cellulaires pour des tests de migration cellulaire in vitro tridimensionnels. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que l’histologie et l’immunohistochimie, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur la façon dont la structure du réseau de fibrine dans le caillot ou l’alignement de l’actine dans les cellules sphéroïdes correspond à une augmentation ou à une diminution de la migration cellulaire.

N’oubliez pas que travailler avec des cultures cellulaires et des aiguilles peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de l’équipement de protection approprié et le travail dans une cagoule de culture stérile doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.