Comptage des protéines dans des cellules individuelles avec gouttelettes adressable Microarrays

L’objectif global de cette expérience est de déterminer le nombre absolu de copies de protéines d’une protéine cible avec une résolution unicellulaire. Les techniques de cellule unique permettront de mieux comprendre le comportement d’une protéine en relation avec un dogme central et aideront à une quantification précise de l’expression génique contrôlée. Travailler au niveau de la cellule unique peut capturer la riche hétérogénéité de la population cellulaire qui serait autrement perdue par la moyenne qui se produit avec les techniques biochimiques traditionnelles.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés en raison de la sensibilité des tests unicellulaires ou d’une quantité limitée de protéines dans chaque cellule. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons souhaité effectuer un test de protéines unicellulaire qui pourrait être facilement échantillonné pour une analyse plus approfondie en aval. Commencez cette procédure en fabriquant des puces et en imprimant des microréseaux d’anticorps comme décrit dans le protocole texte.

Pour préparer l’appareil, introduisez un tube en silice fondue d’une longueur de 100 millimètres d’un diamètre intérieur de 150 microns, d’un diamètre extérieur de 360 microns sur une longueur de 40 millimètres, d’un diamètre intérieur de 1 millimètre, d’un diamètre intérieur de 1/16 de pouce jusqu’à ce qu’il dépasse de deux millimètres. Cela formera la buse concentrique. Appliquez une fine couche de colle cyanoacrylate à l’extrémité d’une pointe de pipette de 10 microlitres et insérez-la dans le morceau de 40 millimètres de tube PFA.

Si nécessaire, repositionnez le tube de silice fondue pour maintenir une saillie de 2 millimètres au niveau de la buse avant que l’adhésif ne durcisse. Insérez l’autre extrémité du capillaire en silice fondue dans l’extrémité d’un tube en PTFE de 200 millimètres de diamètre intérieur de 014 pouces et de diamètre extérieur de 062 pouces. Connectez-le à une seringue Hamilton de 100 microlitres remplie de quatre pour cent d’albumen sérique bovin dans une solution saline tamponnée au phosphate.

Ensuite, insérez un tube FEP de 400 millimètres de diamètre intérieur et de 2 millimètres de diamètre extérieur dans une pointe de pipette de 200 microlitres jusqu’à ce qu’il forme un joint. Appliquez une fine couche de colle cyanoacrylate sur une autre pointe de pipette de 200 microlitres, puis enfoncez-la dans la première pointe pour fixer le tube en place. Connectez ensuite l’extrémité ouverte du tube FEP à une seringue Hamilton de 1 millilitre remplie d’huile minérale.

Insérez l’ensemble de pointe de pipette de 200 microlitres dans la pointe de pipette de 10 microlitres de la buse concentrique. Ensuite, remplissez la seringue de 100 microlitres avec une solution de blocage PBSA à 4 %. Rattachez et rincez le tube aqueux avec la solution de blocage.

Répétez l’opération deux fois pour un total de trois couleurs. Remplissez ensuite la seringue de 100 microlitres avec un anticorps de détection de 0,125 microgramme par litre dans du PBSA à 4 % et rattachez le tube. Remplacez la solution bloquante dans la tubulure par une distribution de 25 microlitres de solution d’anticorps de détection.

Rincez le tube d’huile avec de l’huile minérale jusqu’à ce que tous les tubes et la buse se remplissent d’huile. Remplissez ensuite la seringue de 1 millilitre d’huile minérale et rattachez le tube. Enfin, fixez le tube et la buse à un manipulateur XYZ.

Pour former des gouttelettes adressables, fixez la puce sur la platine du microscope. Enregistrez les coordonnées de la platine du microscope de chaque point du réseau à l’aide du logiciel de contrôle automatisé du microscope. Ensuite, placez le manipulateur XYZ sur la platine du microscope.

Placez les seringues dans des pousse-seringues séparés car elles devront être actionnées indépendamment. Placez la buse à un angle de 50 à 60 degrés. Ensuite, réglez la pompe à seringue aqueuse pour distribuer 10 nanolitres de 100 microlitres par minute, et réglez la pompe à seringue à huile pour disperser 5 microlitres à 100 microlitres par minute.

Distribuez la solution aqueuse jusqu’à ce qu’un cordon de liquide soit visible à la tête de la buse. Tamponnez la perle avec une lingette sans poussière pour l’enlever. À l’aide du logiciel de contrôle automatisé du microscope, réglez les coordonnées de la platine du microscope sur un point d’anticorps dans le réseau et concentrez-vous sur la surface de la lamelle.

Lors de l’alignement de la buse, veillez à ne pas déranger la tache d’anticorps. Faites très attention et assurez-vous d’observer l’approche de l’extrémité capillaire en verre à l’aide d’un microscope. En faisant attention de ne pas déranger la tache, utilisez le manipulateur XYZ pour aligner l’extrémité capillaire en verre de la buse concentrique sur le côté de la tache d’anticorps.

Une fois aligné, distribuez 10 nanolitres de solution aqueuse. Sans déplacer les étages, versez cinq microlitres d’huile pour boucher la solution aqueuse. Soulevez lentement la buse pour l’écarter de la gouttelette et passez au puits suivant.

Répétez cette étape pour tous les points d’anticorps de la matrice. Après 30 minutes, imagez tous les points de la matrice à l’aide du logiciel de contrôle au microscope automatisé pour déterminer l’arrière-plan des molécules uniques liées à chaque point d’anticorps avant de charger les cellules. Pour charger les gouttelettes adressables avec des cellules, nous avons suspendu les cellules dans une solution d’anticorps de détection de 0,125 microgramme par millilitre dans un milieu L-15 avec 10 % de FDS.

Filtrez la solution cellulaire à travers une crépine de cellule à pas de 40 microns pour assurer une suspension à cellule unique. Chargez les cellules individuelles dans les gouttelettes adressables du réservoir de cellules à l’aide du micromanipulateur et du microcapillaire. En observant à travers un objectif 10x, utilisez le micro-injecteur pour aspirer une seule cellule dans le microcapillaire à partir du réservoir de cellules.

Travaillant manuellement avec un joystick, versez automatiquement à l’aide de la fonction d’éjection d’un étage de manipulateur électronique. Rejeter la micropipette en la déplaçant vers le haut pour dégager la hauteur de 1 millimètre de la puce. Réglez les coordonnées de la scène sur celles d’une gouttelette adressable à l’aide du logiciel de contrôle automatisé du microscope.

Injectez la micropipette en la ramenant à la position Z mémorisée. Effectuez cette opération manuellement avec le joystick ou automatiquement si vous utilisez une platine de manipulateur électronique. Les processus mécaniques dus à la lyse induite par laser peuvent créer une émulsion au bord des gouttelettes que des énergies d’impulsion plus élevées peuvent complètement perturber les gouttelettes.

Assurez-vous que les énergies d’impulsion de lyse sont réduites au minimum et que les cellules ne sont pas déposées sur le bord immédiat des gouttelettes. Distribuez les cellules dans la gouttelette adressable à l’aide du micro-injecteur. Imagez les cellules en gouttelettes à l’aide de la microscopie à fond clair, y compris l’imagerie par fluorescence.

Imagez également tous les points du réseau à l’aide de la microscopie TIRF à molécule unique. Concentrez-vous sur la cellule dans une gouttelette adressable. Obtenez une lyse optique complète en focalisant une seule impulsion laser de 6 nanosecondes à proximité de l’emplacement de la cellule.

Notez l’heure à laquelle chaque cellule est lysée. Acquérir des images de molécules uniques à l’aide de la microscopie TIRF de tous les points toutes les dix minutes pendant les 30 premières minutes, puis toutes les 20 minutes pendant 60 minutes supplémentaires. Si vous ne vous intéressez qu’à la quantité de protéines liées à l’équilibre, imagez tous les points après avoir incubé la puce pendant 90 minutes à température ambiante.

Pour effectuer le comptage d’un seul molcule pour tout point d’anticorps non encombré, chargez l’image d’arrière-plan acquise avant la lyse. Aux Fidji, sélectionnez l’image d’arrière-plan. Dans le menu de l’image, sélectionnez Dupliquer pour dupliquer l’arrière-plan.

Sélectionnez ensuite l’image dupliquée et, sous l’onglet Filtres de processus, sélectionnez Flou gaussien et spécifiez un rayon de 50 pixels. Accédez à traiter et sélectionnez calculatrice d’image. Là, spécifiez l’opération diviser, les images requises, puis sélectionnez les cases créer une nouvelle fenêtre et un résultat 32 bits.

Soustrayez chaque pixel de l’image d’une unité. Sélectionnez ensuite une zone de 50 pixels sur 50 pixels dans l’un des quatre coins de l’image plate d’arrière-plan. Mesurez l’écart-type de l’intensité des pixels en sélectionnant analyser et mesurer.

Sous Réglage de l’image, sélectionnez Seuil et réglez le niveau de seuil inférieur sur trois écarts types. Dans l’image segmentée, le masque SM définit les valeurs d’intensité des pixels sur zéro pour tous les objets qui n’ont pas une taille de quatre à neuf pixels carrés et une circularité de 0,5 à 1. Pour ce faire, sélectionnez analyser suivi d’analyser les particules et spécifiez la taille et la circularité.

Pour les mêmes taches d’anticorps, chargez et répétez les étapes d’analyse des données pour toutes les images capturées sous forme de série de résultats temporels acquise après la lyse. Dans les résultats représentatifs des images de molécule unique, le signal dans les images d’arrière-plan montre le niveau inférieur de liaison non spécifique de l’anticorps de détection marqué par fluorescence à la surface et à la tache de l’anticorps. L’image agrandie en médaillon montre des molécules uniques mises en évidence par des flèches rouges.

Une image typique d’une réduction de p53 dans les cellules de carcinome du côlon humain BE est également présentée. Cette séquence d’images montre l’accumulation de la protéine p53 sur le spot de l’anticorps. Une courbe d’étalonnage obtenue à l’aide de concentrations connues de la protéine combinée est utilisée pour convertir le nombre de molécules uniques à chaque endroit en nombre de protéines cibles dans le volume d’analyse et fait allusion au nombre de copies de cellules uniques.

La ligne horizontale pointillée rouge indique le niveau de liaison non spécifique. L’expression basale de la protéine p53 dans les cellules cancéreuses BE montre une distribution gamma à longue traîne où l’expression de la protéine p53 dans certaines cellules est significativement plus élevée que la valeur modale. Ici, l’expression de la protéine p53 est tracée en fonction du volume cellulaire calculé à partir du diamètre cellulaire mesuré avant la lyse.

Les résultats indiquent qu’une concentration minimale de protéine p53 est maintenue dans ces cellules. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer l’abondance d’une protéine cible avec une résolution unicellulaire. Lorsque vous travaillez avec des cellules biologiques, il est important de se rappeler que les protéines peuvent se dégrader.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est correctement exécutée, et peut être intégrée dans des protocoles d’analyse d’échantillons primaires de patients. Les techniques unicellulaires peuvent aider à mieux comprendre la fonction et le comportement cellulaires, ainsi qu’à identifier des événements rares qui seraient autrement manqués par les deux méthodes. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la biologie de p53 et des lignées cellulaires du cancer du sein, elle peut également être appliquée à d’autres études de maladies sans qu’il soit nécessaire de les étiqueter, ce qui est bénéfique pour étudier les cellules primaires à partir d’échantillons de patients.

Après cette procédure, d’autres méthodes telles que la PCR par points quantiques peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que déterminer si l’expression de l’ARN et de la protéine cible est corrélée. La mesure du nombre absolu de copies d’une protéine sera attrayante pour les biomathématiciens et les informaticiens pour soutenir leurs modèles biologiques.