Name: Comptage des protéines dans des cellules individuelles avec gouttelettes adressable Microarrays (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Découvrez le comptage absolu des protéines à l'échelle cellulaire unique avec les microarrays de gouttelettes adressables. Cette méthode quantifie l'hétérogénéité d'expression de la protéine p53 dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines.

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ASR conçu des expériences, mis au point des protocoles et analysé les données. SC et PS effectué des expériences de taille de cellule. ASR et OC a écrit le manuscrit. Les auteurs tiennent à remercier sincèrement le soutien du professeur David R. Klug pour donner accès au matériel. Les auteurs tiennent à remercier l’Imperial College Advanced Hackspace pour l’accès aux installations de prototypage et de fabrication.

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<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
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<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+picoliter+droplet+array+for+parallel+real-time+polymerase+chain+reaction+based+on+double-inkjet+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing.</a> Lab Chip. 14 (18), 3603(2014).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Adressable Droplet Microarrays sont une méthode sensible et extensible pour déterminer quantitativement le nombre de copies absolue de protéine dans une seule cellule.
Limiter le degré de liaison non spécifique (NSB) est critique au sein du protocole à la réalisation plus bas une limite de détection que possible. Protéines et autres espèces biochimiques pouvant lier non spécifique à un certain nombre d’interfaces présentes dans les gouttelettes — la surface de la lamelle couvre-objet, l’antico...

L’objectif de cette méthode consiste à déterminer la variation dans l’abondance d’une protéine cible dans une population de cellules avec une résolution de cellule unique. Cellule analyse fournit un certain nombre d’avantages qui ne sont pas disponibles avec les méthodes biochimiques ensemble traditionnel. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 tout d’abord, travaillant au niveau de la cellule unique peut capturer l’hétérogénéité riche d’une population cellulaire qui serait autrement perdue par la moyenne qui se produit avec des techniques biochimiques ensemble traditionnel. La majorité des méthodes biochimiques de cheval de travail travaillent avec la plus grande partie, exigeant, comme ils le font souvent, des millions de cellules pour produire un résultat. Bien sûr, les conséquences de l’évaluation des populations de cellules entières repose sur un certain nombre de facteurs, par exemple, l’hétérogénéité dans l’expression de la protéine où certaines caractéristiques importantes de la distribution de l’abondance de la protéine peuvent être manquées. D’un point de vue pratique, la sensibilité requise des techniques de la cellule unique rendent capable de fonctionner avec des quantités de matériel biologique qui est insuffisant pour même les plus sensibles techniques en vrac fonctionner. Un exemple de ceci est l’étude des types de cellules rares tels que les cellules tumorales (CTC) où même pour les patients avec une perspective de pronostique pauvre moins que 10 PTC peut être présent dans un unique 7,5 mL sang tracer en circulation. 6 nous présentons ici la méthodologie requise pour effectuer des mesures de protéine monocellulaire en utilisant un test anticorps utilisant des gouttelettes d’huile diablotin imprimé sur un microréseau d’anticorps à volume réduit.
Plateformes de gouttelettes microfluidiques sont haut débit, capable de générer des milliers de gouttelettes par seconde et capable d’isoler et même de la culture, les cellules individuelles en gouttelettes individuels pour effectuer un large éventail de tests biochimiques. Techniques axées sur les gouttelettes sont bien adaptés pour l’analyse de la cellule unique,7,8,9 , avec des exemples récents notables dont DropSeq10 et inDrop11, qui ont été grandement aidés par la puissance de techniques d’amplification. La quantité limitée de matériel et aucune méthode d’amplification pour les protéines font unicellulaire protéomique particulièrement difficile.
Gouttelettes peuvent être analysés par un certain nombre de méthodes et la microscopie de fluorescence a été largement utilisée. Techniques de molécules simples telles que la microscopie de fluorescence (FRBR) réflexion totale interne permet aux molécules fluorescentes à visualiser avec incomparable rapport signal-bruit. 12 en raison de la décroissance exponentielle du champ évanescent, seulement des fluorophores dans la grande proximité de la surface (l’ordre de 100 nm) sont excités faisant FRBR une bonne stratégie dans la détection de petites quantités d’une molécule cible dans un mélange complexe. La force de sectionnement optique inhérente de la FRBR contribue également à éviter les lavages et limites de dosage temps et la complexité. Toutefois, la FRBR nécessite des surfaces planes et exemples du microscope TIRF appliqué à gouttelettes en suspension dans le flux impliquent la formation d’une surface plane qui à l’image. 13 à cette fin, des techniques protéomiques unicellulaire conçoivent souvent puces microfluidiques autour des agents de surface immobilisée capture dans un format de microarray. 4 , 14
Les gouttelettes, eux-mêmes, peuvent se former dans des tableaux sur des surfaces planes, soi-disant gouttelette microarrays. 15 , 16 , 17 organisation dans l’espace des gouttelettes dans les tableaux permet qu’ils soient idéalement indexées, facilement surveillés au fil du temps, individuellement adressée et, le cas échéant, récupérée. Microarrays de gouttelettes peuvent atteindre une forte densité de micro-réacteurs avec des milliers d’éléments par puce qui sont soit encastrées ou pris en charge par une structure de microtitration. 18 , 19 , 20 ils peuvent être formés par le dépôt séquentiel par manipulation de liquides robots, jet d’encre spotters, contacter microarrayeurs21,22,23,24,25, 26 , ou ils peuvent s’auto-assembler sur des surfaces comme superhydrophillic taches modelée sur une surface SUPERHYDROPHOBE. 27 , 28 , 29
Avec ces considérations à l’esprit, adressable Droplet Microarrays (SMA) ont été conçus pour combiner la polyvalence, les adressabilité spatiale et les volumes réduits de gouttelettes microarrays avec la sensibilité du microscope TIRF seule molécule à quantitativement mesurer l’abondance de la protéine. 5 SMA activer l’analyse du unicellulaire formant un microarray de gouttelettes contenant des cellules individuelles sur un microréseau d’anticorps, qui est ensuite coiffée avec de l’huile pour éviter l’évaporation. Les volumes des gouttelettes sont discrètes pour éviter toute perte d’échantillon, qui serait autrement réalisée par sur puce robinetterie en flux continu microfluidique. 30 la quantité absolue de la protéine-cible d’une seule cellule est extrêmement faible ; Toutefois, la diminution du volume des gouttelettes permet de relativement haute concentration locale afin qu’ils soient détectés à l’aide d’un test d’anticorps "sandwich" - anticorps est immobilisé dans une région distincte, ou spot, sur une surface qui capte des protéines qui à son tour se lie à un anticorps de détection fluorescent marqué présent dans le volume de la goutte. Comme une approche sans étiquette (c'est-à-dire des protéines cibles n’ont pas besoin d’être étiquetés directement), SMA est généralement applicables à l’analyse de cellules provenant de sources primaires, tels que le sang transformé, bien besoin de ponction et biopsies tumorales dissociés, ainsi que les cellules de la culture et les lysats.
Mesurant la variation dans l’abondance de la protéine sur une population de cellules est important dans la détermination de l’hétérogénéité en réponse, par exemple, à un médicament et aidera en donnant un aperçu en fonctions cellulaires et voies, évaluation de sous-populations et leur comportement, ainsi que d’identifier des événements rares qui seraient autrement être masquées par des méthodes en vrac. Ce protocole décrit comment produire et utiliser des microarrays gouttelette adressable pour déterminer quantitativement l’abondance de la p53 de facteur de transcription dans des cellules cancéreuses humaines et peut être utilisé pour étudier le rôle de p53 dans la réponse aux médicaments chimiothérapeutiques. La protéine cible est déterminée par le choix de la capture et la détection des anticorps et peut-être être modifiée pour inclure des cibles différentes ou plus. Les instructions sont fournies pour construire un appareil simple incorporant une buse concentrique consommables de laboratoire général d’array manuellement 10 gouttes de nL recouverts d’huile. Le processus complet expérimental est décrit par lequel chaque gouttelette est ensuite chargé avec une seule cellule, qui est ensuite lysée et l’expression de protéine déterminée avec résolution seule molécule TIRF microscopie.

<table><tbody><tr><td>Culture cellulaire</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>flacons de culture cellulaire</td><td>Corning</td><td>SIAL0639</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA</td><td>Biochrom</td><td>L2153</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcontact Arrayer</td><td>DigiLab, Royaume-Uni</td><td>OmniGrid Micro</td><td></td></tr><tr><td>Micro pin</td><td>ArrayIt, USA</td><td>946MP2</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips (Nexterion)</td><td>Schott, Europe</td><td>1098523</td><td>Taille (mm) : 65,0 x 25,0 ; Épaisseur (mm) 0,17</td></tr><tr><td>anticorps de capture p53</td><td>Enzo</td><td>ADI-960-070</td><td></td></tr><tr><td>anticorps de détection p53, Alexa Fluor 488 étiqueté</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>concentration de stock 200&mu ; g/mL</td></tr><tr><td>Tampon de citrate salin-sodique</td><td>Gibco</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Bétaïne</td><td>Sigma</td><td>61962</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>384 plaque de puits (faible volume)</td><td>Sigma</td><td>CLS4511</td><td></td></tr><tr><td>Bouteille de gaz azoté</td><td>BOC</td><td>Qualité industrielle, sans</td><td></td> oxygène</tr><tr><td><fort>Nom</fort></td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Droplets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP2</td><td></td></tr><tr><td>Microinjecteur manuel</td><td>Eppendorf</td><td>CellTram Vario</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Origio, Danemark</td><td>MBB-FP-L-0</td><td></td></tr><tr><td>Pousse-seringues</td><td>KD Scientific</td><td>KDS-210</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu ; Seringue L</td><td>Hamilton</td><td>81020</td><td>Étanche aux gaz, PTFE Luer lock</td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL</td><td>Hamilton</td><td>81327</td><td>Étanche aux gaz, PTFE Luer</td></tr><tr><td>lock Isolateur en silicone</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR24R-A-0.5</td><td>Isolateur en silicone 6x4 puits avec adhésif</td></tr><tr><td>Découpeuse laser</td><td>VersaLASE</td><td>VLS2.30 Laser CO2 3W</td><td>pour la découpe laser d’isolateurs personnalisés</td></tr><tr><td>Feuille</td> <td>acrylique de 1 mm d’épaisseurFeuille de</td><td>précision Clarex 001</td><td>pour la découpe laser d’isolateurs personnalisés</td></tr><tr><td>Feuille adhésive</td><td>3M</td><td></td><td>utilisée pour coller des isolateurs personnalisés sur des lamelles de recouvrement microarrayed</td></tr> Super <tr><td>colle</td><td>Loctite</td><td>LOCPFG3T</td><td></td></tr><tr><td>150 &mu ; m ID/360 &mu ; Tube en silice fondue m OD</td><td>IDEX</td><td>FS-115</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mm ID/1/16" Tube OD PFA</td><td>IDEX</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>0.014" Réf./0.062" OD Tube PTFE</td><td>Kinesis</td><td>008T16-100</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mm ID/2,0 mm OD Tube FEP</td><td>IDEX</td><td>1673</td><td></td></tr><tr><td>Albumen sérique bovin (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Eau ultra-pure</td><td>Millipore, Allemagne</td><td>MilliQ</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td> Entreprise </td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microscopy & Microscope optique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TIRF avec platine XY codée</td><td>Nikon, Japon</td><td>Nikon Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD</td><td>Andor Technologies, Irlande</td><td>IXON DU-897E</td><td></td></tr><tr><td>Source d’excitation laser</td><td>Vortran, États-Unis</td><td>Stradus 488-50</td><td></td></tr><tr><td>Source laser à lyse optique</td><td>Continuum, États-Unis</td><td>Microscope Surelite SLI-10</td><td></td></tr><tr><td> cube de filtre pour TIRF</td><td>Chroma, USA</td><td>z488bp</td><td></td></tr><tr><td>Cube de filtre pour laser à lyse optique</td><td>2000, UK</td><td>LPD01-532R-25</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse d’images</td><td>Open Source</td><td></td> <td>des Fidji</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>version 7.14 ou supérieure</td><td>Logiciel d’analyse d’images</td></tr></tbody></table>

comptage des protéines dans des cellules individuelles avec gouttelettes adressable microarrays

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Comportement souvent cellulaire et les réponses cellulaires sont analysés au niveau des populations où les réponses de nombreuses cellules sont regroupées ensemble comme un résultat moyen masquant le comportement unicellulaire riche au sein d’une population complexe. Technologies de détection et de quantification protéines unicellulaires ont eu un impact remarquable ces dernières années. Nous décrivons ici une plateforme d’analyse unicellulaire pratique et flexible basée sur gouttelette adressable microarrays. Cette étude décrit comment le nombre de copies absolue de protéines cibles peut-être être mesuré avec une résolution de cellule unique. Le suppresseur de tumeur p53 est le gène le plus fréquemment muté dans le cancer humain, avec plus de 50 % des cas de cancer total expose un modèle d’expression de p53 non saines. Le protocole décrit les étapes pour créer 10 gouttes de nL au sein de laquelle les cellules cancéreuses humaines unique sont isolés et le nombre de copies de la protéine p53 est mesuré avec une résolution de la molécule unique afin de déterminer avec précision la variabilité dans l’expression. La méthode peut être appliquée à n’importe quel type de cellule dont la matière première pour déterminer le nombre de copies absolue de toutes les protéines cibles d’intérêt.

Le nombre de copies de protéine basal absolu de p53 a été déterminé avec une résolution de cellule unique dans une lignée de cellules de cancer du côlon humain, cellules BE. Nous démontrons comment expression de p53 peut varier au fil de plusieurs ordres de grandeur et montrent une corrélation faiblement positive entre taille et protéine nombre de copie cellule au sein de la population de cellules BE au repos.
Adressable Microar...

Nous présentons ici des gouttelettes adressable microarrays (SMA), une méthode de tableau basé de gouttelettes en mesure de déterminer l’abondance absolue de protéine dans des cellules individuelles. Nous démontrent la capacité des SMA pour caractériser l’hétérogénéité dans l’expression de la tumeur suppresseur protéine p53 dans une lignée de cellules cancéreuses humaines.

Comptage des protéines dans des cellules individuelles avec gouttelettes adressable Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

L'objectif général de cette expérience est de déterminer le nombre absolu de copies d'une protéine cible avec une résolution au niveau de la cellule unique. Les techniques de type cellule unique permettront une meilleure compréhension du comportement d'une protéine en lien avec le dogme central, et contribueront à une quantification précise de l'expression génique contrôlée. Travailler au niveau de la cellule unique permet de capturer l'hétérogénéité riche et variée de la population cellulaire, laquelle serait autrement perdue en raison du lissage induit par les techniques biochimiques traditionnelles.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison de la sensibilité des tests à cellule unique ou de la quantité limitée de protéine dans chaque cellule. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons souhaité réaliser un dosage protéique à cellule unique pouvant être facilement échantillonné pour des analyses ultérieures en aval. Commencez cette procédure en fabriquant des puces et en imprimant des micro-réseaux d'anticorps comme décrit dans le protocole écrit.Pour préparer l'appareil, insérez une longueur de 100&nbsp;millimètres d’un tube en silice fondue de 150&nbsp;microns de diamètre intérieur et de 360&nbsp;microns de diamètre extérieur dans une longueur de 40&nbsp;millimètres d’un tube PFA de 1&nbsp;millimètre de diamètre intérieur et de 1/16&nbsp;pouce de diamètre extérieur, jusqu’à ce qu’il dépasse de deux&nbsp;millimètres. Cela formera la buse concentrique. Appliquez une fine couche de colle cyanoacrylate sur l’extrémité d’une pipette de 10&nbsp;microlitres et insérez-la dans le morceau de 40&nbsp;millimètres de tube PFA.Si nécessaire, repositionner le tube en silice fondue afin de maintenir un dépassement de 2 millimètres à l'embout avant que l'adhésif ne durcisse. Insérer l'autre extrémité du capillaire en silice fondue dans l'extrémité d'un tube en PTFE de 200 millimètres de longueur et de 014 pouce de diamètre intérieur pour 062 pouce de diamètre extérieur. Relier ceci à une seringue Hamilton de 100 microlitres remplie d'une solution tampon phosphate contenant quatre pour cent d'albumine de sérum bovin.Insérez ensuite un morceau de tube FEP de 400 millimètres de longueur et de 1 millimètre de diamètre intérieur et 2 millimètres de diamètre extérieur dans une pipette de 200 microlitres jusqu'à ce qu'un joint étanche se forme. Appliquez une fine couche de colle cyanoacrylate sur une autre pipette de 200 microlitres, puis enfoncez-la dans la première pipette afin de fixer le tube en place. Ensuite, reliez l'extrémité ouverte du tube FEP à une seringue Hamilton de 1 millilitre remplie d'huile minérale.Insérez l'ensemble de pointe de pipette de 200 microlitres dans la pointe de pipette de 10 microlitres de la buse concentrique. Ensuite, remplissez la seringue de 100 microlitres avec une solution de blocage PBSA à 4 pour cent. Rattachez et rincez le tube aqueux avec la solution de blocage.Répétez deux fois, pour un total de trois rinçages. Ensuite, remplissez la seringue de 100 microlitres avec l'anticorps de détection à 0,125 microgramme par litre dans du PBSA à 4 pour cent et reconnectez le tube. Remplacez la solution de blocage dans le tube en dispensant 25 microlitres de la solution d'anticorps de détection.Nettoyer le tube à huile avec de l'huile minérale jusqu'à ce que tout le tube et la buse soient remplis d'huile. Ensuite, remplir à nouveau la seringue de 1 millilitre avec de l'huile minérale et rebrancher le tube. Enfin, fixer l'ensemble tube et buse sur un manipulateur XYZ.Pour former des gouttelettes adressables, fixez la puce sur la platine du microscope. Enregistrez les coordonnées de la platine du microscope pour chaque point de la matrice à l’aide du logiciel de commande automatisé du microscope. Ensuite, positionnez le manipulateur XYZ sur la platine du microscope.Placer les seringues dans des pompes à seringue séparées, car elles devront être manipulées indépendamment. Placer la buse à un angle de 50 à 60 degrés. Régler ensuite la pompe à seringue aqueuse pour délivrer 10 nanolitres à 100 microlitres par minute, et régler la pompe à seringue à l’huile pour disperser 5 microlitres à 100 microlitres par minute.Distribuez la solution aqueuse jusqu'à ce qu'une goutte de liquide soit visible à l'extrémité de la buse. Tamponnez la goutte avec un chiffon sans poussière pour l'éliminer. À l'aide du logiciel de commande automatisé du microscope, réglez les coordonnées de la platine du microscope sur une tache d'anticorps dans le réseau et focalisez sur la surface du coverslip.Lors de l'alignement de la buse, veillez à ne pas perturber la tache d'anticorps. Prenez des précautions supplémentaires et assurez-vous d'observer l'approche de l'extrémité du capillaire en verre à travers un microscope. En faisant attention de ne pas déranger la tache, utilisez le manipulateur XYZ pour aligner l'extrémité du capillaire en verre de la buse concentrique sur le côté de la tache d'anticorps.Une fois aligné, délivrez 10 nanolitres de solution aqueuse. Sans déplacer les plateaux, délivrez cinq microlitres d'huile pour recouvrir la solution aqueuse. Relevez lentement la buse hors de la goutte et passez au puits suivant.Répétez cette étape pour tous les points d'anticorps présents sur le réseau. Après 30 minutes, imagez tous les points du réseau à l'aide du logiciel de commande automatisé du microscope afin de déterminer le fond correspondant aux molécules uniques liées à chaque point d'anticorps avant la mise en charge des cellules. Pour charger les gouttelettes adressables avec les cellules, nous avons mis les cellules en suspension dans une solution contenant 0,125 microgramme par millilitre d'anticorps de détection dans du milieu L-15 complété avec 10 pour cent de FDS.Filtrer la solution cellulaire à l’aide d’un tamis cellulaire de pas de 40 microns afin d’obtenir une suspension monocellulaire. Charger les cellules individuelles dans les gouttelettes adressables à partir du réservoir de cellules à l’aide du micromanipulateur et d’une microcapillaire. En observant à travers un objectif 10x, utiliser le microinjecteur pour aspirer une cellule unique dans la microcapillaire en provenance du réservoir de cellules.Travailler manuellement à l’aide d’un joystick ou verser automatiquement en utilisant la fonction d’éjection d’un support manipulateur électronique. Rejeter la micropipette en la déplaçant vers le haut afin de la sortir de la hauteur de 1 millimètre de la puce. Régler les coordonnées du support sur celles d’une goutte adressable à l’aide du logiciel de commande automatisé du microscope.Injectez la micropipette en la ramenant à sa position Z stockée. Effectuez cette opération manuellement à l’aide du joystick ou automatiquement si vous utilisez une platine de manipulation électronique. Les processus mécaniques dus à la lyse induite par laser peuvent créer une émulsion au bord de la goutte, que des énergies d’impulsion plus élevées peuvent totalement perturber.Veillez à ce que les énergies de pulsation de lyse soient maintenues au minimum et que les cellules ne soient pas déposées en bordure immédiate des gouttelettes. Distribuez les cellules dans la gouttelette adressable à l’aide du microinjecteur. Observez les cellules dans les gouttelettes en microscopie en champ clair, y compris toute imagerie en fluorescence.Imager également toutes les taches de la matrice à l’aide d’une microscopie TIRF à molécule unique. Se concentrer sur la cellule située dans une gouttelette adressable. Réaliser une lyse optique complète en focalisant une seule impulsion laser de 6 nanosecondes près de l'emplacement de la cellule.Noter l'heure à laquelle chaque cellule est lysée. Acquérir des images de molécules uniques par microscopie TIRF de tous les spots toutes les dix minutes pendant les 30 premières minutes, puis toutes les 20 minutes pendant encore 60 minutes. Si l'on s'intéresse uniquement à la quantité de protéine liée à l'équilibre, imager tous les spots après avoir incubé la puce pendant 90 minutes à température ambiante.Pour effectuer le comptage de molécules uniques pour tout point d'anticorps non encombré, chargez l'image de fond obtenue avant la lyse. Dans Fiji, sélectionnez l'image de fond. Dans le menu image, choisissez dupliquer afin de créer une copie de l'image de fond.Ensuite, sélectionnez l'image en double et, sous l'onglet filtres du menu Traitement, choisissez « Flou gaussien » et indiquez un rayon de 50 pixels. Accédez à Traitement et sélectionnez Calculatrice d'image. Indiquez alors l'opération « division », les images nécessaires, puis cochez les cases Créer une nouvelle fenêtre et Résultat 32 bits.Soustraire une unité à chaque pixel de l'image. Ensuite, sélectionner une zone de 50 pixels sur 50 pixels dans l'un des quatre coins de l'image de fond uniforme. Mesurer l'écart type de l'intensité des pixels en choisissant analyser et mesurer.Dans l'ajustement de l'image, sélectionnez le seuil et réglez le niveau de seuil inférieur à trois écarts types. Dans l'image segmentée, définissez les valeurs d'intensité des pixels à zéro pour tous les objets qui n'ont pas une taille comprise entre quatre et neuf pixels carrés et une circularité comprise entre 0,5 et 1. Pour ce faire, sélectionnez analyser, puis analyser les particules, et spécifiez la taille et la circularité.Pour les mêmes taches d'anticorps, chargez et répétez les étapes d'analyse des données pour toutes les séquences d'images capturées en tant que série temporelle obtenue après lyse. Dans les résultats représentatifs des images de molécules uniques, le signal des images d'arrière-plan indique un faible niveau de liaison non spécifique de l'anticorps de détection marqué de manière fluorescente à la surface et à la tache d'anticorps. L'image agrandie en encart montre des molécules individuelles mises en évidence par des flèches rouges.On voit également une image typique d'un ciblage par précipitation de la protéine p53 dans des cellules de carcinome colorectal humain BE. Cette série d'images montre l'accumulation de la protéine p53 sur la tache d'anticorps. Une courbe d'étalonnage obtenue à l'aide de concentrations connues de la protéine recombinante est utilisée pour convertir le nombre de molécules uniques détectées sur chaque tache en nombre de protéines cibles présentes dans le volume d'analyse, suggérant ainsi le nombre de copies au niveau cellulaire unique.La ligne rouge en pointillés horizontale indique le niveau de liaison non spécifique. L'expression protéique basale de p53 dans les cellules cancéreuses de l'œsophage de Barrett présente une distribution asymétrique allongée, de type gamma, où l'expression de la protéine p53 dans certaines cellules est nettement supérieure à la valeur modale. Ici, l'expression de la protéine p53 est représentée en fonction du volume cellulaire calculé à partir du diamètre cellulaire mesuré avant lyse.Les résultats indiquent qu'une concentration minimale de la protéine p53 est maintenue dans ces cellules. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mesurer l'abondance d'une protéine cible avec une résolution au niveau de la cellule unique. Lorsque vous travaillez avec des cellules biologiques, il est important de garder à l'esprit que les protéines peuvent se dégrader.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de quatre heures si elle est effectuée correctement, et peut être intégrée à des protocoles d'analyse d'échantillons primaires provenant de patients. Les techniques à cellule unique permettent d'obtenir des informations sur la fonction et le comportement cellulaires, ainsi que d'identifier des événements rares qui resteraient indétectables avec les deux méthodes. Bien que cette méthode permette d'approfondir la compréhension de la biologie du p53 et des lignées cellulaires du cancer du sein, elle peut également s'appliquer à d'autres études de maladies sans nécessiter d'étiquetage, ce qui est avantageux pour l'étude des cellules primaires issues d'échantillons de patients.Après cette procédure, d'autres méthodes comme la PCR avec points quantiques peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la détermination d'une éventuelle corrélation entre l'expression de l'ARN cible et celle de la protéine. La mesure du nombre absolu de copies d'une protéine sera intéressante pour les biomathématiciens et les scientifiques en sciences computationnelles afin de soutenir leurs modèles biologiques.

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Droplet plates-formes basées microfluidiques sont des candidats prometteurs pour l'expérimentation à haut débit car ils sont capables de générer picolitres, auto-compartimentées vaisseaux moindre coût aux cadences kHz. Grâce à l'intégration rapide, sensible et haute résolution de fluorescence des méthodes spectroscopiques, les grandes quantités de données générées au sein de ces systèmes peut être efficacement extraite, exploité et utilisé.

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Dans cet article, nous présentons une puce microfluidique pour l'analyse d'une seule cellule. Il permet la quantification des protéines intracellulaires, des enzymes, des cofacteurs, et des seconds messagers à l'aide de dosages ou des dosages immunologiques par fluorescence.

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Enclenchez la puce pour les immunoessais de Cross-reactivity-libre et exempt de Spotter multiplexée "sandwich"

Ce protocole décrit les processus générales et contrôle qualité vérifie nécessaire pour la préparation de cellules unique chez les mammifères adultes saines pour les préparations de RNA-Seq cellule unique axée sur la gouttelette, haut débit. Séquençage des paramètres, l’alignement de lecture et l’analyse bioinformatique de cellule unique en aval sont également fournis.

Transcriptomique cellule unique axée sur le codage à barres de gouttelettes de tissus de mammifères adultes

Nous présentons ici un protocole pour évaluer l’homogénéité étiquetage pour chaque espèce de protéine dans un échantillon complexe des protéines à l’échelle de la molécule.

Échelle du protéome Quantification d’homogénéité à l’échelle de la molécule unique d’étiquetage

L’objectif global du protocole est de préparer plus d’un million de gouttelettes de femtoliter commandées, uniformes, stables et biocompatibles sur un substrat planaire de 1 cm2 qui peut être utilisé pour la synthèse des protéines sans cellules.

Un tableau de gouttelettes femtoliter pour la synthèse massive de protéines parallèles à partir de molécules d’ADN unique

Nous présentons ici un protocole pour mesurer le nombre absolu de copies d’ADN mitochondrial (mt) et les niveaux d’hétéroplasmie de délétion de l’ADNmt dans des cellules individuelles.

Mesure du nombre de copies d’ADN mitochondrial unicellulaire et de l’hétéroplasmie à l’aide d’une réaction en chaîne par gouttelettes numériques par polymérase

Cette méthode quantifie l’abondance microbienne à l’aide d’un format de plaque de 96 puits pour les unités formant colonie (UFC) et est appliquée au microbiome de la drosophile dans des échantillons d’homogénat de mouches entières. Les UFC sont comptées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images automatisé fourni ici.

Comptage rapide des unités formant des colonies sous forme de plaque à 96 puits appliqué au microbiome de la drosophile

Découvrez le comptage absolu des protéines à l'échelle cellulaire unique avec les microarrays de gouttelettes adressables. Cette méthode quantifie l'hétérogénéité d'expression de la protéine p53 dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines.

Comptage des protéines dans des cellules individuelles avec gouttelettes adressable Microarrays

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