Name: Comptage des protéines dans des cellules individuelles avec gouttelettes adressable Microarrays (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Découvrez le comptage absolu des protéines à l'échelle cellulaire unique avec les microarrays de gouttelettes adressables. Cette méthode quantifie l'hétérogénéité d'expression de la protéine p53 dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ASR conçu des expériences, mis au point des protocoles et analysé les données. SC et PS effectué des expériences de taille de cellule. ASR et OC a écrit le manuscrit. Les auteurs tiennent à remercier sincèrement le soutien du professeur David R. Klug pour donner accès au matériel. Les auteurs tiennent à remercier l’Imperial College Advanced Hackspace pour l’accès aux installations de prototypage et de fabrication.

<ol><li>Willison, K. R., Klug, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+single+cell+and+single+molecule+proteomics+for+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).</li>
<li>Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+tools+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis tools for drug discovery and development.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).</li>
<li>Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+enzyme-linked+immunosorbent+assays+on+a+microfluidic+chip+to+quantify+intracellular+molecules+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells.</a> Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).</li>
<li>Salehi-Reyhani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+first+step+towards+practical+single+cell+proteomics%3A+a+microfluidic+antibody+capture+chip+with+TIRF+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection.</a> Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).</li>
<li>Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressable+droplet+microarrays+for+single+cell+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis.</a> Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).</li>
<li>Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).</li>
<li>Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+massively+parallel+single-molecule+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing.</a> Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).</li>
<li>Ramji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+kinase+signaling+assay+using+pinched+flow+coupled+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics.</a> Biomicrofluidics. 8 (3), 34104(2014).</li>
<li>He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+encapsulation+of+single+cells+and+subcellular+organelles+into+picoliter-+and+femtoliter-volume+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets.</a> Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+molecules+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).</li>
<li>Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+TIRF+microscopy+to+quantify+and+confirm+efficient+mass+transfer+at+the+substrate+surface+of+the+chemistrode%5BTitle%5D)+AND+%22New+J.+Phys%22%5BJournal%5D)">Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode.</a> New J. Phys. 11 (31), 75017(2009).</li>
<li>Shi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+picoliter+droplet+array+for+parallel+real-time+polymerase+chain+reaction+based+on+double-inkjet+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing.</a> Lab Chip. 14 (18), 3603(2014).</li>
<li>Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Microarray+Based+on+Superhydrophobic-Superhydrophilic+Patterns+for+Single+Cell+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays%22%5BJournal%5D)">Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis.</a> Microarrays. 5 (4), 28(2016).</li>
<li>Yen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Pico-Liter+Droplet+Microarray+for+Ultrasensitive+Nucleic+Acid+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification.</a> ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).</li>
<li>Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floating+droplet+array%3A+An+ultrahigh-throughput+device+for+droplet+trapping%2C+real-time+analysis+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery.</a> Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).</li>
<li>Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Karthikeyan_Narayanan2/publication/257690809_Elucidating_drug_resistance_properties_in_scarce_cancer_stem_cells_using_droplet_microarray/links/554ac2700cf29752ee7c3360.pdf">Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray.</a> Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).</li>
<li>Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/-/content/articlelanding/2016/ra/c6ra06011k">Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings.</a> RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet+nanoinjection+for+high-thoughput+chemiluminescence+immunoassay+on+multicapillary+glass+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate.</a> Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).</li>
<li>Zhu, Y., Zhu, L. -N., Guo, R., Cui, H. -J., Ye, S., Fang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter-scale+protein+crystallization+and+screening+with+a+microfluidic+droplet+robot%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot.</a> Sci. Rep. 4, 5046(2014).</li>
<li>Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-in-oil+array+for+picoliter-scale+analysis+based+on+sequential+inkjet+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing.</a> Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).</li>
<li>Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22One+cell-one+well%22%3A+A+new+approach+to+inkjet+printing+single+cell+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">"One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays.</a> ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).</li>
<li>Yusof, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet-like+printing+of+single-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+a+Chip+-+Miniaturisation+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inkjet-like printing of single-cells.</a> Lab a Chip - Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).</li>
<li>Zhu, Y., Zhang, Y. -X., Liu, W. -W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+2-dimentional+droplet+array+for+single-cell+reverse+transcription+quantitative+PCR+assay+with+a+microfluidic+robot%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot.</a> Sci. Rep. 5, 9551(2015).</li>
<li>Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23114283">Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications.</a> Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).</li>
<li>Kozak, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-volume+wall-less+immunoassays+using+patterned+planar+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates.</a> Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).</li>
<li>Yen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Pico-Liter+Droplet+Microarray+for+Ultrasensitive+Nucleic+Acid+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification.</a> ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).</li>
<li>Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2072-666X/2/2/179/htm">Microvalves and Micropumps for BioMEMS.</a> Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).</li>
<li>Lai, H. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+use+of+laser-based+lysis+for+cell+analysis+on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip.</a> J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S113-S121 (2008).</li>
<li>Salehi-Reyhani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+advantages+and+constraints+in+miniaturized+capture+assays+for+single+cell+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis.</a> Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).</li>
<li>Brown, R. B., Audet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+techniques+for+single-cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Current techniques for single-cell lysis.</a> J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S131-S138 (2008).</li>
<li>Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+effects+on+enzyme+activity+and+solubilization+of+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes.</a> BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).</li>
<li>Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/microfluidic-single-mammalian-cell-lysis-in-picolitre-droplets-2155-6210.S12-001.php?aid=14625">Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets.</a> J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).</li>
<li>Burgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+protein+copy+number+using+a+single-molecule-sensitive+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray.</a> Analyst. 139 (13), 3235(2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Adressable Droplet Microarrays sont une méthode sensible et extensible pour déterminer quantitativement le nombre de copies absolue de protéine dans une seule cellule.
Limiter le degré de liaison non spécifique (NSB) est critique au sein du protocole à la réalisation plus bas une limite de détection que possible. Protéines et autres espèces biochimiques pouvant lier non spécifique à un certain nombre d’interfaces présentes dans les gouttelettes — la surface de la lamelle couvre-objet, l’antico...

L’objectif de cette méthode consiste à déterminer la variation dans l’abondance d’une protéine cible dans une population de cellules avec une résolution de cellule unique. Cellule analyse fournit un certain nombre d’avantages qui ne sont pas disponibles avec les méthodes biochimiques ensemble traditionnel. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 tout d’abord, travaillant au niveau de la cellule unique peut capturer l’hétérogénéité riche d’une population cellulaire qui serait autrement perdue par la moyenne qui se produit avec des techniques biochimiques ensemble traditionnel. La majorité des méthodes biochimiques de cheval de travail travaillent avec la plus grande partie, exigeant, comme ils le font souvent, des millions de cellules pour produire un résultat. Bien sûr, les conséquences de l’évaluation des populations de cellules entières repose sur un certain nombre de facteurs, par exemple, l’hétérogénéité dans l’expression de la protéine où certaines caractéristiques importantes de la distribution de l’abondance de la protéine peuvent être manquées. D’un point de vue pratique, la sensibilité requise des techniques de la cellule unique rendent capable de fonctionner avec des quantités de matériel biologique qui est insuffisant pour même les plus sensibles techniques en vrac fonctionner. Un exemple de ceci est l’étude des types de cellules rares tels que les cellules tumorales (CTC) où même pour les patients avec une perspective de pronostique pauvre moins que 10 PTC peut être présent dans un unique 7,5 mL sang tracer en circulation. 6 nous présentons ici la méthodologie requise pour effectuer des mesures de protéine monocellulaire en utilisant un test anticorps utilisant des gouttelettes d’huile diablotin imprimé sur un microréseau d’anticorps à volume réduit.
Plateformes de gouttelettes microfluidiques sont haut débit, capable de générer des milliers de gouttelettes par seconde et capable d’isoler et même de la culture, les cellules individuelles en gouttelettes individuels pour effectuer un large éventail de tests biochimiques. Techniques axées sur les gouttelettes sont bien adaptés pour l’analyse de la cellule unique,7,8,9 , avec des exemples récents notables dont DropSeq10 et inDrop11, qui ont été grandement aidés par la puissance de techniques d’amplification. La quantité limitée de matériel et aucune méthode d’amplification pour les protéines font unicellulaire protéomique particulièrement difficile.
Gouttelettes peuvent être analysés par un certain nombre de méthodes et la microscopie de fluorescence a été largement utilisée. Techniques de molécules simples telles que la microscopie de fluorescence (FRBR) réflexion totale interne permet aux molécules fluorescentes à visualiser avec incomparable rapport signal-bruit. 12 en raison de la décroissance exponentielle du champ évanescent, seulement des fluorophores dans la grande proximité de la surface (l’ordre de 100 nm) sont excités faisant FRBR une bonne stratégie dans la détection de petites quantités d’une molécule cible dans un mélange complexe. La force de sectionnement optique inhérente de la FRBR contribue également à éviter les lavages et limites de dosage temps et la complexité. Toutefois, la FRBR nécessite des surfaces planes et exemples du microscope TIRF appliqué à gouttelettes en suspension dans le flux impliquent la formation d’une surface plane qui à l’image. 13 à cette fin, des techniques protéomiques unicellulaire conçoivent souvent puces microfluidiques autour des agents de surface immobilisée capture dans un format de microarray. 4 , 14
Les gouttelettes, eux-mêmes, peuvent se former dans des tableaux sur des surfaces planes, soi-disant gouttelette microarrays. 15 , 16 , 17 organisation dans l’espace des gouttelettes dans les tableaux permet qu’ils soient idéalement indexées, facilement surveillés au fil du temps, individuellement adressée et, le cas échéant, récupérée. Microarrays de gouttelettes peuvent atteindre une forte densité de micro-réacteurs avec des milliers d’éléments par puce qui sont soit encastrées ou pris en charge par une structure de microtitration. 18 , 19 , 20 ils peuvent être formés par le dépôt séquentiel par manipulation de liquides robots, jet d’encre spotters, contacter microarrayeurs21,22,23,24,25, 26 , ou ils peuvent s’auto-assembler sur des surfaces comme superhydrophillic taches modelée sur une surface SUPERHYDROPHOBE. 27 , 28 , 29
Avec ces considérations à l’esprit, adressable Droplet Microarrays (SMA) ont été conçus pour combiner la polyvalence, les adressabilité spatiale et les volumes réduits de gouttelettes microarrays avec la sensibilité du microscope TIRF seule molécule à quantitativement mesurer l’abondance de la protéine. 5 SMA activer l’analyse du unicellulaire formant un microarray de gouttelettes contenant des cellules individuelles sur un microréseau d’anticorps, qui est ensuite coiffée avec de l’huile pour éviter l’évaporation. Les volumes des gouttelettes sont discrètes pour éviter toute perte d’échantillon, qui serait autrement réalisée par sur puce robinetterie en flux continu microfluidique. 30 la quantité absolue de la protéine-cible d’une seule cellule est extrêmement faible ; Toutefois, la diminution du volume des gouttelettes permet de relativement haute concentration locale afin qu’ils soient détectés à l’aide d’un test d’anticorps "sandwich" - anticorps est immobilisé dans une région distincte, ou spot, sur une surface qui capte des protéines qui à son tour se lie à un anticorps de détection fluorescent marqué présent dans le volume de la goutte. Comme une approche sans étiquette (c'est-à-dire des protéines cibles n’ont pas besoin d’être étiquetés directement), SMA est généralement applicables à l’analyse de cellules provenant de sources primaires, tels que le sang transformé, bien besoin de ponction et biopsies tumorales dissociés, ainsi que les cellules de la culture et les lysats.
Mesurant la variation dans l’abondance de la protéine sur une population de cellules est important dans la détermination de l’hétérogénéité en réponse, par exemple, à un médicament et aidera en donnant un aperçu en fonctions cellulaires et voies, évaluation de sous-populations et leur comportement, ainsi que d’identifier des événements rares qui seraient autrement être masquées par des méthodes en vrac. Ce protocole décrit comment produire et utiliser des microarrays gouttelette adressable pour déterminer quantitativement l’abondance de la p53 de facteur de transcription dans des cellules cancéreuses humaines et peut être utilisé pour étudier le rôle de p53 dans la réponse aux médicaments chimiothérapeutiques. La protéine cible est déterminée par le choix de la capture et la détection des anticorps et peut-être être modifiée pour inclure des cibles différentes ou plus. Les instructions sont fournies pour construire un appareil simple incorporant une buse concentrique consommables de laboratoire général d’array manuellement 10 gouttes de nL recouverts d’huile. Le processus complet expérimental est décrit par lequel chaque gouttelette est ensuite chargé avec une seule cellule, qui est ensuite lysée et l’expression de protéine déterminée avec résolution seule molécule TIRF microscopie.

<table><tbody><tr><td>Culture cellulaire</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>flacons de culture cellulaire</td><td>Corning</td><td>SIAL0639</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA</td><td>Biochrom</td><td>L2153</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcontact Arrayer</td><td>DigiLab, Royaume-Uni</td><td>OmniGrid Micro</td><td></td></tr><tr><td>Micro pin</td><td>ArrayIt, USA</td><td>946MP2</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips (Nexterion)</td><td>Schott, Europe</td><td>1098523</td><td>Taille (mm) : 65,0 x 25,0 ; Épaisseur (mm) 0,17</td></tr><tr><td>anticorps de capture p53</td><td>Enzo</td><td>ADI-960-070</td><td></td></tr><tr><td>anticorps de détection p53, Alexa Fluor 488 étiqueté</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>concentration de stock 200&mu ; g/mL</td></tr><tr><td>Tampon de citrate salin-sodique</td><td>Gibco</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Bétaïne</td><td>Sigma</td><td>61962</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>384 plaque de puits (faible volume)</td><td>Sigma</td><td>CLS4511</td><td></td></tr><tr><td>Bouteille de gaz azoté</td><td>BOC</td><td>Qualité industrielle, sans</td><td></td> oxygène</tr><tr><td><fort>Nom</fort></td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Droplets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP2</td><td></td></tr><tr><td>Microinjecteur manuel</td><td>Eppendorf</td><td>CellTram Vario</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Origio, Danemark</td><td>MBB-FP-L-0</td><td></td></tr><tr><td>Pousse-seringues</td><td>KD Scientific</td><td>KDS-210</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu ; Seringue L</td><td>Hamilton</td><td>81020</td><td>Étanche aux gaz, PTFE Luer lock</td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL</td><td>Hamilton</td><td>81327</td><td>Étanche aux gaz, PTFE Luer</td></tr><tr><td>lock Isolateur en silicone</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR24R-A-0.5</td><td>Isolateur en silicone 6x4 puits avec adhésif</td></tr><tr><td>Découpeuse laser</td><td>VersaLASE</td><td>VLS2.30 Laser CO2 3W</td><td>pour la découpe laser d’isolateurs personnalisés</td></tr><tr><td>Feuille</td> <td>acrylique de 1 mm d’épaisseurFeuille de</td><td>précision Clarex 001</td><td>pour la découpe laser d’isolateurs personnalisés</td></tr><tr><td>Feuille adhésive</td><td>3M</td><td></td><td>utilisée pour coller des isolateurs personnalisés sur des lamelles de recouvrement microarrayed</td></tr> Super <tr><td>colle</td><td>Loctite</td><td>LOCPFG3T</td><td></td></tr><tr><td>150 &mu ; m ID/360 &mu ; Tube en silice fondue m OD</td><td>IDEX</td><td>FS-115</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mm ID/1/16" Tube OD PFA</td><td>IDEX</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>0.014" Réf./0.062" OD Tube PTFE</td><td>Kinesis</td><td>008T16-100</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mm ID/2,0 mm OD Tube FEP</td><td>IDEX</td><td>1673</td><td></td></tr><tr><td>Albumen sérique bovin (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Eau ultra-pure</td><td>Millipore, Allemagne</td><td>MilliQ</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td> Entreprise </td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microscopy & Microscope optique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TIRF avec platine XY codée</td><td>Nikon, Japon</td><td>Nikon Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD</td><td>Andor Technologies, Irlande</td><td>IXON DU-897E</td><td></td></tr><tr><td>Source d’excitation laser</td><td>Vortran, États-Unis</td><td>Stradus 488-50</td><td></td></tr><tr><td>Source laser à lyse optique</td><td>Continuum, États-Unis</td><td>Microscope Surelite SLI-10</td><td></td></tr><tr><td> cube de filtre pour TIRF</td><td>Chroma, USA</td><td>z488bp</td><td></td></tr><tr><td>Cube de filtre pour laser à lyse optique</td><td>2000, UK</td><td>LPD01-532R-25</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse d’images</td><td>Open Source</td><td></td> <td>des Fidji</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>version 7.14 ou supérieure</td><td>Logiciel d’analyse d’images</td></tr></tbody></table>

comptage des protéines dans des cellules individuelles avec gouttelettes adressable microarrays

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Comportement souvent cellulaire et les réponses cellulaires sont analysés au niveau des populations où les réponses de nombreuses cellules sont regroupées ensemble comme un résultat moyen masquant le comportement unicellulaire riche au sein d’une population complexe. Technologies de détection et de quantification protéines unicellulaires ont eu un impact remarquable ces dernières années. Nous décrivons ici une plateforme d’analyse unicellulaire pratique et flexible basée sur gouttelette adressable microarrays. Cette étude décrit comment le nombre de copies absolue de protéines cibles peut-être être mesuré avec une résolution de cellule unique. Le suppresseur de tumeur p53 est le gène le plus fréquemment muté dans le cancer humain, avec plus de 50 % des cas de cancer total expose un modèle d’expression de p53 non saines. Le protocole décrit les étapes pour créer 10 gouttes de nL au sein de laquelle les cellules cancéreuses humaines unique sont isolés et le nombre de copies de la protéine p53 est mesuré avec une résolution de la molécule unique afin de déterminer avec précision la variabilité dans l’expression. La méthode peut être appliquée à n’importe quel type de cellule dont la matière première pour déterminer le nombre de copies absolue de toutes les protéines cibles d’intérêt.

Le nombre de copies de protéine basal absolu de p53 a été déterminé avec une résolution de cellule unique dans une lignée de cellules de cancer du côlon humain, cellules BE. Nous démontrons comment expression de p53 peut varier au fil de plusieurs ordres de grandeur et montrent une corrélation faiblement positive entre taille et protéine nombre de copie cellule au sein de la population de cellules BE au repos.
Adressable Microar...

Nous présentons ici des gouttelettes adressable microarrays (SMA), une méthode de tableau basé de gouttelettes en mesure de déterminer l’abondance absolue de protéine dans des cellules individuelles. Nous démontrent la capacité des SMA pour caractériser l’hétérogénéité dans l’expression de la tumeur suppresseur protéine p53 dans une lignée de cellules cancéreuses humaines.

Comptage des protéines dans des cellules individuelles avec gouttelettes adressable Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

L'objectif général de cette expérience est de déterminer le nombre absolu de copies d'une protéine cible avec une résolution au niveau de la cellule unique. Les techniques de type cellule unique permettront une meilleure compréhension du comportement d'une protéine en lien avec le dogme central, et contribueront à une quantification précise de l'expression génique contrôlée. Travailler au niveau de la cellule unique permet de capturer l'hétérogénéité riche et variée de la population cellulaire, laquelle serait autrement perdue en raison du lissage induit par les techniques biochimiques traditionnelles.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison de la sensibilité des tests à cellule unique ou de la quantité limitée de protéine dans chaque cellule. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons souhaité réaliser un dosage protéique à cellule unique pouvant être facilement échantillonné pour des analyses ultérieures en aval. Commencez cette procédure en fabriquant des puces et en imprimant des micro-réseaux d'anticorps comme décrit dans le protocole écrit.Pour préparer l'appareil, insérez une longueur de 100&nbsp;millimètres d’un tub

counting-proteins-in-single-cells-with-addressable-droplet-microarrays

Research

Recherche

JoVE Journal

Cancer Research

Recherche sur le cancer

Droplet plates-formes basées microfluidiques sont des candidats prometteurs pour l'expérimentation à haut débit car ils sont capables de générer picolitres, auto-compartimentées vaisseaux moindre coût aux cadences kHz. Grâce à l'intégration rapide, sensible et haute résolution de fluorescence des méthodes spectroscopiques, les grandes quantités de données générées au sein de ces systèmes peut être efficacement extraite, exploité et utilisé.

Méthodes de détection par fluorescence pour les plateformes microfluidiques gouttelettes

Dans cet article, nous présentons une puce microfluidique pour l'analyse d'une seule cellule. Il permet la quantification des protéines intracellulaires, des enzymes, des cofacteurs, et des seconds messagers à l'aide de dosages ou des dosages immunologiques par fluorescence.

Une puce microfluidique pour l&#39;analyse chimique polyvalente de cellules isolées

Nous décrivons un test numérique final pour quantifier les acides nucléiques avec une lecture simplifiée (analogique). Nous mesurons la fluorescence massive de tests numériques basés sur des gouttelettes à l’aide d’une machine qPCR standard plutôt que d’une instrumentation spécialisée et confirmons nos résultats par microscopie.

Lecture simple de vrac numériques acide nucléique quantification dosages

Ce protocole décrit la fabrication d'une grande échelle, deux dimensions ADN ou anticorps réseau multiplexé, avec des applications potentielles dans les études de signalisation cellulaire et la détection de biomarqueurs.

Flow-modèle Fabrication guidée de haute densité Barcode puces à anticorps

Une méthode sensible et précise de quantification des microARN acellulaires à l’aide d’une chimie à base de colorants et d’une technologie de PCR numérique en gouttelettes est décrite.

Circulant microARN Quantification Utilisation DNA-binding Dye Chemistry and Droplet PCR numérique

Nous démontrons une technologie de puce snap pour effectuer des tests immunologiques reactivity-free multiplexée "sandwich" le simplement claquer deux diapositives. Un appareil à pression est utilisé pour le transfert fiable des réactifs de microarray-aux-puces. La puce du composant logiciel enfichable peut être utilisée pour des réactions biochimiques nécessitant une colocalisation des différents réactifs sans contamination croisée.

Enclenchez la puce pour les immunoessais de Cross-reactivity-libre et exempt de Spotter multiplexée "sandwich"

Nous présentons ici un protocole pour évaluer l’homogénéité étiquetage pour chaque espèce de protéine dans un échantillon complexe des protéines à l’échelle de la molécule.

Échelle du protéome Quantification d’homogénéité à l’échelle de la molécule unique d’étiquetage

L’objectif global du protocole est de préparer plus d’un million de gouttelettes de femtoliter commandées, uniformes, stables et biocompatibles sur un substrat planaire de 1 cm2 qui peut être utilisé pour la synthèse des protéines sans cellules.

Un tableau de gouttelettes femtoliter pour la synthèse massive de protéines parallèles à partir de molécules d’ADN unique

Nous présentons ici un protocole pour mesurer le nombre absolu de copies d’ADN mitochondrial (mt) et les niveaux d’hétéroplasmie de délétion de l’ADNmt dans des cellules individuelles.

Mesure du nombre de copies d’ADN mitochondrial unicellulaire et de l’hétéroplasmie à l’aide d’une réaction en chaîne par gouttelettes numériques par polymérase

Cette méthode quantifie l’abondance microbienne à l’aide d’un format de plaque de 96 puits pour les unités formant colonie (UFC) et est appliquée au microbiome de la drosophile dans des échantillons d’homogénat de mouches entières. Les UFC sont comptées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images automatisé fourni ici.

Comptage rapide des unités formant des colonies sous forme de plaque à 96 puits appliqué au microbiome de la drosophile

Le protocole décrit une plate-forme microfluidique avancée pour mesurer quantitativement la dynamique de sécrétion de cytokines de cellules mononucléées du sang périphérique humain individuelles. La plateforme mesure jusqu’à trois cytokines en parallèle (IL-6, TNFα et IL-1β) pour chaque cellule individuelle stimulée par le lipopolysaccharide à titre d’exemple.

Approche microfluidique pour résoudre la sécrétion simultanée et séquentielle de cytokines de cellules polyfonctionnelles individuelles 

Découvrez le comptage absolu des protéines à l'échelle cellulaire unique avec les microarrays de gouttelettes adressables. Cette méthode quantifie l'hétérogénéité d'expression de la protéine p53 dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines.

Comptage des protéines dans des cellules individuelles avec gouttelettes adressable Microarrays

Explorer plus de vidéos