Circulant microARN Quantification Utilisation DNA-binding Dye Chemistry and Droplet PCR numérique

L’objectif global de cette procédure est de quantifier les microARN circulants et les fluides biologiques, tels que le plasma ou le sérum, à l’aide de la technologie PCR numérique en gouttelettes. La méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine du biomarché. En identifiant le diagnostic et le pronostic, le biomarketing du cancer.

Le principal avantage de cette technique est sa grande sensibilité. Il peut être utilisé pour quantifier également les microARN moins abondants sans nécessiter un gène de référence androgyne. Les implications de cette méthode s’étendent au diagnostic du cancer, car elle a le potentiel d’identifier les personnes atteintes d’un cancer à un stade précoce.

Il peut également être appliqué à d’autres maladies telles que les troubles neurologiques ou cardiaques. En général, les individus doivent faire attention à la manipulation des gouttelettes avant l’étape du cycle thermique pour éviter leur perturbation. Par conséquent, une démonstration visuelle de la génération de gouttelettes est essentielle, car les gouttelettes peuvent être détruites par une manipulation imprudente ou un pipetage trop rapide.

Commencez cette procédure en isolant les microARN plasmatiques ou sériques. Ensuite, transcrivez-les à l’envers et diluez-les comme décrit dans le document d’accompagnement. Retirez l’ensemble d’amorces de microARN EvaGreen master mix et l’ADNc du congélateur et laissez-les décongeler à température ambiante.

Une fois qu’il a décongelé, retournez plusieurs fois le tube de mixage principal. Ensuite, faites tourner tous les réactifs. Préparez une solution de travail numérique en gouttelettes ou en mélange ddPCR conformément aux instructions du document d’accompagnement.

Préparez suffisamment pour un maximum de huit échantillons avec un contrôle sans modèle pour chaque condition plus un excédent de 10 %Une fois assemblé, mélangez soigneusement et tournez le mélange ddPCR. Notez qu’il n’est pas nécessaire d’utiliser des répliques techniques en raison de la haute reproductibilité de cette technologie. Après l’essorage, versez 12 microlitres de mélange ddPCR dans chaque puits d’une plaque PCR à 96 puits.

Ajoutez huit microlitres de matrice d’ADNc dilué dans chaque puits. Insérez ensuite la cartouche du générateur de gouttelettes dans le porte-cartouche. Dans la rangée du milieu de la cartouche génératrice de gouttelettes, transférez soigneusement 20 microlitres de chaque échantillon préparé.

Évitez d’introduire des bulles d’air au fond du puits. Remplissez chacun des puits d’huile de la rangée inférieure avec 70 microlitres d’huile de générateur de gouttelettes. Accrochez le joint sur le porte-cartouche.

Insérez-le dans le générateur de gouttelettes et fermez le couvercle pour démarrer la génération de gouttelettes. Lorsque la génération de gouttelettes est terminée, ouvrez le couvercle, retirez la cartouche du générateur de gouttelettes et retirez le joint jetable. Les puits supérieurs de la cartouche contiennent les gouttelettes.

Transférez lentement et en douceur 40 microlitres de chacun des huit puits supérieurs dans une seule colonne d’une plaque PCR de 96 puits. Scellez immédiatement la plaque avec du papier d’aluminium pour éviter l’évaporation. Dans les 30 minutes suivant le scellement de la plaque, commencez le cycle thermique en utilisant le protocole PCR décrit dans le tableau trois du document d’accompagnement.

Allumez le lecteur de gouttelettes. Déplacez ensuite la plaque du thermocycleur vers le lecteur de gouttelettes. Placez la plaque PCR à 96 puits contenant les gouttelettes post-PCR dans la base du support de plaque dans le lecteur de gouttelettes.

Placez le haut du support de plaque sur la plaque PCR. Appuyez fermement sur les deux languettes de déverrouillage pour fixer la plaque PCR dans le support. Démarrez le logiciel QuantaLife à partir du PC système. Cliquez sur Configurer et ouvrez le fichier de données du modèle qui contient des informations sur les échantillons, les gènes cibles et les dosages.

Dans la barre de navigation de gauche, sélectionnez Exécuter. Une fenêtre Options d’exécution s’affiche. Dans le menu Jeu de colorants, sélectionnez EVA et cliquez sur OK pour démarrer la lecture des gouttelettes.

Une fois l’exécution terminée, utilisez le graphique d’amplitude 2D dans le logiciel d’analyse pour sélectionner les gouttelettes positives. Pour sélectionner les gouttelettes positives, utilisez l’outil lasso dans la barre de navigation de gauche. Ensuite, cliquez sur l’onglet Événements pour vérifier le nombre de gouttelettes positives et totales.

Un nombre total de 18 000 gouttelettes est généralement atteint avec la ddPCR sans sonde. Cliquez ensuite sur l’onglet Concentration pour visualiser l’échantillon final de concentration. Enfin, utilisez l’option Exporter.

CSV pour exporter les valeurs de concentration en microARN. L’ARNm miR-181a-5p a été quantifié dans deux échantillons de plasma, S1 et S2, à l’aide d’une concentration d’amorce de 0,5 et un microlitre à des températures de recuit de 58 et 60 degrés Celsius. Cette figure présente les copies de microARN par microlitre dans la réaction d’amplification pour chaque condition.

Les gouttelettes positives à la PCR pour chaque échantillon sont indiquées en bleu et les gouttelettes négatives sont indiquées en noir. Comme on peut le voir ici, l’échantillon de contrôle n’a pas de gouttelettes positives comme prévu. La réalisation de la PCR à 60 degrés Celsius à l’aide d’une amorce de 0,5 ou d’un microlitre a permis une meilleure séparation des gouttelettes positives et négatives.

Dans cette figure, les barres d’erreur représentent l’intervalle de confiance de Poisson à 95 %. Et ici, le nombre de gouttelettes positives indiqué en bleu est comparé au nombre total de gouttelettes, indiqué en vert. Prises ensemble, ces données démontrent que la PCR numérique en gouttelettes peut être utilisée pour déterminer le nombre absolu de copies de microARN par microlitre d’un liquide biologique.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une quantification de l’ARNm à l’aide de la PCR numérique en gouttelettes. Une fois maîtrisés, 96 échantillons peuvent être analysés en quelques heures seulement, ce qui constitue un rendement optimal pour un environnement clinique. Après chaque développement, cette technique ouvre la voie au domaine de la biopsie liquide pour explorer les microARN et autres acides nucléiques en tant que biomarqueurs de maladies.