Name: Circulant microARN Quantification Utilisation DNA-binding Dye Chemistry and Droplet PCR numérique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Apprenez à quantifier les microARN circulants dans le plasma ou le sérum par PCR en gouttelettes digitale. Cette méthode hautement sensible permet de détecter les biomarqueurs de cancer sans gène de référence.

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Soutenu par un financement de l&#39;Association italienne pour la recherche sur le cancer (AIRC) MF (MFAG 11676) et MN (Molecular Programme spécial Clinical Oncology -. 5 pour mille n 9980, 2010/15) et du ministère italien de l&#39;Instruction, de l&#39;Université et Research FIRB 2011 MN (projet RBAPIIBYNP).

MicroARN Isolation du plasma ou du sérum Remarque: Le plasma et la préparation de sérum est une étape pertinente dans la circulation miRNA quantification. Il n&#39;y a pas de procédure préférée pour le plasma et la préparation du sérum. La seule chose importante à considérer est que tous les échantillons de la même expérience doivent être traitées en utilisant exactement le même workflow. À partir de sérum de 200 pi ou de plasma. L&#39;ARN total peut être isolé à partir de sérum ou de plasma en utilisant des kits disponibles dans le commerce. 1. Protocole pour l&#39;ARN total (y compris miRNA) Isolation <ol><li> des échantillons de sérum / plasma Décongeler sur la glace. </li><li> Ajouter 1 ml de réactif de lyse (par ex., QIAzol) à 200 ul de sérum / plasma. </li><li> Mélanger par tourbillonnement et placer le tube contenant le broyat sur le banc à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Ajouter 3 ul d&#39;une solution nM 4.16 du miRNA cel-miR-39-3p synthétique de C. elegans. </li><li> Ajouter 200 ul de chloroforme. Agiter vigoureusement le tube pendant 15 sec. La place etube e sur le banc à température ambiante pendant 2 min. </li><li> Centrifuger pendant 15 min à 12 000 xg à 4 ° C pour obtenir la séparation des phases: la phase aqueuse supérieure contenant l&#39;ARN. </li><li> Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube, environ 700 ul, éviter tout transfert de matériel d&#39;interphase blanche. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;éthanol à 100% et mélanger par retournement. </li><li> Pipeter jusqu&#39;à 700 ul de l&#39;échantillon dans une colonne de centrifugation de mini placée sur un tube collecteur de 2 ml. Fermer le couvercle et centrifuge à 12.000 xg pendant 15 sec. Jeter l&#39;écoulement. </li><li> Répétez cette étape en utilisant l&#39;échantillon restant. </li><li> Ajouter 700 ul de tampon RWT à la colonne de spin mini fermer le couvercle et centrifuger pendant 15 secondes à 12.000 xg pour laver la colonne. Jeter l&#39;écoulement. </li><li> Pipet 500 ul de tampon RPE dans la colonne de spin Mini. Fermer le couvercle et centrifuger pendant 15 secondes à 12000 rpm. Jeter l&#39;écoulement. Répétez cette étape. </li><li> Centrifuger la colonne de spin mini-à pleine vitesse pendant 2 minutes pour sécher la colonne de spinune membrane à partir d&#39;éthanol résiduel. </li><li> Transférer la colonne spin mini-à un nouveau tube de 1,5 ml de collecte et de l&#39;eau libre de RNase-pipette 35 ul sur la membrane de la colonne. </li><li> Centrifuger pendant 1 min à 12 000 xg pour éluer l&#39;ARN. </li><li> Stocker l&#39;ARN à -80 ° C. Remarque: Comme la concentration d&#39;ARN ne peut pas être déterminée avec précision, utiliser des volumes fixes comme une mesure de quantité d&#39;entrée. </li></ol> 2. microARN Reverse Transcription <ol><li> Décongeler la transcription inverse (RT) des composants réactifs de mélange: 5x tampon de réaction, de l&#39;eau sans nucléase. Mix retournant doucement les tubes et les placer sur la glace. Immédiatement avant utilisation, retirer le mélange d&#39;enzymes du congélateur et placer sur de la glace. Isoler tous les réactifs. </li><li> Préparer le mélange de réactifs RT sur la glace comme décrit dans le tableau 1. Préparer au moins 10% supérieure à mélange. </li><li> Mélanger la réaction par pipetage, puis tourner vers le bas. </li><li> Incuber pendant 60 min à 42 ° C. </li><li> Heat-inactiver le reverse transcriptase pendant 5 min à 95 ° C. </li><li> Immédiatement refroidir à 4 ° C. </li><li> Stocker l&#39;ADNc à -20 ° C. </li></ol> 3. ADNc Dilution <ol><li> Diluer la quantité d&#39;ADNc modèle nécessaire pour les réactions ddPCR prévues dans l&#39;eau sans nucléase. Diluer la réaction d&#39;ADNc entre 1:50 et 1: 500 dans l&#39;eau, en fonction de la cible miARN abondance. Stocker l&#39;ADNc dilué à -20 ° C. L&#39;ADNc dilué avéré être stable pendant au moins 3 mois à -20 ° C. </li></ol> 4. Génération et Gouttelette PCR Remarque: la génération de gouttelettes doit être effectuée sur 8 échantillons à la fois. Réplicats techniques ne sont pas nécessaires, en raison de la grande reproductibilité de cette technologie 12,15 .Un contrôle sans matrice (NTC) échantillon doit être exécuté dans chaque plaque et pour chaque condition de ddPCR différente. <ol><li> Décongeler et équilibrer le mélange maître (par ex., EvaGreen Master Mix), microRNA ensemble d&#39; amorces et d&#39; ADNc à la température ambiante. </li><li> Mélanger le th Master Mixoroughly en renversant le tube plusieurs fois. Isoler tous les réactifs. </li><li> Préparer le mélange ddPCR comme décrit dans le tableau 2. Lorsque plusieurs réactions ddPCR sont effectuées, préparer un ddPCR mélanger travail-solution. Préparer au moins 10% supérieure à mélange. </li><li> Une fois assemblé, bien mélanger et centrifuger le mélange ddPCR. </li><li> Distribuer 12 pi de ddPCR mélanger dans un 96 puits plaque PCR ou tubes PCR. </li><li> Ajouter 8 pi de matrice d&#39;ADNc dilué dans chaque tube / puits. </li><li> Insérer la cartouche de générateur de gouttelettes dans le support. </li><li> Transférer 20 pl de chaque échantillon préparé dans les puits d&#39;échantillon (ligne médiane) de la cartouche du générateur de gouttelettes avec précaution, tout en évitant les bulles d&#39;air au fond du puits. </li><li> Remplir chaque puits de pétrole (rangée du bas) avec 70 pi d&#39;huile générateur de gouttelettes. </li><li> Accrocher le joint sur le support de cartouche et l&#39;insérer dans le générateur de gouttelettes. </li><li> Fermez le couvercle pour lancer la génération de gouttelettes selon la pr fabricantotocole. Lorsque la génération des gouttelettes est terminée, ouvrir le couvercle, retirer le joint jetable. Les premiers puits de la cartouche contiennent des gouttelettes. </li><li> Pipet lentement et en douceur 40 pl du contenu des puits supérieurs huit (les gouttelettes) dans une seule colonne d&#39;une plaque à 96 puits PCR. </li><li> Sceller la plaque PCR avec une feuille immédiatement après le transfert de gouttelettes pour éviter l&#39;évaporation. Utiliser les joints d&#39;étanchéité perforable plaque d&#39;aluminium qui sont compatibles avec les aiguilles dans le lecteur de gouttelettes. </li><li> Commencez le cycle thermique (PCR) dans les 30 min de la plaque d&#39;étanchéité. </li><li> Effectuer le protocole de cyclisme selon le tableau 3. </li></ol> 5. Droplet Reading <ol><li> Allumez le lecteur de gouttelettes. </li><li> Déplacer la plaque par rapport au cycleur thermique pour le lecteur de gouttelettes. </li><li> Placer la plaque PCR 96 puits contenant les gouttelettes post-PCR dans la base du support de plaque. </li><li> Placer la partie supérieure du support de plaque sur la plaque de PCR. Appuyez fermement sur les deux pattes de dégagementvers le bas pour fixer la plaque de PCR dans le support. </li><li> Démarrez le logiciel du système PC. <ol><li> Cliquez sur Configuration pour définir l&#39;expérience (quantification absolue) puis cliquez sur Exécuter pour démarrer la lecture des gouttelettes. </li><li> Lorsque gouttelette lecture est terminée, cliquez sur &quot;Analyser&quot; bouton pour ouvrir et analyser les données. </li><li> Utilisez le tracé d&#39;amplitude 2D dans le logiciel d&#39;analyse pour sélectionner les gouttelettes positives (outil Lasso) (Figure 1B). </li><li> Utilisez l&#39;onglet Événements pour vérifier le nombre de gouttelettes positifs et totaux. Un nombre total de 18.000 - 21.000 gouttelettes est habituellement réalisé avec ddPCR sans sonde. </li><li> Une fois que les gouttelettes positives sont sélectionnées, exporter les valeurs de concentration miRNA en utilisant l&#39;option de l&#39;exportation à partir de l&#39;onglet Concentration. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Arroyo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute2+complexes+carry+a+population+of+circulating+microRNAs+independent+of+vesicles+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5003-5008 (2011).</li>
<li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).</li>
<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).</li>
<li>Braicu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+divine+messengers%3A+are+they+the+Hermes+of+modern+molecular+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Exosomes as divine messengers: are they the Hermes of modern molecular oncology.</a> Cell Death Differ. 22, 34-45 (2015).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease.</a> Circ Res. 110, 483-495 (2012).</li>
<li>Guay, C., Regazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+novel+biomarkers+for+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as novel biomarkers for diabetes mellitus.</a> Nat Rev Endocrinol. 9, 513-521 (2013).</li>
<li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nat Rev Clin Oncol. 11, 145-156 (2014).</li>
<li>Moldovan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+challenges+in+utilizing+miRNAs+as+circulating+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers.</a> J Cell Mol Med. 18, 371-390 (2014).</li>
<li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+Using+Circulating+miRNAs+as+Cancer+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Challenges in Using Circulating miRNAs as Cancer Biomarkers.</a> Biomed Res Int. 2015, 731479(2015).</li>
<li>Jarry, J., Schadendorf, D., Greenwood, C., Spatz, A., van Kempen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+validity+of+circulating+microRNAs+in+oncology%3A+five+years+of+challenges+and+contradictions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The validity of circulating microRNAs in oncology: five years of challenges and contradictions.</a> Mol Oncol. 8, 819-829 (2014).</li>
<li>Witwer, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+MicroRNA+Biomarker+Studies%3A+Pitfalls+and+Potential+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Circulating MicroRNA Biomarker Studies: Pitfalls and Potential Solutions.</a> Clin Chem. 61, 56-63 (2015).</li>
<li>Miotto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Circulating+miRNAs+by+Droplet+Digital+PCR%3A+Comparison+of+EvaGreen-+and+TaqMan-Based+Chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Quantification of Circulating miRNAs by Droplet Digital PCR: Comparison of EvaGreen- and TaqMan-Based Chemistries.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23, 2638-2642 (2014).</li>
<li>Ferracin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+cell-free+microRNAs+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of cell-free microRNAs in cancer patients.</a> Oncotarget. , (2015).</li>
<li>Mangolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+microRNAs+in+the+serum+of+breast+cancer+patients+measured+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR.</a> Biomarker Research. , (2015).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nat Methods. 10, 1003-1005 (2013).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+%28miRQC%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nat Methods. 11, 809-815 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

miARN circulantes sont présents dans le sang à des concentrations extrêmement faibles et la quantité d&#39;ARN qui peut être extrait à partir d&#39;échantillons de plasma et de sérum est faible. Pour cette raison, il est difficile de quantifier avec d&#39;autres techniques telles que la puce à ADN et le séquençage de l&#39;ARN. De plus, il y a un manque généralisé d&#39;accord sur la normalisation des données et la présence de miARN &quot;de référence&quot; endogènes dans le sang. Dans ce contexte, une technologie sensi...

Les microARN (miARN) sont libérés dans la circulation sanguine par potentiellement toutes les cellules de l’organisme, à la suite d’une libération active ou de processus nécrotiques et apoptotiques. Des miARN acellulaires ont été détectés dans la circulation sanguine, soit sous forme de molécules stables libres, soit liés à des lipoprotéines, soit enveloppés à l’intérieur d’exosomes et de microvésicules 1 à 3. On pense qu’ils fonctionnent comme des communicateurs de cellule à cellule 4, et que leur quantité change en présence de cancer, de troubles cardiaques ou de maladies auto-immunes 5-7. Leur quantification précise et reproductible est à la base de leur évaluation en tant que biomarqueurs de maladies. Cependant, pour plusieurs raisons déjà décrites ailleurs 8,9, la quantification des miARN dans le sérum ou le plasma, ainsi que dans d’autres fluides corporels, pourrait être très difficile 10,11. Nous avons récemment mis au point une méthode de quantification absolue des miARN circulants, basée sur des amorces LNA spécifiques aux miARN et la technologie de PCR numérique en gouttelettes de colorant de liaison à l’ADN (ddPCR) 12. Cette méthodologie a été appliquée à la validation des biomarqueurs du cancer du sein à miARN 13,14. 
Après le partitionnement de chaque molécule de miARN transcrite en sens inverse à l’intérieur d’une gouttelette de la taille d’un nanolitre, il est possible de compter le nombre de copies de chaque miARN dans chaque échantillon, en comptant essentiellement le nombre de gouttelettes fluorescentes vertes, et donc positives. Dès qu’une réaction PCR se produit, un comptage positif est obtenu, sans qu’il soit nécessaire d’établir une courbe standard ou de prendre en compte l’efficacité de la PCR dans le calcul de la quantité cible, comme c’est le cas avec la RT-PCR quantitative (RT-qPCR). De plus, la ddPCR s’est avérée plus sensible et plus précise que la RT-qPCR dans la quantification des miARN circulants 15. Dans cet article, nous présentons le protocole détaillé de cette méthodologie, en discutant des étapes les plus pertinentes et en considérant spécifiquement les échantillons cliniques de sérum et de plasma.

<table><tbody><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td></td><td>217004 Colonnes pour l’ARN total, y compris le miARN, extraction à partir du sérum/plasma</td></tr><tr><td>100 nmole ARN oligo Cel-miR-39-3p</td> Integrated <td>DNA Technologies</td> Séquence <td>personnalisée</td><td>: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG</td></tr><tr><td>Kit universel de synthèse d’ADNc II, 8-64 rxns</td><td>Exiqon</td><td>203301</td><td>Kit pour la transcription inverse des microARN</td></tr><tr><td>Ensemble d’amorces MicroRNA LNA PCR&NBSP ;</td><td>Exiqon</td><td>204000-206xxx et 2100000-21xxxxx</td><td>Amorces pour l’amplification des miARN à l’intérieur des gouttelettes</td></tr><tr><td>Générateur de gouttelettes QX200</td><td>BioRad</td><td>186-4002</td><td>Instrument utilisé pour la lecture des gouttelettes</td></tr><tr><td>Lecteur de gouttelettes QX200</td><td>BioRad</td><td>186-4003</td><td>Instrument utilisé pour la génération de gouttelettes</td></tr><tr><td>Logiciel QuantaSoft</td><td>BioRad</td><td>186-3007</td><td>Logiciel pour la collecte et l’analyse</td></tr> <tr>des données<td>Scelleuse de plaques PX1</td><td>PCR BioRad</td><td>181-4000</td><td>Scelleuse</td></tr><tr><td>de plaques DG8 Cartouches et joints d’étanchéité</td><td>BioRad</td><td>186-4008</td><td>Cartouches utilisées pour mélanger l’échantillon et l’huile afin de générer des gouttelettes</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen supermix</td><td>BioRad</td><td>186-4033/36</td><td>PCR supermix</td></tr><tr><td>QX200 Huile génératrice de gouttelettes pour colorant EvaGreen</td><td>BioRad</td><td>186-4005</td><td>Huile pour génération de gouttelettes</td></tr></tbody></table>

circulant microarn quantification utilisation dna-binding dye chemistry and droplet pcr numérique

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulant (des sans cellules) microARN (miARN) sont libérés à partir de cellules dans le flux sanguin. La quantité de micro-ARN spécifique dans la circulation a été liée à un état pathologique et a le potentiel pour être utilisé en tant que marqueur biologique de la maladie. Une méthode sensible et précis pour la circulation microRNA quantification en utilisant une chimie à base de colorants et des gouttelettes de la technologie PCR numérique a été récemment mis au point. Plus précisément, à l&#39;aide Locked Nucleic Acid (LNA) à base d&#39;amorces spécifiques de miARN avec un colorant fluorescent de liaison à l&#39;ADN vert dans un système de PCR compatible avec des gouttelettes numérique, il est possible d&#39;obtenir la quantification absolue des miARN spécifiques. Ici, nous décrivons comment effectuer cette technique pour évaluer le montant de miARN dans les liquides biologiques, tels que le plasma et le sérum, est à la fois faisable et efficace.

La quantité absolue de miARN spécifiques par ml de plasma ou le sérum peut être déterminée en utilisant un colorant fluorescent de liaison à l&#39; ADN vert et des gouttelettes de la technologie de PCR numérique. La figure 1 présente le processus de sélection-gouttelettes positif, ce qui détermine la concentration finale miRNA (copies / ul ) dans la réaction d&#39;amplification calculée par le logiciel d&#39;analyse. Le montant de chaque miARN dans le sang est très diffé...

Une méthode sensible et précise de quantification des microARN acellulaires à l’aide d’une chimie à base de colorants et d’une technologie de PCR numérique en gouttelettes est décrite.

Circulant microARN Quantification Utilisation DNA-binding Dye Chemistry and Droplet PCR numérique

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

L'objectif général de cette procédure est de quantifier les microARN circulants dans des fluides biologiques, tels que le plasma ou le sérum, en utilisant la technologie de PCR numérique par gouttelettes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine des biomarqueurs. En identifiant des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques, elle s'applique au cancer.Le principal avantage de cette technique réside dans sa grande sensibilité. Elle peut être utilisée pour quantifier également les microARN les moins abondants, sans nécessiter de gène de référence androgyne. Les implications de cette méthode s'étendent au diagnostic du cancer, car elle présente le potentiel d'identifier les personnes atteintes d'un cancer à un stade précoce.Il peut également être appliqué à d'autres maladies telles que les troubles neurologiques ou cardiaques. En général, les individus doivent faire attention à la manipulation des gouttelettes avant l'étape de cyclage thermique afin d'éviter leur rupture. Par conséquent, une démonstration visuelle de la génération des gouttelettes est essentielle, car celles-ci peuvent être détruites par une manipulation imprudente ou un pipetage trop rapide.Commencez cette procédure par l'isolement des microARN présents dans le plasma ou le sérum. Ensuite, effectuez la transcription inverse et diluez-les comme décrit dans le document accompagnant. Sortez le mélange maître EvaGreen, le jeu d'amorces pour microARN et l'ADNc du congélateur et laissez-les décongeler à température ambiante.Une fois décongelé, retournez plusieurs fois le tube du mélange maître. Ensuite, centrifugez brièvement tous les réactifs. Préparez une solution de travail de digital droplet PCR (ddPCR) conformément aux instructions fournies dans le document accompagnant.Préparez suffisamment de mélange pour jusqu'à huit échantillons, incluant un témoin sans matrice pour chaque condition, plus un excès de 10 %. Une fois le mélange préparé, homogénéisez-le soigneusement puis centrifugez-le brièvement. Notez que des réplicats techniques ne sont pas nécessaires en raison de la forte reproductibilité de cette technologie. Après la centrifugation, distribuez 12 microlitres de mélange ddPCR dans chaque puits d'une plaque PCR de 96 puits.Ajouter huit microlitres de matrice d'ADNc dilué dans chaque puits. Ensuite, insérer la cartouche du générateur de gouttelettes dans le support de cartouche. Transférer soigneusement 20 microlitres de chaque échantillon préparé dans la rangée centrale de la cartouche du générateur de gouttelettes.Évitez d'introduire des bulles d'air au fond du puits. Remplissez chacun des puits d'huile de la rangée inférieure avec 70 microlitres d'huile pour générateur de gouttelettes. Accrochez le joint au support de cartouche.Insérez dans le générateur de gouttelettes et fermez le couvercle pour démarrer la génération de gouttelettes. Lorsque la génération de gouttelettes est terminée, ouvrez le couvercle, retirez la cartouche du générateur de gouttelettes et retirez le joint jetable. Les puits supérieurs de la cartouche contiennent les gouttelettes.Transférez lentement et délicatement 40 microlitres de chacun des huit puits supérieurs dans une seule colonne d'une plaque PCR 96 puits. Scellez immédiatement la plaque avec du papier aluminium afin d'éviter l'évaporation. Dans les 30 minutes suivant la fermeture de la plaque, commencez le cyclage thermique en utilisant le protocole PCR décrit dans le tableau trois du document accompagnant.Mettez l'appareil de lecture des gouttelettes sous tension. Ensuite, déplacez la plaque du thermocycleur vers l'appareil de lecture des gouttelettes. Placez la plaque PCR de 96 puits contenant les gouttelettes post-PCR dans la base du support de plaque de l'appareil de lecture des gouttelettes.Placer le dessus du support de plaque sur la plaque de PCR. Appuyer fermement sur les deux languettes de déverrouillage pour fixer la plaque de PCR dans le support. Démarrer le logiciel QuantaLife à partir de l'ordinateur du système. Cliquer sur Configuration et ouvrir le fichier de modèle contenant les informations relatives aux échantillons, aux gènes cibles et aux tests.Dans la barre de navigation située à gauche, sélectionnez Exécuter. Une fenêtre Options d'exécution apparaîtra. Dans le menu Jeu de colorants, sélectionnez EVA, puis cliquez sur OK pour démarrer la lecture des gouttelettes.Une fois l'analyse terminée, utilisez le tracé d'amplitude 2D dans le logiciel d'analyse pour sélectionner les gouttelettes positives. Pour sélectionner les gouttelettes positives, utilisez l'outil de sélection polygonale situé dans la barre de navigation gauche. Ensuite, cliquez sur l'onglet Événements pour vérifier le nombre de gouttelettes positives et le nombre total de gouttelettes.Un nombre total de 18 000 gouttelettes est généralement obtenu avec la ddPCR sans sonde. Cliquez ensuite sur l'onglet Concentration pour visualiser l'échantillon final de concentration. Enfin, utilisez l'exportation.CSV à exporter les valeurs de concentration en microARN. L'ARNm miR-181a-5p a été quantifié dans deux échantillons de plasma, S1 et S2, en utilisant des concentrations d'amorces de 0,5 et une microlitre, à des températures d'hybridation de 58 et 60 degrés Celsius. Cette figure présente le nombre de copies de microARN par microlitre dans la réaction d'amplification pour chaque condition.Les gouttelettes positives en PCR pour chaque échantillon sont représentées en bleu, et les gouttelettes négatives sont représentées en noir. Comme on peut le voir ici, l'échantillon témoin ne présente aucune gouttelette positive, comme prévu. La réalisation de la PCR à 60 degrés Celsius en utilisant soit 0,5 soit un microlitre d'amorce a permis une meilleure séparation des gouttelettes positives et négatives.Dans cette figure, les barres d'erreur représentent l'intervalle de confiance de Poisson à 95 %. Ici, le nombre de gouttelettes positives, indiqué en bleu, est comparé au nombre total de gouttelettes, indiqué en vert. Ces données montrent globalement que la PCR numérique en gouttelettes permet de déterminer le nombre absolu de copies de microARN par microlitre d'un liquide biologique.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment effectuer une quantification d'ARNm à l'aide de la PCR numérique en gouttelettes. Une fois maîtrisée, cette technique permet d'analyser 96 échantillons en seulement quelques heures, ce qui constitue un rendement optimal pour un cadre clinique. À chaque avancée, cette méthode ouvre la voie au domaine de la biopsie liquide afin d'explorer les microARN et d'autres acides nucléiques en tant que biomarqueurs de maladies.

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Nous décrivons ici une inversion optimisé multiplexe transcriptase PCR quantitative (qRT-PCR) en combinaison avec le protocole d'une plateforme microfluidique comme un coût et le temps moyen efficace de dépistage à haut débit pour microARN (miARN) les niveaux d'expression, surtout quand on travaille avec des quantités limitées de l'échantillon.

Haute profilage de microARN Débit: Multiplex Optimisé qRT-PCR à l&#39;échelle nanolitres sur l&#39;IFC de Fluidigm ArrayTM dynamique

Dans cette vidéo, nous présentons une procédure étape par étape pour générer des nano-gouttelettes émulsionnées afin de détecter les acides nucléiques cibles par réaction en chaîne par polymérase numérique ou dPCR.

Réaction en chaîne par polymérase numérique en gouttelettes : une méthode pour générer des réactions PCR de nanogouttelettes pour détecter des mutations tumorales rares

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration de la technique de PCR numérique duplex (ddPCR), une modification de la technique PCR traditionnelle qui est utile pour détecter simultanément deux marqueurs génétiques différents. Une seule réaction de PCR est divisée en gouttelettes émulsionnées de la taille d’un nanolitre qui sont amplifiées indépendamment, et la détection de signaux d’amplification de fluorescence de couleurs différentes à partir de la fraction de gouttelettes est utilisée...

PCR numérique duplex pour la quantification simultanée de marqueurs génétiques doubles

Les microARN (miARN) sont une classe de molécules régulatrices largement conservée. Nous décrivons ici une méthode de clonage de miARN qui repose sur deux étapes de ligature puissantes suivies d’un séquençage à haut débit. Notre méthode permet une quantification précise des miARN à l’échelle du génome.

La ligature très efficace de petites molécules d&#39;ARN pour microARN quantification par séquençage à haut débit

MicroARN qui circulent ont récemment émergé comme biomarqueurs prometteurs et novateurs en vue de divers cancers et d'autres maladies. Le but de cet article est de discuter de trois plateformes de PCR différents basés sonde en temps réel et les méthodes qui sont disponibles pour quantifier et déterminer l'abondance des microARN circulation.

PCR en temps réel basée sur une sonde Approches de mesure quantitative des microARN

Nous décrivons un test numérique final pour quantifier les acides nucléiques avec une lecture simplifiée (analogique). Nous mesurons la fluorescence massive de tests numériques basés sur des gouttelettes à l’aide d’une machine qPCR standard plutôt que d’une instrumentation spécialisée et confirmons nos résultats par microscopie.

Lecture simple de vrac numériques acide nucléique quantification dosages

Ce rapport décrit un protocole de mesure des niveaux absolus de miRNA plasma, à l’aide de la transcription inverse en temps réel quantitative PCR avec ou sans pré amplification. Ce protocole permet de mieux comprendre la quantité de plasma miARN et permet une évaluation qualitative des données correspondantes de différentes études ou laboratoires.

Quantification absolue des micro-ARN plasmatique chez les singes Macaques, à l’aide de la Transcription inverse en temps réel Quantitative PCR

Les microARN circulants ont montré prometteur comme biomarqueurs des maladies cardiovasculaires et d’infarctus du myocarde aigus. Dans cette étude, les auteurs décrivent un protocole pour l’extraction de miRNA, transcription inverse et ACP numérique pour la quantification absolue des miARN dans le sérum des patients atteints de maladies cardiovasculaires.

PCR numérique pour quantifier les microARN dans l’infarctus aigu du myocarde et les maladies cardiovasculaires en circulation

Ici, nous présentons un protocole pour détecter des mutations somatiques de tumeur dans l'ADN circulant présent dans les fluides biologiques patients (biofluides). Notre méthode numérique de réaction en chaîne de polymérase de gouttelette (dPCR) permet de quantifier la fréquence allélique de mutation de tumeur (MAF), facilitant un complément mini-invasif au diagnostic et à la surveillance temporelle de la réponse de tumeur.

Détection et surveillance de l'ADN circulant associé à la tumeur dans les biofluides des patients

Nous présentons ici un protocole pour mesurer le nombre absolu de copies d’ADN mitochondrial (mt) et les niveaux d’hétéroplasmie de délétion de l’ADNmt dans des cellules individuelles.

Mesure du nombre de copies d’ADN mitochondrial unicellulaire et de l’hétéroplasmie à l’aide d’une réaction en chaîne par gouttelettes numériques par polymérase

Ce protocole décrit la méthode détaillée de PCR par gouttelettes numériques (dd-PCR) pour une quantification précise des niveaux d’ARN circulaire (circRNA) dans les cellules à l’aide d’amorces divergentes.

Quantification d’ARN circulaires par PCR numérique

Apprenez à quantifier les microARN circulants dans le plasma ou le sérum par PCR en gouttelettes digitale. Cette méthode hautement sensible permet de détecter les biomarqueurs de cancer sans gène de référence.

Circulant microARN Quantification Utilisation DNA-binding Dye Chemistry and Droplet PCR numérique

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