Super-résolution corrélative et microscopie électronique pour résoudre la localisation des protéines dans la rétine de poisson-zèbre

Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour obtenir des résultats localisation subcellulaire de protéine sur la rétine de poisson-zèbre en corrélant la microscopie photonique Super-résolution et images de microscopie électronique à balayage.

L’objectif global de cette méthode de microscopie est de localiser précisément l’expression des protéines en relation avec différents organites subcellulaires dans la rétine larvaire du poisson-zèbre en corrélant des images de super-résolution et de microscopie électronique à balayage. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du développement rétinien et des voies cellulaires, telles que l’étude de la mauvaise localisation des protéines chez les mutants. Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine la super-résolution avec la microscopie électronique à balayage pour obtenir des données de localisation des protéines très précises dans le contexte structurel de l’échantillon.

La collection de sections Tokuyasu sur des plaquettes de silicone facilite considérablement la manipulation et l’utilisation d’ombres de platine pour le contraste fournit une bonne topographie de l’échantillon. Ainsi, cette méthode peut donner un aperçu des études sur la rétine des larves de poisson-zèbre. L’un de ses principaux avantages est qu’il peut également être appliqué à de nombreux autres systèmes biologiques, tels que l’identification de l’expression des protéines dans les tissus de souris.

Après avoir disséqué les yeux de larves de poisson-zèbre fixées selon le protocole de texte, réchauffez 15 millilitres de gélatine de marque alimentaire locale à 12 % dans PBS à 40 degrés Celsius. Ensuite, aspirez le PBS des tubes oculaires et ajoutez la solution de gélatine. Tapotez doucement le tube pour vous assurer que la gélatine s’infiltre dans l’échantillon et incubez-le pendant 10 à 30 minutes à 40 degrés Celsius dans un thermobloc avec une légère agitation ou dans un bain-marie.

Dans un bain-marie à 40 degrés Celsius, remplissez des moules plats en silicone ou en polyéthylène de 12 x cinq sur trois millimètres avec de la gélatine chaude. Ensuite, à l’aide d’une pipette, ajoutez deux yeux par moule et sous des jumelles, utilisez une aiguille de dissection pour bien les aligner. Après avoir laissé la gélatine refroidir à température ambiante pendant une minute, placez-la à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes pour qu’elle durcisse.

Sous les jumelles, utilisez une lame de rasoir pour recouper le bloc de gélatine afin qu’il s’adapte à un œil par bloc. Transférez les yeux incrustés de gélatine dans du saccharose de 2,3 molaires dans du PBS sur glace. Incuber les échantillons à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Remplacez ensuite les échantillons par une solution fraîche de saccharose à 2,3 molaires. Et conservez le tissu à quatre degrés Celsius, ou moins 20 degrés Celsius pour un stockage pouvant aller jusqu’à plusieurs mois. Coupez à nouveau le bloc de gélatine à presque la taille de l’œil avant de le transférer sur une cryo-broche.

Ensuite, congelez le bloc dans de l’azote liquide et transférez-le dans un cryo-ultramicrotome. À l’aide d’un couteau diamanté dans le cryo-ultramicrotome, coupez des sections de 110 nanomètres d’épaisseur à moins 120 degrés Celsius. Choisissez les sections avec une boucle câblée contenant une gouttelette de méthylcellulose à 2 % et une solution de saccharose à 2,3 molaires.

Transférez ensuite les sections sur une plaquette de silicone de sept x sept millimètres. Pour laver les gaufrettes, pipetez quatre gouttes et placez les gaufrettes à l’envers sur les gouttes. Incuber les gaufrettes sur les gouttes à zéro degré Celsius pendant 20 minutes.

Lavez ensuite les gaufrettes deux fois dans du PBS à température ambiante pendant deux minutes chacune. Incuber les échantillons trois fois dans de la glycine à 0,15 % dans du PBS pendant une minute chacune. Ensuite, utilisez PBS pour laver les échantillons trois fois pendant une minute par lavage.

Pré-incubez le tissu avec du PBG pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez l’anti-Tom20 de lapin en PBG aux sections. Et incubez les gaufrettes à température ambiante pendant 30 minutes.

Avec le PBG, lavez le mouchoir six fois pendant une minute par lavage. Ensuite, pré-incubez les échantillons avec du PBG à température ambiante pendant cinq minutes. Remplacez le PBG par des fragments de Fab divalent anti-lapin Alexa 647 dans le PBG et incubez pendant 30 minutes.

Lavez les échantillons dans PBG six fois pendant une minute par lavage. Ensuite, utilisez PBS pour laver les gaufrettes trois fois pendant deux minutes. Ajoutez du DAPI et du PBS aux plaquettes et incubez pendant 10 secondes.

Ensuite, utilisez PBS pour laver les échantillons deux fois pendant deux minutes chacune. Placez la plaquette sur une gouttelette d’une solution individuelle de glycérol à 80 % et d’un tampon d’imagerie contenant un système de piégeage de l’oxygène et incubez-la brièvement. Transférez les plaquettes, côté tissu vers le bas, sur une goutte fraîche du mélange un à un de glycérol à 80 % et de tampon d’imagerie sur une boîte de Pétri à fond de verre.

Utilisez une pipette de tous les côtés pour enlever la majeure partie du liquide sous la plaquette. Utilisez ensuite des bandes de silicone pour fixer la plaquette au fond de la boîte de Pétri. Placez les sections montées sur un microscope inversé avec un objectif à immersion dans l’huile à grande ouverture numérique.

Avant l’imagerie, laissez l’échantillon s’équilibrer en fonction de la température du microscope afin de minimiser ou de réduire la dérive latérale et axiale. Centrer la zone d’intérêt et acquérir des images de référence d’épifluorescence à grand champ. Passez en mode de fonctionnement super-résolution.

Réglez le temps d’exposition de l’appareil photo sur 15 millisecondes et réglez le gain multiplicateur d’électrons au maximum de 300. Ensuite, illuminez l’échantillon en mode épifluorescence avec le laser de 642 nanomètres à la puissance laser maximale. Dès que les clignotements de la molécule unique sont bien séparés dans chaque image, de sorte que la probabilité soit faible que les signaux individuels se chevauchent, réduisez la puissance laser à près de 1/3.

Enregistrez l’image brute en épifluorescence en acquérant un minimum de 30 000 images. À partir des données brutes, sous Outils, l’analyse de la série t utilise un seuil de détection de 30 photons. Cliquez sur Évaluer pour générer une liste d’événements de localisation.

Sous Outils, dans le panneau Traitement de la liste d’événements, cliquez sur Créer une image pour visualiser l’image super-résolution par ajustement gaussien, en appliquant une taille de pixel de rendu de quatre nanomètres. Retirez les bandes de silicone et ajoutez une goutte de PBS près des bords de la plaquette pour la soulever de la boîte de Pétri. Après avoir utilisé du PBS pour laver la plaquette deux fois pendant deux minutes chacune, utilisez 0,1 % de glutaraldéhyde dans du PBS pour la post-fixer pendant cinq minutes.

Ensuite, lavez à nouveau l’échantillon deux fois pendant deux minutes par lavage dans PBS. Incuber la plaquette dans une goutte de méthylcellulose à 2 % dans de l’eau sur de la glace deux fois pendant cinq minutes par incubation. Insérez ensuite la plaquette dans un tube à centrifuger et centrifugez à 14, 100 fois g pendant 90 secondes.

Après la rotation, utilisez du ciment de carbone conducteur pour monter la plaquette sur un bout d’aluminium MEB. À l’aide d’un dispositif d’évaporation par faisceau d’électrons, ajoutez une couche de deux à 10 nanomètres de carbone de platine sur l’échantillon par ombrage rotatif avec les paramètres suivants. Coupes d’images avec un microscope électronique à balayage à 1,5 kilovolts, une distance de travail de deux millimètres et un détecteur d’électrons secondaires dans l’objectif.

Utilisez Fidji pour ouvrir des images de microscopie optique et électronique en cliquant sur Fichier, Ouvrir. Ajustez la taille du canevas en cliquant sur Image, Ajuster, Taille du canevas. Ensuite, placez les deux images dans une pile en cliquant sur Image, Piles, Images à empiler.

Aux Fidji, ouvrez une nouvelle interface de piste EM2 en cliquant sur Fichier, Nouveau, Piste EM2 nouveau. Importez la pile avec les deux images en cliquant avec le bouton droit de la souris sur la fenêtre noire et en sélectionnant Importer la pile. Alignez manuellement l’image de microscopie optique sur l’image de microscopie électronique avec des points de repère en utilisant un clic droit de la souris sur l’image et en sélectionnant Aligner, aligner le calque manuellement avec des points de repère.

Choisissez l’outil Sélectionner pour ajouter des points de repère. Utilisez la forme des noyaux comme référence pour sélectionner les mêmes bords dans les deux images et pour ajouter plusieurs points. Appliquez l’alignement avec un modèle affine en cliquant avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Appliquer la transformation, Modèle faffine (Affine Model).

Enfin, modifiez la transparence de la couche pour évaluer la qualité de l’alignement. Ce panneau montre une image à grand champ à faible grossissement d’une coupe rétinienne de poisson-zèbre cinq jours après la fécondation. La même zone est représentée ici par la microscopie électronique à balayage.

Ces images à plus fort grossissement montrent Tom20 coloré en rouge avec des amas au niveau des mitochondries. L’expression de Tom20 est montrée ici telle qu’elle a été détectée par la microscopie GSDIM. Dans cette image, la même section combine la super-résolution corrélative et la microscopie électronique à balayage.

La coloration Tom20 apparaît dans le cluster mitochondrial au niveau des membranes externes des mitochondries. Le signal DAPI de fluorescence dans les noyaux correspond à la topographie de l’image MEB. Cette image MEB fournit un contexte à la coloration Tom20 dans l’image GSDIM.

Les crêtes mitochondriales sont clairement visibles, et la coloration Tom20 est localisée aux membranes externes des mitochondries. Les membranes du segment externe des photorécepteurs sont clairement résolues. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’optimiser au mieux vos paramètres d’étiquetage et d’imagerie.

Seuls les échantillons étiquetés de manière optimale conviennent à la super-résolution. Les échantillons ne doivent jamais sécher à aucun moment pendant la procédure d’étiquetage. Cette procédure pourrait être étendue à l’immunofluorescence de double marquage, et ainsi permettre la localisation de deux protéines différentes au sein d’une structure spécifique.

Dans le cas d’échantillons plus complexes, l’utilisation de marqueurs repères est recommandée pour obtenir un alignement précis des images. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des études corrélatives pour localiser les protéines en relation avec les différents organites de la cellule dans un échantillon de tissu complexe avec une précision de super-résolution.