Quantification de la dynamique du cytosquelette à l’aide de la microscopie dynamique différentielle

Notre protocole peut quantifier la dynamique dans de nombreux systèmes en utilisant une gamme de techniques de microscopie optique. Nous soulignons comment cette méthode peut, en particulier, aider à caractériser la dynamique des réseaux de cytosquelettes reconstitués. Le principal avantage de l’utilisation de notre progiciel de microscopie dynamique différentielle est qu’il est bien documenté, qu’il contient plusieurs exemples de fichiers d’analyse et qu’il peut facilement être adapté pour étudier différents types de dynamique.

Notre progiciel peut être utilisé pour quantifier la dynamique non seulement dans les réseaux de cytosquelettes reconstitués, mais aussi dans d’autres matériaux mous et biologiquement pertinents. Sur la base des échelles de temps et de longueur pour sonder, acquérir des séquences d’images de plus de 1 000 images à l’aide d’un logiciel de contrôle de microscope, tel que Micro-Manager. Sous le dossier exemples fourni dans le référentiel de code PyDDM, effectuez une copie du fichier de paramètres nommé example_parameter_file.yml.

Ouvrez ce fichier EML avec un éditeur de texte comme Notepad + ou l’éditeur de texte dans JupyterLab. Dans le fichier EML copié, indiquez le répertoire de données et le nom de fichier correspondant à la séquence d’images à analyser. Sous la section des métadonnées, indiquez la taille en pixels et la fréquence d’images.

Dans la section Paramètre d’analyse, sélectionnez les paramètres de calcul de la matrice DDM, tels que le nombre de temps de latence différents et le temps de latence le plus long. Fournissez des détails sur l’ajustement de la matrice DDM ou de la fonction de diffusion intermédiaire dans la section des paramètres d’ajustement, tels que le nom du modèle et le paramètre du modèle, la supposition initiale, la limite inférieure et la limite supérieure. Initialisez une instance de la classe d’analyse DDM en fournissant les métadonnées dans les paramètres d’analyse en transmettant le nom de fichier du fichier EML avec le chemin d’accès complet à l’analyse DDM.

Vous pouvez également transmettre les métadonnées et les paramètres en tant que structure de données de dictionnaire Python. Exécutez la fonction pour calculer la matrice DDM. Inspectez les données renvoyées avec les variables et métadonnées associées, qui sont stockées sous forme de jeu de données dans le package Xarray.

Ensuite, inspectez les tracés et les figures, qui sont enregistrés sous forme de fichier PDF et le répertoire de données. L’un de ces graphiques montre la méthode par défaut pour estimer l’arrière-plan. Si nécessaire, remplacez la méthode dans laquelle l’arrière-plan est estimé à l’aide de la méthode d’arrière-plan du paramètre dans le fichier EML ou en tant qu’argument de mot-clé facultatif pour la matrice DDM de calcul de fonction.

Initialisez une instance de la classe d’ajustement DDM en transmettant le nom de fichier du fichier EML contenant les métadonnées d’image et les paramètres d’ajustement. Répertoriez les modèles disponibles en exécutant la fonction d’impression des modèles. Spécifiez le modèle à utiliser dans le fichier de paramètres EML ou à l’aide de la fonction reload fit model by name.

Pour chaque paramètre du modèle choisi, définissez les estimations et les limites initiales si elles sont différentes des valeurs spécifiées dans le fichier EML à l’aide des fonctions set parameter initial guess et set parameter bounds. Exécutez l’ajustement avec l’ajustement de fonction. Générez des tracés pour inspecter les ajustements dans la dépendance q des paramètres d’ajustement avec le rapport d’ajustement de fonction.

Vérifiez la sortie, y compris la figure avec deux sous-tracés montrant la matrice DDM ou ISF à quatre valeurs q avec l’ajustement. Utilisez la classe de navigation DDM s’intègre dans l’environnement Jupyter Notebook pour tracer la matrice DDM ou ISF avec le meilleur ajustement de manière interactive. En cliquant sur un point du diagramme de temps de désintégration par rapport au nombre d’onde, les données et l’ajustement s’affichent.

Vérifiez les résultats de l’ajustement enregistrés dans un jeu de données Xarray et utilisez la fonction deux netCDF ou le module de cornichon intégré de Python pour enregistrer cette structure de données sur le disque. L’analyse DDM a été effectuée sur la série d’images en champ clair de billes de 0,6 micron dans un réseau de vimentine et sur des images de microscope confocal provenant d’un réseau composite actine-microtubule actif avec des étiquettes fluorescentes spectralement distinctes. Les fonctions de diffusion intermédiaires ont été tracées en fonction du temps de latence à différents nombres d’ondes et d’un réseau avec une concentration de vimentine de 19 micromolaires et 34 micromolaires.

Le plateau de temps de décalage long de la fonction à une valeur bien supérieure à zéro indique une non-énergie. Le temps de désintégration tau tracé en fonction de q pour deux réseaux avec des concentrations de vimentine différentes montre un mouvement sub-diffusif ou confiné. Les paramètres de non-ergodicité c tracés en fonction de q au carré pour le réseau avec 34 et 49 vimentine micromolaires ont montré que le log de c était proportionnel à q au carré comme prévu pour le mouvement confiné.

Les diagrammes de déplacement moyen au carré par rapport au temps de latence ont montré que les valeurs déterminées à partir de DDM concordaient bien avec celles trouvées grâce au suivi d’une seule particule. Pour le réseau plus concentré, la valeur plafonne à des temps de latence plus longs. La matrice DDM par rapport au temps de latence pour un réseau composite actine-microtubule actif a montré que la matrice DDM pour une valeur q particulière avait un plateau à des temps de latence faibles, puis augmentait dans un plateau supplémentaire à des temps de latence importants.

Les temps de désintégration caractéristiques tau des ajustements à la matrice DDM montrent que la relation entre tau et q indique un mouvement balistique. Après avoir développé ce progiciel PyDDM, nous l’avons utilisé pour étudier la dynamique anisotrope et variable dans le temps des réseaux de cytosquelettes actifs et d’autres systèmes.