Microscopie optique quantitative: mesure de biophysique cellulaire Caractéristiques avec un microscope optique standard

L’objectif global de cette procédure est de quantifier les caractéristiques physiques de base des échantillons cellulaires, y compris la masse et le volume, à l’aide d’un microscope optique standard et d’un traitement d’image. Ceci est accompli en montant d’abord des échantillons cellulaires cultivés sur des lamelles de verre sur des lames de microscope. Ensuite, grâce à la mise au point, des images à fond clair et à contraste interférent différentiel sont obtenues.

Ensuite, chaque pile Z d’images est saisie dans des programmes de traitement d’images MATLAB distincts qui extraient les données physiques. En fin de compte, les propriétés physiques de base des échantillons cellulaires sont obtenues à l’aide de mesures d’intensité de focale, sous microscopie à contraste en fond clair et à contraste interférentiel différentiel. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la microscopie à fluorescence est que les échantillons cellulaires n’ont pas besoin d’être fixés, imprégnés ou colorés.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, telles que l’organisation de la densité subcellulaire au cours du cycle cellulaire ou entre différentes populations cellulaires contribuant à un état pathologique. À l’aide d’un microscope doté à la fois de capacités DIC et en fond clair et de spécifications supplémentaires selon le protocole textuel, commencez par ouvrir le logiciel du livre de diapositives et créez une nouvelle lame pour la collecte d’images. Ensuite, ouvrez la fenêtre de mise au point et dans la section du jeu de filtres, sélectionnez DIC Dans l’onglet de l’oscilloscope sous la section du condenseur, réglez la barre coulissante de l’ouverture sur la position la plus à droite. Cela permet d’obtenir un éclairage à grande ouverture numérique et d’améliorer le sectionnement optique de l’échantillon.

Après avoir capturé une pile DIC de l’échantillon, ouvrez la fenêtre de focus et sélectionnez Ouvrir. Sous la section du jeu de filtres, réglez la barre coulissante d’ouverture sur la position la plus à gauche fermée à fond pour fournir un éclairage à faible NA. Après avoir réglé l’intensité du signal, ouvrez la fenêtre de capture d’image.

Les paramètres de capture 3D de l’acquisition de la pile DICZ seront affichés dans la section du jeu de filtres de la fenêtre de capture d’image. Cochez la case ouverte et spécifiez le temps d’exposition. Dans la section d’informations sur l’image, nommez l’image et sélectionnez Démarrer pour lancer l’acquisition d’images Zack.

Exportez ensuite les piles Z selon le protocole texte pour effectuer des mesures de volume une fois dans le programme MATLAB H-T-D-I-C intitulé JoVE HT DCO V one M Sous la section zéro, mettez à jour la variable du répertoire dependencies en copiant et collant le répertoire contenant le hilbert. Transformer DM et sobel edge Détecter les fichiers M à partir de l’explorateur. Entre les guillemets simples suivant le répertoire des dépendances est égal à exécuter la section zéro du programme joco HT DCO V un M.

Dans la première section, mettez à jour le répertoire des images en copiant et collant le répertoire contenant les images au focus traversant sous forme de point TIF. Entre les guillemets simples, n’exécutez cette section qu’une seule fois pour aligner et faire pivoter les images. Pour la transformation de Hilbert, exécutez la deuxième section du code Une boîte de dialogue intitulée Définir les paramètres DIC HT apparaîtra.

Entrez ensuite le numéro du plan focal où l’image DIC de l’échantillon est nette, la résolution latérale, la résolution axiale, l’angle de rotation de l’image DIC nécessaire pour effectuer la transformée de Hilbert et, enfin, la taille de la région d’intérêt. Cliquez ensuite sur OK. Une image du plan focal DIC spécifié par le numéro du plan focal s’affiche avec une case bleue.

Placez la boîte sur l’élément d’intérêt, tel qu’une cellule. Une fois que la boîte a été positionnée sur la zone souhaitée, double-cliquez à l’intérieur du B.Le contraste de l’image doit être tel que les éléments sombres apparaissent à gauche tandis que les éléments lumineux apparaissent à droite. Faites glisser la zone bleue sur la région d’intérêt et remodelez-la si nécessaire.

Ensuite, sous la section trois, pour générer un masque rectangulaire, un ligne de commentaire 1 6 7 et ligne de commentaire 1 7 0 exécutez la section trois du programme en cliquant dans l’image et en faisant glisser la souris pour commencer à définir le masque rectangulaire. Double-cliquez ensuite sur la case pour l’accepter. Pour générer un masque dessiné à la main, commentez la ligne 1 6 7 et une ligne de commentaire 1 7 0 avant d’exécuter la section trois En cliquant et en dessinant le masque souhaité avec la souris, double-cliquez sur le masque pour l’accepter après avoir exécuté la section quatre, pour construire des piles d’images transformées de Hilbert selon le protocole de texte exécute la section cinq.

Optimiser la segmentation d’images des images en coupe transversale xz de la région d’intérêt. La figure 500 produite par le programme apparaît avec trois types de contraste différents. Le succès de l’algorithme à trouver les bordures de la cellule dépend d’une combinaison du masque utilisé et de la valeur du seuil aux lignes 2, 2, 9 du programme, commencez par une valeur de 0,5 et ajustez la valeur du seuil et réexécutez cette section du programme jusqu’à ce que le contour correct soit obtenu dans l’une des colonnes.

Si le plan était le meilleur dans la première colonne, dans la segmentation DIC, utilisez la section six pour déterminer le volume. Si la deuxième colonne a donné des résultats optimaux, exécutez la section sept pour déterminer le volume de cellule à partir de Hilbert, transformez l’imagerie DIC si la colonne trois a donné les résultats optimaux, utilisez l’imagerie DIC à transformée de Hilbert filtrée plus tôt tout en exécutant la section huit pour déterminer le volume pour prendre des mesures de masse dans le programme NIQ PM MATLAB et intitulée JO VCO NI qpm V1 M sous la section zéro. Mettez à jour l’emplacement des trois répertoires dépendances, BRIGHTFIELD et DIC après avoir exécuté la première section, exécutez la deuxième section dans la boîte de dialogue intitulée définir les paramètres N-I-Q-P-M, entrez le numéro du plan focal où l’image en fond clair de l’échantillon est nette, la résolution latérale, la résolution axiale et la taille de la région d’intérêt.

Cliquez ensuite sur OK. Une image du plan focal en fond clair spécifié par le numéro du plan focal s’affiche avec une case bleue. Après avoir ajusté la mise au point si nécessaire en relançant la section deux, faites glisser la boîte autour de l’image et sélectionnez les nœuds de la boîte et faites-la glisser pour la redimensionner avant de double-cliquer à l’intérieur de la boîte pour l’accepter.

Une fois qu’une pile d’images en fond clair a été construite en exécutant la section trois, exécutez la section quatre pour générer la carte de phase, les images pseudo-DIC et les comparaisons avec l’imagerie en fond clair et l’image true DIC lorsque les images pseudo DIC et true DIC sont aussi similaires que possible, exécutez la section cinq A ou cinq B qui permet à l’utilisateur de délimiter la cellule pour générer la carte de densité de masse, La masse totale et l’histogramme de la densité cellulaire sont corrects. L’éclairage de l’échantillon pendant l’acquisition d’images à foyer continu est essentiel à la mise en œuvre réussie de l’algorithme N-I-Q-P-M et H-T-D-I-C. Cette figure illustre un éclairage NA faible et élevé sous CID et contraste en fond clair pour une sphère de polystyrène et la lignée cellulaire d’adénocarcinome colorectal humain SW six 20.

Ces panneaux démontrent une imagerie optimale pour N-I-Q-P-M et ceux-ci affichent une imagerie optimale pour HT DIC. Ces images démontrent la dépendance des paramètres de l’algorithme NIQ PM, en mettant en évidence les implémentations réussies et infructueuses. Ici, nous explorons le profil de phase d’une sphère de polystyrène de 4,8 micromètres de diamètre.

Le profil attendu est connu théoriquement et peut donc être comparé directement à la reconstruction NIQ PM. Ces panneaux présentent la meilleure reconstruction possible pour les effets de diffraction de la sphère à la fois aux limites de la sphère et à l’intérieur empêchent une reconstruction stable en tous points de la sphère. La région centrale de la sphère peut être capturée avec N-I-Q-P-M avec un pourcentage d’erreur de 1 à 5 %, comme on le voit dans les échantillons cellulaires du panneau L dont les propriétés de phase ne sont pas connues.

A priori peut être reconstruit à l’aide de NIQ PMM en conjonction avec une procédure de comparaison d’une image pseudo DIC à une image DIC réelle. N-I-Q-P-M a un paramètre libre. Plan de la pile d’images du champ de droite sur lequel le calcul est centré.

Ce plan focal central doit être ajusté jusqu’à ce que les images pseudo DIC et true DIC se ressemblent le plus. On y trouve une image pseudo DIC floue, une image pseudo DIC optimale et l’image DIC correspondante de la cellule prise avec un AN d’éclairage de 0,9. Il est intéressant de noter que la meilleure carte de phase et l’image pseudo DIC correspondante ne correspondent pas nécessairement à une image en champ clair nette comme le montrent ces panneaux.

Enfin, voici les étapes impliquées dans l’algorithme de traitement d’image H-T-D-I-C du DIC à l’imagerie de mise au point sous un éclairage NA égal à 0,9, la transformée de Hilbert est effectuée pour supprimer le relief de base des images DIC. Cela s’accompagne d’un certain flou le long de l’axe optique qui peut être supprimé du filtrage forer passe-haut. Ces images finales sont facilement segmentées pour déterminer l’aire dans chaque plan de section transversale de l’échantillon afin de déduire le volume cellulaire total.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler l’éclairage correct pour l’imagerie en fond clair ou à contraste différentiel après cette procédure. D’autres méthodes comme la microscopie à fluorescence peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires en utilisant la colocalisation de la force du sol avec les cartes de densité de l’échantillon.