Modélisation d’infection par le Virus de Zika du développement cerveau humain In Vitro à l’aide de cellules souches dérivées cérébrale organoïdes

L’objectif global de cette procédure est de modéliser l’infection par le virus Zika dans le cerveau humain en développement à l’aide d’organoïdes cérébraux dérivés de cellules souches. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie, telles que les cellules capables d’être infectées et les protéines impliquées dans la voie d’infection. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle imite l’infection humaine précoce, peut être utilisée dans des tests à haut débit et peut être combinée avec des techniques génétiques ciblées telles que CRISPR.

Cette méthode peut fournir des informations sur le mécanisme de l’infection à virus zika. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que les dépistages de drogues et le pseudotypage de virus. En utilisant des méthodes régulières d’entretien des cellules souches, amenez les cultures à une confluence comprise entre 50 % et 70 %.

Inspectez les cultures à l’aide d’une microscopie à fond clair à un grossissement de 10 à 20x et assurez-vous que la colonie a une morphologie saine sans différenciation détectable. Amenez le milieu d’entretien des cellules souches libres de xéno à 37 degrés Celsius dans un bain d’eau chaude et décongelez deux millilitres de réactif de détachement enzymatique et un flacon de 50 microlitres de l’inhibiteur de roche à température ambiante. Ensuite, préparez une plaque à 96 puits à fond en U à très faible fixation, une pipette multicanaux p200 et un réservoir de réactif de 25 millilitres.

Ensuite, aliquote 45 millilitres du média dans un tube conique de 50 millilitres. Ajoutez 45 microlitres d’inhibiteur de roche et mélangez soigneusement l’inhibiteur en tritérant le mélange, suivi de deux à quatre dans les versions. Aspirez sous vide deux puits d’une plaque à six puits contenant des cellules souches et ajoutez rapidement un millilitre de réactif de détachement sans enzyme dans chaque puits, puis incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant quatre minutes.

Ensuite, aspirez sous vide les puits traités et ajoutez un millilitre de réactif de détachement enzymatique dans chaque puits. Après une incubation de cinq minutes à 37 degrés Celsius, retirez la plaque de l’incubateur. Tapotez doucement sur la plaque pour briser les cellules agrégées.

Ensuite, inspectez les cellules au microscope. Si de grands amas de cellules sont encore visibles, incubez la plaque pendant deux minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius. Répétez l’étape jusqu’à ce que les grappes ne soient plus visibles à l’œil nu.

Une fois que les cellules sont correctement dissociées, ajoutez un millilitre de milieu d’entretien des cellules souches libres de xéno dans chaque puits, pour désactiver les enzymes de dissociation. Tirez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres et prélevez une petite aliquote pour le comptage des cellules. Pendant la centrifugation, comptez les cellules et déterminez le volume de remise en suspension nécessaire pour atteindre 60 000 cellules par millilitre de suspension.

Retirez soigneusement le surnageant et remettez les cellules en suspension à 60 000 cellules par millilitre dans un milieu contenant l’inhibiteur de roche. À l’aide d’une pipette de cinq millilitres, mélangez doucement les cellules cinq à 10 fois afin d’assurer une suspension cellulaire uniforme. Ajoutez immédiatement la suspension cellulaire dans le réservoir de réactif et utilisez une pipette multicanaux p200 pour transférer 150 microlitres dans chaque puits d’une plaque de 96 puits à fixation ultra basse.

Ensuite, centrifugez la plaque à 150 x G pendant une minute, puis placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Ne pas déranger la plaque pendant 48 heures. À partir du deuxième jour, préparez 17 millilitres de milieu contenant 17 microlitres de l’inhibiteur de roche dans un tube conique de 50 millilitres.

Réchauffez le mélange à 37 degrés Celsius dans un bain d’eau chaude. Prenez la plaque organoïde de l’incubateur et, à l’aide d’une pipette multicanaux p200, prélevez lentement 75 microlitres de fluide sur les bords des puits de la première rangée. Ensuite, expulsez-le rapidement dans le puits pour en retirer les cellules et les organoïdes.

Répétez ce processus de dispersion pour chaque rangée. Attendez 15 secondes pour vous assurer que les organoïdes ont coulé au fond de chaque puits, puis aspirez lentement et soigneusement 75 microlitres de fluide de chaque puits à l’aide de la pipette multicanaux p200 et distribuez-le dans un réservoir à déchets. Ensuite, transférez le milieu contenant l’inhibiteur de roche dans un réservoir de réactif, distribuez 150 microlitres de milieu dans chaque puits organoïde, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius.

Chauffer 17 millilitres de culture fraîche à 37 degrés Celsius, cette fois sans aucun inhibiteur de roche. À l’aide d’une pipette multicanaux p200 réglée à 100 microlitres, répétez le processus de dispersion précédemment montré et attendez 15 secondes pour vous assurer que les organoïdes ont coulé au fond de leurs puits. Ensuite, aspirez soigneusement 125 microlitres de milieu de chaque puits et remplacez-les par 150 microlitres de milieu chauffé.

Placez l’assiette dans l’incubateur à 37 degrés Celsius. Préparez le milieu selon la recette indiquée ici, puis filtrez stérilement la solution mélangée dans un filtre de 500 millilitres. Du quatrième jour jusqu’à ce que les cellules soient infectées vers le 24e jour, effectuez un entretien régulier tous les deux jours à l’aide d’un moyen d’induction neurale.

Une fois filtré, réchauffez 17 millilitres du milieu d’induction neuronale à 37 degrés Celsius et stockez le reste à quatre degrés Celsius. À l’aide d’une pipette multicanaux p200, réglée à 100 microlitres, dispersez tous les puits de la plaque organoïde comme indiqué précédemment. Attendez 15 secondes pour vous assurer que les organoïdes ont coulé au fond de leurs puits.

Aspirez soigneusement 125 microlitres de milieu de chaque puits et remplacez-le par 125 microlitres de milieu d’induction neurale frais. Répétez cet exploit d’induction nerveuse tous les deux jours jusqu’à ce que les organoïdes soient prêts pour l’infection par le virus Zika. Apportez la solution saline équilibrée 1x d’Earle, 1x PBS et le milieu d’induction neurale à 37 degrés Celsius dans un bain d’eau chaude.

Ensuite, diluez le virus Zika d’une concentration connue dans 1 fois la solution d’Earle à la multiplicité cible de l’infection, qui est généralement comprise entre 0,1 et 10. À l’aide d’une pipette p200, retirez soigneusement tout le milieu de chaque puits organoïde. Ensuite, lavez rapidement les organoïdes avec 200 microlitres de 1x PBS réchauffé.

Lors du retrait du milieu de chaque puits, il est essentiel de ne pas toucher l’organoïde ou de ne pas l’aspirer dans la pipette. Cela peut causer des dommages irréparables à l’organoïde. Si cela se produit, il est préférable de jeter l’organoïde.

Ensuite, retirez soigneusement tout le liquide restant de chaque puits organoïde à l’aide d’une pipette p200 monocanal. Ensuite, ajoutez rapidement 50 microlitres de 1 solution d’Earle pour une infection simulée ou de solution de virus Zika dans chaque puits. Assurez-vous que chaque organoïde est complètement immergé une fois terminé, remettez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant deux heures.

Une fois l’exposition virale terminée, lavez chaque puits des organoïdes avec 200 microlitres de PBS. Laissez les organoïdes reposer pendant 15 secondes, puis retirez le PBS à l’aide d’une pipette p200 monocanal. Enfin, ajoutez 200 microlitres de milieu d’induction neurale frais dans chaque puits et remettez la plaque dans l’incubateur.

La coloration avec DAPI, phospho-vimentine, TBR2 et MAP2 peut être combinée pour montrer les structures corticales qui se forment dans les organoïdes. Ces structures comprennent la zone ventriculaire, la zone sous-ventriculaire, la zone intermédiaire et la plaque corticale à l’intérieur de chaque rosette. La culture des organoïdes jusqu’au jour 108 permet d’observer les derniers stades de développement.

Bien que la stratification corticale ne soit pas aussi importante dans ce type d’organoïde, le passage naturel à la gliogenèse se produit un peu comme il le fait in vivo. Trois jours après l’infection par le virus Zika, une différence dans la taille des organoïdes devient visible. L’ampleur de cette différence dépend de la multiplicité virale de l’infection appliquée aux organoïdes.

Cette différence de taille d’organoïdes augmentera au cours de la semaine suivante jusqu’à ce que les organoïdes infectés commencent à se désagréger. Après trois jours, il y aura également une augmentation des débris cellulaires dans les puits infectés par rapport aux puits fictifs. Lors de cette procédure, il est important de suivre des pratiques de laboratoire sûres, car des matières infectieuses viables sont utilisées.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunohistochimie ou l’ARNC peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur la biologie impliquée dans l’infection par le virus Zika du développement neural.