Échantillonnage et traitement du brossage nasal à l’aide de la vidéomicroscopie ciliaire numérique à grande vitesse – Adaptation à la pandémie de COVID-19

L’absence de procédures opératoires officielles publiées et de normalisation empêche la vidéomicroscopie numérique à haute vitesse d’être considérée comme un test de diagnostic de confirmation de la dyskinésie ciliaire primitive. De plus, afin de continuer à fournir un service de diagnostic pendant cette crise du COVID-19, le protocole de vidéomicroscopie ciliaire a été adapté pour inclure des mesures adéquates de contrôle des infections. L’évaluation de la fonction ciliaire à l’aide de la vidéomicroscopie numérique à haute vitesse est très sensible et spécifique pour le diagnostic de dyskinésie ciliaire primaire.

Comparée à d’autres tests diagnostiques primaires de la dyskinésie ciliaire, la vidéomicroscopie numérique à grande vitesse est relativement facile à réaliser, peu coûteuse et les résultats peuvent être disponibles dans la journée. La vidéomicroscopie numérique à grande vitesse a une sensibilité et une spécificité plus élevées pour le diagnostic de dyskinésie ciliaire primaire. À l’heure actuelle, seuls la microscopie électronique et les tests génétiques sont reconnus comme tests de confirmation de la dyskinésie ciliaire primitive, mais ces tests ne permettront pas de diagnostiquer la dyskinésie ciliaire primitive chez 15 à 30 % des patients.

La démonstration de la procédure de brossage nasal sera faite par Lionel Benchimol, un résident ORL de mon laboratoire. Avant de prélever l’échantillon nasal, demandez au patient de se moucher. Après avoir dégagé les voies nasales, faites allonger le patient ou asseyez-le confortablement, la tête reposant vers l’arrière.

Agitez la brosse dans le Medium 199 supplémenté pour l’humidifier et placez un endoscope à l’entrée du nez pour visualiser le cornet nasal inférieur. Insérez la brosse cytologique dans le nez et déplacez la brosse vers l’arrière et l’avant plusieurs fois sur la partie postérieure du cornet nasal inférieur avant de la retirer. Placez la brosse dans un tube de M199.

Coupez le fil de manière à ce qu’il puisse s’insérer complètement à l’intérieur du tube et fermez immédiatement le tube. Ensuite, placez l’échantillon dans un double sac hermétique. Dans les neuf heures suivant le prélèvement de l’échantillon, ouvrez les tubes d’échantillon dans une enceinte de sécurité microbiologique et utilisez une pince nasale Weil-Blakesley pour agiter la brosse afin de déloger les bandelettes épithéliales collectées.

Collez une entretoise double face sur une lame de verre et retirez la protection de l’entretoise. Secouez doucement le tube pour permettre aux cils de se propager dans tout le tube et utilisez une pipette pour transférer environ 60 microlitres d’épithélium cilié du milieu du tube dans l’espaceur. Placez une glissière de recouvrement rectangulaire de 22 x 4 millimètres sur l’entretoise pour fermer la chambre et désinfectez la lame avec de l’éthanol à 70 % avant de la retirer de l’enceinte de sécurité microbiologique.

Après avoir changé de gants, placez cette glissière sur la plaque d’une boîte chauffée et fermez le couvercle. Ajoutez de l’huile dans l’objectif à immersion dans l’huile et placez la boîte sur la platine d’un microscope vertical ou d’un microscope à lumière inversée. Allumez le boîtier et le chauffage de l’objectif, puis ajustez les paramètres de température sur le boîtier et les contrôleurs du chauffage de l’objectif.

Au bout de cinq minutes, positionnez l’objectif jusqu’à ce qu’il touche juste la lamelle avec la pointe de l’objectif. Pour visualiser les bords ciliés respiratoires de l’échantillon, ouvrez le logiciel de la caméra, puis utilisez l’objectif du microscope pour localiser manuellement les cellules dans l’échantillon et pour projeter les cellules sur le moniteur. Vérifiez que l’image est visible sur le moniteur et ajustez le condenseur et la mise au point de l’objectif si nécessaire pour améliorer la qualité de l’image.

Lorsque les bandes d’épithélium cilié ont été localisées, choisissez uniquement des bords épithéliales ciliés intacts et non perturbés qui mesurent au moins 50 microns de longueur. Assurez-vous de n’utiliser que des arêtes normales ou des arêtes avec des projections mineures pour l’analyse fonctionnelle ciliaire et d’exclure les arêtes ciliées avec des projections majeures et les cellules ciliées isolées ou les cellules uniques sans contact entre elles et tout autre type de cellule. Lorsqu’un bon bord a été sélectionné, utilisez une fréquence d’images de 500 images par seconde pour enregistrer le bord des cils battants pendant environ deux secondes.

Après avoir enregistré un minimum de six bonnes arêtes en vue latérale, retirez la diapositive de la boîte chauffée et placez la diapositive, la lamelle et l’entretoise dans un sac hermétique. Ensuite, placez les gants et le masque dans le sac, puis placez le sac dans le conteneur de déchets médicaux dangereux approprié. Pour analyser la fréquence du battement ciliaire, ouvrez l’enregistrement dans un logiciel d’analyse vidéo approprié et divisez les bords ciliés en environ cinq zones adjacentes d’environ 10 microns.

Identifiez et visualisez les cils ou les groupes de cils à une fréquence d’images réduite et un maximum de deux mesures de fréquence de battement ciliaire par zone pour obtenir un maximum de 10 mesures de fréquence de battement ciliaire par bord. Enregistrez le nombre d’images nécessaires pour qu’un groupe de cils effectue cinq cycles de battements et utilisez la formule pour calculer la fréquence des battements ciliaires. Pour déterminer le pourcentage de chaque battement ciliaire distinct dans un échantillon, pour chaque cil ou groupe de cils, comparez le chemin précis emprunté par les cils pendant un cycle de battement complet avec le modèle de battement ciliaire normal observé sur l’analyse par vidéomicroscopie numérique à grande vitesse.

Attribuez un modèle de battement ciliaire distinct, tel que normal, raide, immobile, asynchrone ou dyskinétique et circulaire, à chaque cil ou groupe de cils analysé. Ensuite, calculez le pourcentage de chaque motif de battement ciliaire distinct dans chaque échantillon. Le modèle de battement ciliaire attribué à l’échantillon est le modèle de battement ciliaire prédominant observé.

Ici, nous observons les résultats détaillés de l’analyse fonctionnelle ciliaire à partir des échantillons de brossage nasal de 14 volontaires adultes. Sur ces 14 échantillons de brossage nasal, 242 bords ciliés ont été enregistrés, et 212 répondaient aux critères d’inclusion définis pour l’analyse. Au total, 807 mesures de fréquence de battement ciliaire et d’évaluations de la fréquence du battement ciliaire ont été obtenues à partir des cils ou des groupes de cils analysés.

L’indice d’immotilité moyen était similaire aux valeurs précédemment rapportées observées chez des volontaires sains. Le score de dyskinésie et la fréquence des battements ciliaires étaient similaires aux valeurs précédemment rapportées obtenues en sélectionnant uniquement les bords normaux ou les bords avec une projection mineure. Lorsque des bords de mauvaise qualité sont utilisés, des fréquences de battement ciliaire plus basses et des scores de dyskinésie plus élevés sont rapportés.

Les cellules sanguines et le mucus acquis lors d’un brossage trop robuste peuvent bloquer les battements de cils libres ou cacher les cils à l’observateur. À l’inverse, si la brosse n’appuie pas fermement contre le cornet nasal inférieur, l’échantillon peut ne pas contenir suffisamment de bandelettes épithéliales ciliées de haute qualité. De plus, si le brossage nasal est effectué sur la partie antérieure de la cavité nasale, seules des cellules épithéliales transitionnelles non ciliées seront obtenues.

Les deux aspects les plus importants du protocole sont la qualité du brossage nasal et le choix de fragments épithéliales de haute qualité pour éviter un résultat positif complet ou un échec de la technique.