Méthodologie pour l’Induction de l’expectoration et traitement en laboratoire

La technique des expectorations induites a été développée au début des années 90. La technique a été proposée pour étudier de nouvelles informations sur les maladies obstructives des voies respiratoires comme l’asthme, la BPCO, et plus récemment, il y a eu un intérêt pour examiner de nouvelles informations sur la fibrose pulmonaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est relativement non invasive par rapport à la bronchoscopie.

Le traitement nécessite un travail de laboratoire, et cela prend du temps, donc c’est assez exigeant, cela prend du temps, et il faut avoir une certaine expertise en laboratoire, donc c’est clairement une technique qui est difficile à obtenir dans tous les centres. La technique des expectorations induites est composée de deux parties, la première partie est l’induction et la seconde partie est le traitement. Avant d’induire des expectorations, nous devons effectuer une spirométrie, qui est une évaluation du volume et du débit que le patient est capable de produire.

Et nous devons le faire parce que l’induction des expectorations en elle-même peut provoquer un bronchiospasme, nous devons donc absolument connaître la valeur de base de la spirométrie des patients. Nous effectuons donc d’abord une spirométrie, puis nous donnons aux patients des bronchodilatateurs, nous donnons généralement 400 microgrammes de salbutamol, pour ouvrir au maximum les voies respiratoires des patients, et aussi pour prévenir un bronchiospasme qui peut survenir pendant la phase d’induction. Et au bout de 15 minutes, on mesure à nouveau la spirométrie, pour avoir ce qu’on appelle la valeur de base de la spirométrie, et en particulier on regarde le VEMS qui est le volume que le patient est capable d’expirer en une seconde.

Versez de l’eau distillée dans la chambre du nébuliseur jusqu’au niveau recommandé. Placez une tasse propre dans la chambre du nébuliseur. Couvrez le bouchon rempli avec le couvercle approprié.

Remplissez la tasse avec 50 ml de solution saline hypertonique à 5 % si le VEMS post-bronchodilatateur est supérieur à 65 % prévu, ou 50 ml de solution saline isotonique à 9 % si le VEMS post-bronchodilatateur est inférieur à 65 % prévu. Ajouter une solution de sulfate de salbutamol 1,75 à la concentration de cinq milligrammes par ml dans la tasse. Connectez les tubes et les vannes conformément aux instructions du fabricant.

La technique doit être réalisée sous surveillance médicale. Expliquez le principe du test au patient. Demandez au patient d’utiliser un pince-nez.

Démarrez le nébuliseur et sélectionnez le niveau le plus bas de réglage de l’aérosol et du ventilateur. Demandez au patient d’inhaler l’aérosol par l’embout buccal avec respiration courante. Le niveau de réglage de l’aérosol et du ventilateur peut être augmenté en fonction de la tolérance du patient.

En cas d’oppression thoracique ou d’inconfort respiratoire, arrêtez la procédure et effectuez une spirométrie pour mesurer la valeur FEV1 du patient. Après les cinq minutes d’inspiration, ou en cas de toux ou de nausées, arrêtez le nébuliseur. Demandez au patient d’enlever le pince-nez, de se rincer la bouche et de se gargariser deux fois avec de l’eau du robinet, et de jeter cette eau dans l’évier.

Ensuite, comme le patient de cracher des expectorations et de cracher ce qui sort de la gorge dans un récipient en plastique. Effectuez la première manœuvre respiratoire pour mesurer le VEMS. Après chaque tentative de production d’expectorations, nous mesurons la valeur VEMS.

Si la valeur du VEMS chute de plus de 20 %, nous arrêtons la procédure et nous donnons aux patients une nébulisation du bromure d’ipratropium, qui est un anticholinergique qui agira en combinaison avec les bêta-deux agonistes que nous avons déjà administrés au cours de la procédure. Si la valeur du VEMS ne baisse pas de plus de 20 %, nous poursuivons l’intervention pendant une durée totale de 10 à 20 minutes en fonction de la qualité et du volume d’expectorations produites par le patient. Une fois que vous avez obtenu l’échantillon d’expectoration, conservez-le au réfrigérateur jusqu’au traitement.

La deuxième partie consiste donc en le traitement des expectorations, et pour cela, nous devons d’abord préparer les deux solutions que nous allons utiliser pour ce traitement. Nous devons donc préparer le Dithiothreitol également connu sous le nom de DTT. La solution doit être préparée par dilution du DTT avec de l’eau stérile afin d’obtenir une solution de 6,5 millimolaires.

Il faut donc éviter d’exposer le DTT à l’air ambiant, et pour cela nous utilisons une seringue et une aiguille. Deuxièmement, vous devez préparer la solution de bleu de trypan, et pour cela vous devez faire une dilution de DPBS avec du bleu de trypan, pour obtenir une solution de 0,08 %Donc, en ce qui concerne les expectorations, vous devez transférer l’intégralité des expectorations dans un tube en plastique à fond conique de 50 ml et peser l’échantillon. Ajoutez trois fois le poids de la solution DPBS.

Agiter lentement l’échantillon pendant 30 secondes, centrifuger à 800 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Recueillir le surnageant dans un tube en plastique à fond conique de 50 ml, après filtration à travers deux couches simples de gaze stérile. Répartissez le surnageant dans des tubes en plastique de 2 ml et conservez-le à moins 80 degrés Celsius.

Notez que les échantillons surnageants nous sont utiles en tant que composant triphasé des expectorations. Si le volume de la palette cellulaire est inférieur à 5 ml, ajoutez du DPBS pour atteindre un volume de 5 ml de suspension cellulaire. Diluer la suspension cellulaire avec un volume de DTT à 6,5 millimolaires.

Secouez la suspension cellulaire pendant 20 minutes à température ambiante avec un paillasson. Diluez la suspension cellulaire au moins trois fois avec du DPBS. Centrifuger la suspension cellulaire diluée à 550 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant. Suspendez la palette de cellules dans environ un ml DPBS. Évaluez et enregistrez le volume exact de la suspension cellulaire.

Ajouter 50 microlitres de suspension cellulaire à 50 microlitres de solution de bleu de trypan dilué et homogénéiser. Placez l’échantillon sous la lamelle d’un cytomètre d’hémocile et placez-le sous un microscope optique. Évaluez la concentration cellulaire de la suspension cellulaire, le pourcentage de cellules squameuses et le pourcentage de viabilité des cellules non squameuses.

Diluer une allocation de la suspension avec du DPBS pour obtenir au moins 350 microlitres de suspension cellulaire à 500 000 cellules par ml. Assemblez le concentrateur de cellules conformément aux instructions du fabricant. Ajoutez 100 microlitres de suspension cellulaire dans chacun des trois compartiments du concentrateur de cellules.

Essorer deux minutes à 150 g à température ambiante dans une centrifugeuse cyto. Jetez le surnageant. Laissez la diapositive sécher à l’air.

Teindre la glissière avec du div quick ou un kit de teinture de valence nickel conformément aux instructions du fabricant. Montage avec un support de montage et une lamelle. Placez la lame sous le microscope optique avec immersions dans l’huile.

Comptez au moins 500 cellules non squameuses, les neutrophiles, les éosinophiles, les macrophages, les lymphocytes et les cellules épithéliales, et notez les valeurs absolues, le pourcentage et le type de cellule. Concernant les résultats, à l’aide de l’hémocytomètre, il faut compter les cellules vivantes non squameuses qui ne sont pas colorées. Aussi, les cellules mortes non squameuses qui sont colorées en bleu.

Et les cellules squameuses. Ces cellules sont des cellules épithéliales qui proviennent de la bouche. Ils sont grands, ils sont donc faciles à reconnaître par rapport aux petites cellules humaines.

Il faut donc éviter également de compter les bactéries, les levures ou les déchets. Si la suspension cellulaire contient plus de 80 % de cellules squameuses, cet échantillon est considéré comme de mauvaise qualité et inadapté à une lame de cytospin. Cet échantillon est donc considéré comme infructueux.

Le comptage sur le cytospin coloré est effectué en fonction de la couleur des cellules et de leur morphologie. Les neutrophiles, la caractéristique principale est le noyau multilobé qui rend les cellules faciles à identifier. Ces cellules sont rondes, petites et colorées en rose neutre.

Les éosinophiles, ces cellules sont composées de granules rouges, faciles à identifier. La taille de ces cellules est proche des neutrophiles. Les macrophages, ils sont deux à cinq fois plus gros que les neutrophiles, et sont colorés en bleu.

Le cytoplasme peut contenir des débris et des vacuoles. Les lymphocytes, ces cellules sont rondes et petites, colorées en bleu, et possèdent un noyau grand et dense. Les cellules de l’épithélium ont une forme cylindrique, sont colorées en rose et présentent souvent des cils au sommet.

Voici quelques exemples d’échantillons de cytospin illisibles avec plus de 80 % de cellules squameuses. Je pense que c’est une technique qui est très utile, mais il faut être très prudent car l’induction des expectorations doit se faire sous surveillance médicale, mais la technique de l’induction des expectorations vous donne beaucoup d’informations sur l’état inflammatoire des patients dans les voies respiratoires. Il peut vous permettre de mesurer différents marqueurs biochimiques dans le surnageant, et vous pouvez également mesurer différentes choses sur les parties cellulaires, de sorte que les expectorations induites vous permettent d’effectuer de la cytométrie en flux, de la protéomique, de la transcriptomique et même de la génomique.