Traitement du tissu cardiaque humain vers la matrice extracellulaire auto-assemblage Hydrogel pour In Vitro et In Vivo des Applications

L’objectif global de cette procédure est de transformer la matrice extracellulaire cardiaque en un hydrogel, ce qui permet d’étudier l’effet de la matrice dans divers tests cellulaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine cardiaque, telles que la façon dont la matrice extracellulaire affecte le comportement cellulaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle facilite l’utilisation de la matrice extracellulaire pour réaliser des expériences à grande échelle in vitro ou in vivo.

Les applications de cette technique peuvent être étendues à une thérapie de l’infarctus du myocarde, car la matrice peut fournir des indices de survie essentiels. Pour commencer l’expérience, utilisez un scalpel stérile avec une lame numéro dix, pour retirer le tissu adipeux d’un myocarde ventriculaire gauche précédemment obtenu. Coupez le myocarde en cubes d’environ 1 x 1 cm sur 1 cm, à l’aide d’un scalpel.

Ensuite, placez les cubes dans un tube stérile de 50 ml. Conservez les tubes contenant les cubes à 80 degrés Celsius. Sortez le tube contenant les cubes préparés du congélateur et transportez-le sur de la glace jusqu’au cryostat.

Réglez la température de l’objet et de la chambre du cryostat à 15 degrés Celsius. Réfrigérer les tubes vides de 50 ml et les tampons dans la chambre. Ajoutez une couche de milieu de cryosection sur le tampon à froid et laissez-le geler jusqu’à ce qu’il soit blanc et solide.

Ajoutez une deuxième couche de milieu de cryosection et placez un tube de myocarde dans la deuxième couche. Assurez-vous que le milieu de cryosection et le myocarde sont complètement congelés. Ensuite, insérez le tampon avec du myocarde congelé dans le support et serrez toutes les vis.

Coupez la surface du tissu jusqu’à l’obtention d’une surface de section uniforme. Sectionnez le myocarde congelé avec sectionnement automatique pour garantir des sections de coupe uniformes. Environ 30 à 40 sections peuvent être tranchées à partir d’un cube.

Placer chaque tranche, après l’avoir sectionnée, sans serrer dans un tube de 50 ml prérefroidi. Fermez les tubes remplis et placez-les sur de la glace. Transférez les sections congelées de tous les tubes de 50 ml dans un bécher stérile.

Ajouter 50 ml de solution de lyse par tube de 50 ml contenant des tranches de myocarde. Ensuite, secouez les tranches de myocarde dans un bécher stérile. Filtrez le liquide avec les tranches de tissu à travers une passoire grossière.

Ensuite, transférez les tranches de tissu à l’aide d’une pince à épiler émoussée dans un nouveau bécher stérile. Ajouter 50 mL de SDS à 0,5 % dans du PBS par tube initial de 50 mL de tranches de myocarde. Agitez le bécher en continu pendant six heures à 100-150 tr/min à température ambiante.

Après avoir secoué, filtrez le liquide avec les tranches de mouchoirs à travers une passoire grossière. À l’aide d’une pince à épiler, transférez les tranches de mouchoirs dans un nouveau bécher stérile et lavez-les trois fois avec 50 ml de PBS. Ensuite, lavez les tranches pendant la nuit dans du PBS, avec 1 % de pénicilline streptomycine et 1 % de nystatine.

Le lendemain, retirez la solution de lavage et ajoutez 25 ml de FBS préchauffé à 37 degrés Celsius avec 1 % de pénicilline streptomycine et 1 % de nystatine, aux tranches décellularisées par tube initial de 50 ml de tranches de myocarde. Incuber les tranches pendant trois heures à 37 degrés Celsius pour éliminer tout ADN restant de la matrice. Ensuite, transférez les tranches dans un nouveau bécher stérile et lavez-les trois fois avec 50 ml de PBS.

Placez les tranches ECM sans serrer dans une nouvelle plaque stérile à six puits. Congelez l’ECM à 80 degrés Celsius et lyophilisez-le pendant deux jours dans un lyophilisation. Pour la pulvérisation de la tranche ECM, utilisez des tubes de broyage contenant des billes de céramique de 1,4 mm.

Remplissez les tubes sans serrer avec de l’ECM lyophilisée, à l’aide d’une pince à épiler stérile et émoussée. Congelez rapidement les tubes dans de l’azote liquide. Insérez les tubes congelés dans la fraiseuse et pulvérisez l’ECM.

Réglez la durée sur 30 secondes, ajustez la vitesse maximale et démarrez l’appareil. Après la pulvérisation, sortez les tubes et congelez-les à nouveau dans de l’azote liquide. Lavez les microparticules des tubes, en ajoutant 1 mL de ddH20 par tube, et agitez pour une solubilisation complète.

Ensuite, filtrez la solution hétérogène à travers une maille de 200 micromètres, dans un tube de 50 ml. Congelez le tube dans de l’azote liquide. Remplacez le couvercle standard du tube par un filtre de 0,22 micromètre pour empêcher la poudre de s’écouler du tube.

Insérez le tube dans le lyophilisateur et lyophilisez à nouveau pour éliminer l’eau de l’étape de lavage. Dissoudre la poudre de MEC humaine lyophilisée préalablement préparée dans une solution de pepsine, jusqu’à une concentration finale de 10 mg par mL. Transférez la solution dans des tubes de 2 mL d’un volume de 1 mL par tube.

Pipetez la solution pour bien mélanger. Ensuite, placez les tubes dans l’agitateur et secouez à 1200 tr/min pendant 48 heures à 27 degrés Celsius. Sortez les tubes du shaker et placez-les sur de la glace ou un support de tube pré-refroidi.

Mélangez 1/9 du volume de la solution ECM de PBS 10X froid, avec 1/10 du volume d’une solution ECM d’hydroxyde de sodium 0,1 molaire froid, dans un tube pré-refroidi et placez-le sur de la glace pour neutraliser la solution ECM digérée et inactiver la pepsine. Enfin, ajoutez la solution ECM au mélange de neutralisation et mélangez soigneusement par pipetage ou vortex. Des tests quantitatifs pour des composants ECM individuels ont révélé une élimination plus complète de l’ADN et une meilleure conservation du collagène total, de l’élastine et des glycosominoglycanes par rapport à la décellularisation par SDS seul.

La RT-PCR a été utilisée pour quantifier l’expression des protéines structurelles de la cardiomyocite, des facteurs de transcription cardiomyogéniques précoces et tardifs et des gènes marqueurs de surface des cellules endothéliales dans l’ESC murin, subissant une différenciation spontanée. Le contact avec la cECM entraîne les cellules souches pluripotentes, de préférence vers un phénotype semblable à celui du cardiomyocite. La microscopie optique à contraste de phase démontre que la digestion enzymatique de la CEM pendant 48 heures permet d’obtenir une solution de MEC plus homogénéisée.

La coloration vivante/morte des fibroblastes cardiaques humains sur l’hydrogel cECM montre une viabilité accrue. Les microparticules cECM et l’hydrogel cECM améliorent l’activité métabolique des cellules HL-1 contractiles, dans des conditions ischémiques, par rapport aux cellules en culture standard. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine du tissu à l’hydrogel, si elle est correctement exécutée.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la régénération cardiaque, pour explorer les effets de la matrice extracellulaire cardiaque, in vitro et in vivo, des systèmes modèles.