Name: Traitement du tissu cardiaque humain vers la matrice extracellulaire auto-assemblage Hydrogel pour In Vitro et In Vivo des Applications (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Découvrez la décellularisation du myocarde humain pour produire un hydrogel de matrice extracellulaire auto-assemblant. Cette méthode permet d'étudier le comportement cellulaire et de développer des applications thérapeutiques pour l'infarctus du myocarde.

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Le protocole de l’étude respecte les principes éthiques énoncés dans la déclaration d’Helsinki. Les patients fourni un consentement éclairé pour l’utilisation du tissu à des fins de recherche, et le processus de prélèvement tissulaire a été approuvé par l’Institutional Review Board et le Comité d’éthique de la Charité - Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12).

Le protocole de l’étude respecte les principes éthiques énoncés dans la déclaration d’Helsinki et a été approuvé par le Comité de Conseil et de l’éthique d’étude institutionnelle de l’Université de médecine Charité. Tous les patients fournis écrit, un consentement éclairé pour l’utilisation du tissu cardiaque dans les études expérimentales.
1. préparation du myocarde humain pour le sectionnement
<ol><li>Obtenir le myocarde ventriculaire gauche (la taille varie selon le type de chirurgie) directement à partir de la salle d’opération et le transport en froid PBS dans un récipient stérile.</li>
	<li>Enlever tous les tissus adipeux avec un scalpel stérile avec une lame n° 10 dans des conditions stériles.</li>
	<li>Couper le myocarde en cubes d’environ 1 x 1 x 1 cm à l’aide d’un scalpel.</li>
	<li>Placez les cubes dans des tubes stériles 50 mL. Remarque : Pour mettre en pause, effectuez l’étape 1.5, sinon passez à l’étape 2.2. Éviter les cycles de gel-dégel répétés afin d’éviter la dégradation des protéines et une diminution de la qualité du tissu.</li>
	<li>Stocker les tubes contenant les cubes à-80 ° C. Le tissu peut être conservé pendant plusieurs mois.</li>
</ol>2. séparer les cubes du myocarde en tranches
<ol><li>Prendre les tubes contenant les glaçons préparés sortis du congélateur.</li>
	<li>Transport sur glace pour le cryostat.</li>
	<li>Régler la température de la salle et l’objet à-15 ° C. NOTE : La bonne température est cruciale pour garantir une coupe parfaite.</li>
	<li>Tubes de refroidissement vide 50 mL et timbres dans la chambre ou sur la glace sèche.</li>
	<li>Ajouter une couche (environ 0,5 - 1,0 mL) du milieu de la cryosection sur le timbre froid et laissez le congeler jusqu'à ce qu’il est blanc et solide.</li>
	<li>Ajouter une deuxième couche de médium cryosection et placez un cube de myocarde sur cette couche.</li>
	<li>Assurez-vous que le support de cryosection et le myocarde sont complètement gelée avant de continuer. Remarque : Lorsque le support de l’échantillon et cryosection ne sont pas gelés le sectionnement sera affectée. Cryosection complètement gelé moyen passe du fluide et transparente au solide, blanc et opaque. Les cubes myocardiques besoin d’au moins 30 min, jusqu'à 1 h pour geler complètement si continuer immédiatement à l’étape 1.4. Lorsque le tissu est gelé il ne devrait pas déformer quand touché/manipulés avec des pincettes.</li>
	<li>Insérez le timbre avec myocarde congelé dans le support et serrer toutes les vis.</li>
	<li>Couper la surface du tissu jusqu'à l’obtention d’une surface de même section.</li>
	<li>Définir l’épaisseur à 300 µm de sectionnement.</li>
	<li>Section le myocarde congelé avec sectionnement automatique. Cela garantit des sections coupées uniformes. Environ 30-40 sections peuvent être tranchées d’un cube.</li>
	<li>Placez chaque tranche après lamélisation lâchement dans un tube rafraîchies 50 mL. Remarque : N’appuyez pas sur les tranches ou les pack étroitement. Environ 40 tranches peuvent s’insérer dans un tube.</li>
	<li>Fermer les tubes remplis et la placer sur la glace. Remarque : Pour mettre en pause aller sur avec étape 2.14, sinon passez à l’étape 3.2.</li>
	<li>Tranches de myocarde magasin à-80 ° C. Les tranches peuvent être stockés pendant plusieurs mois.</li>
</ol>3. DÉCELLULARISATION de tranches de myocarde humain
<ol><li>Prenez le nombre nécessaire de tubes de 50 mL contenant des sections de myocarde hors du congélateur-80 ° C et le transport sur la glace.</li>
	<li>Transférer les coupes congelées de tous les tubes de 50 mL d’étape 3.1 dans un bécher stérile. Environ 40 tranches sont ajoutés dans le bécher par tube de 50 mL. Le bol doit être trois fois le volume des tubes 50 mL ; par exemple, pour DÉCELLULARISATION d’un tube de 50 mL, utilisez un bécher de 150 mL.</li>
	<li>Ajouter 50 mL de solution de lyse (10 mM Tris, 0,1 % p/v EDTA, pH 7,4 en H2O) par le tube de 50 mL avec des tranches de myocarde.</li>
	<li>Secouez les tranches du myocarde dans un bécher stérile à 100-150 tr/min en continu pendant 2 h à température ambiante.</li>
	<li>Filtrer le liquide avec les tranches de tissus à travers un tamis grossier. Transférer les tranches de tissus avec une pince émoussée dans un bécher stérile de nouveau. Ajouter 50 mL de la SDD de 0,5 % dans du PBS par tube initial de 50 mL de tranches de myocarde (p. ex., utilisation solution 100 mL SDS lorsque deux tubes de 50 mL de sections myocardiques sont étant DECELLULARISE).</li>
	<li>Agitez continuellement pendant 6 h à 100-150 tr/min à température ambiante.</li>
	<li>Filtrer le liquide avec les tranches de tissus à travers un tamis grossier. Transférer les tranches de tissus avec une pince émoussée dans un bécher stérile nouvel et laver 3 fois avec 50 mL de PBS pendant 10 min chaque et en agitant à 150 tr/min. Ensuite, lavez toute la nuit dans du PBS 1 % pénicilline/streptomycine et 1 % à 100-150 tr/min et 4 ° C en agitant la nystatine (PBS-P/S-N). NOTE : Lavage complet est crucial afin d’éliminer complètement toute SDS résiduel. Les traces restantes de la SDD sont toxiques lorsque l’ECM est utilisée en combinaison avec les cellules.</li>
	<li>Enlever la solution de lavage et ajouter 25 mL préchauffé FBS (37 ° C) avec 1 % pénicilline/streptomycine et 1 % Nystatin pour les tranches DECELLULARISE par tube initial de 50 mL de tranches de myocarde.</li>
	<li>Incuber pendant 3 h à 37 ° C. Dans cette étape, aucun ADN restant est supprimée de la matrice en raison de l’activité DNase intrinsèque de la FBS.</li>
	<li>Transférer les tranches dans un bécher stérile nouvel et laver 3 fois avec 50 mL de PBS de 10 min chacun et en agitant à 150 tr/min. Remarque : Les tranches de ECM peuvent être stockés dans le PBS-P/S-N à 4 ° C pendant plusieurs jours. Toutefois, il est recommandé de procéder immédiatement.</li>
</ol>4. traitement de la cECM Decellularized en poudre
<ol><li>Déposer les tranches de ECM vaguement dans une nouvelle plaque 6 puits stérile. Geler l’ECM à-80 ° C et lyophiliser pour 2 jours dans un lyophilisateur. Remarque : plus d’une tranche peut être placée par puits. Disposer les tranches pour recouvrir entièrement la surface du puits. Chevauchant les tranches n’affecte pas la réussite ultérieure de pulvérisation.</li>
	<li>Pour la pulvérisation de la tranche de l’ECM, le fraisage spécifiques d’utilisation tubes (voir Table des matières) contenant perles en céramique de 1,4 mm. Remplir les tubes souplement avec lyophilisée ECM à l’aide de pincettes émoussé stérile. Pour des résultats optimaux, un poids total de ECM entre 10-20 mg est recommandé. Remarque : Si l’ECM est trop étroitement emballée dans les tubes de fraisage le processus de pulvérisation sera négativement affecté.</li>
	<li>Clin d’oeil-gel les tubes dans l’azote liquide. Avertissement: l’azote liquide est très basse température, porter une protection personnelle appropriée.</li>
	<li>
Insérer les tubes congelés dans la fraiseuse et pulvériser l’ECM.
	<ol>
<li>Définir une durée de 30 s et un maximum de vitesse et démarrer l’appareil.</li>
		<li>Après avoir terminé, retirez les tubes et nouveau clin d’oeil-congélation dans l’azote liquide.</li>
		<li>Répéter cinq fois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laver les microparticules des tubes en ajoutant 1 mL FD2O par le tube et agiter ou vortex pour solubilisation complète. Filtrer la solution hétérogène au travers d’une maille de 200 µm dans un tube de 50 mL.</li>
	<li>Congeler le tube dans l’azote liquide ou de-80 ° C.</li>
	<li>Replacez le couvercle standard du tube avec un filtre de 0,22 µm. Ce couvercle de filtre empêche la poudre ne s’écoule hors du tube, mais permet une circulation d’air pour l’évaporation de l’eau.</li>
	<li>Insérer les tubes dans le lyophilisateur et lyophiliser à nouveau pour retirer l’eau de l’étape (étape 4.5) Remarque : La lyophilisation à cette étape peut prendre jusqu'à 3 jours.</li>
	<li>Stocker la poudre à-80 ° C jusqu'à ce que la poursuite de la procédure ou continuez au point 5.1.</li>
</ol>5. enzyme basé accolés de cECM micro-particules
<ol><li>Dissoudre la pepsine porcine à 0,01 M HCl (pH 2,0) à une concentration de 1 mg/mL. Placer sur un agitateur rotatif à température ambiante jusqu'à ce qu’il soit complètement dissous.</li>
	<li>Dissoudre la poudre lyophilisée de l’ECM humaine (étape 4.8) dans la solution de pepsine à une concentration finale de 10 mg/mL. Mélanger soigneusement par le biais de pipetage. Le volume total dépend de la quantité de solution ECM nécessaire. Par exemple, dissoudre 10 mg de poudre de l’ECM dans 1 mL de solution de pepsine. NOTE : Dissoudre les particules peut être soutenu par agitation douce (1 000-1 500 tr/min). Restant des grumeaux de microparticules affectera négativement la digestion.</li>
	<li>Transvaser la solution dans les tubes de 2 mL avec un volume de 1 mL par tube.</li>
	<li>Placer les tubes dans un shaker de tube pendant 48 h à 27 ° C et 1 200 tr/min.</li>
	<li>Retirer les tubes de l’agitateur et placer sur glace ou un tube préalablement refroidi.</li>
	<li>Mélange 1/9 du volume de la solution ECM de froid 10 x PBS (pH 7,4) avec 1/10 du volume de la solution ECM de froid 0,1 M NaOH dans un tube rafraîchie et la place sur la glace. Ce mélange va neutraliser la solution ECM digérée et inactiver irréversiblement la pepsine.</li>
	<li>Ajouter la solution ECM au mélange de neutralisation et mélanger soigneusement grâce à la pipette ou l’agitation.</li>
	<li>L’ECM de la valeur de la concentration désirée avec 1 x PBS (pH 7,4). Le pH de la solution peut être vérifié avec papier pH. Remarque : Exemple de calcul pour 10 mL digéré solution ECM : Ajouter la pepsine porcine 10 mg pour 10 mL de HCl (pH 2,0). Ajouter 100 mg ECM poudre pour solution de pepsine. Remarque : Exemple de calcul pour la neutralisation des 10 mL digéré solution ECM et en réglant la concentration de 8 mg/mL : Le volFinal = ccommencer x VolDémarrer / cFinal = 10 mg / mL x 10 mL / 8 mg/mL = 12,5 mL Vol10xPBS = VolDémarrer / 9 = 1/9 de PBS 10 x 10 mL = 1,11 mL Vol deNaOH = VolDémarrer / 10 = 1/10 de 10 mL = 1 mL Vol1xPBS = Vol VolFinal - Volcommencer -10xPBS - VolNaOH = 12,5 mL - 10 mL-.11 et 1 mL = 0,39 mL</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Lors de la préparation humaine ECM myocardique, l’objectif est de réaliser ce qui suit : enlèvement du matériel cellulaire immunogène pertinent, préservation de l’intégrité de l’ECM et la bioactivité, stérilité, absence de toxicité du produit fini, compatibilité GMP-process, et qualités du produit pour une application donnée en termes de manipulation. En combinant notre protocole DÉCELLULARISATION 3 étapes avec un traitement ultérieur dans des microparticules ou hydrogel auto-assemblage, matériel d’ECM cardiaque humain q...

La matrice extracellulaire (ECM) fournit non seulement structurelle soutenir mais est également importante pour la cellule biologique et tissu int1. Dans le coeur, l’ECM participe à la régulation des réponses physiopathologiques comme la fibrose, inflammation, angiogenèse, cardiomyocyte fonction contractile et viabilité et sort de cellules progénitrices résident. En plus de ses principaux composants - glycoprotéines fibreuses, glycosaminoglycanes et protéoglycanes - il contient une foule de facteurs de croissance sécrétés, cytokines et vésicules membraneux contenant des acides nucléiques et protéines2,3.
Récemment, il est devenu clair que les préparations d’ECM acellulaires ne sont pas seulement inestimables pour l’étude des interactions cellule-matrice, mais aussi pour des applications thérapeutiques potentielles basés sur les cellules. L’importance d’offrir un environnement adapté aux produits thérapeutiques cellulaires ou tissus ingénieries est maintenant largement reconnu. Ont tenté de combiner des suspensions cellulaires ou des composés actifs avec des hydrogels biopolymères défini4,5,6 ou avec des cocktails de protéines sécrétées par les cellules de sarcome murin (c.-à-d., Matrigel, Geltrex) 7. Toutefois, les anciens ont limité bioactivité, ces derniers sont problématiques dans les processus de qualité GMP, et tous deux n’ont pas la bioactivité spécifique des tissus cardiaques ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.
DÉCELLULARISATION du myocarde a précédemment été interprétée par perfusion du cœur tout via le système vasculaire coronaire14,15. Tout cela est possible dans le cœur animal, des cœurs humains intacts sont rarement disponibles. Par conséquent, un processus d’immersion qui permet pour la manipulation des échantillons de tissus obtenus dans la salle d’opération a été favorisé. Notre protocole de « 3-step » contient 3 separate incubation étapes à savoir lyse, solubilisation et l’enlèvement de l’ADN. Il donne humain ECM myocardique avec en grande partie préservé protéine et glycosaminoglycanes composition16,17. Ces tranches de cECM permettent des études in vitro des interactions cellule-matrice, mais sont mal adaptés pour des applications thérapeutiques potentielles de taille humaine. Le procédé de fabrication a été étendu ensuite pour produire des microparticules de cECM lyophilisée ou un hydrogel de cECM18.
Ce protocole permet la DÉCELLULARISATION du myocarde humain obtenu à partir des échantillons chirurgicales, préservant les principales composantes de la matrice extracellulaire (ECM) myocardique et leur activité biologique. Ce protocole est recommandé lorsque l’humain ECM cardiaque avec conserve bioactivité de tissu-spécifique est requis pour l’étude expérimentale des interactions cellule-matrice, ou lorsqu’un environnement adéquat est nécessaire pour des approches basées sur les cellules myocardiques régénération. En principe, il est également possible d’adapter ce protocole se rapportant à des conditions de qualité GMP, afin que l’utilisation de la cECM transformé devrait être faisables applications thérapeutiques à l’avenir.

<table><tbody><tr><td>Balance</td><td>DR Precisa, Dietikon, Suisse</td><td>Precisa XR 205SM</td><td></td></tr><tr><td>Lames Nr.10 Skalpell Nr.3</td><td>InstrumenteNRW, Erftstadt, Allemagne</td><td>SK-10-004</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire (6 puits)</td><td>Greiner, Frickenhausen, Allemagne</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat CM Leica</td><td>, Wetzlar, Allemagne</td><td>3050S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>8043.3</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à réaction Eppendorf (1,5 ou 2 ml)</td><td>Greiner, Frickenhausen, Allemagne</td><td>616201, 623201</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15ml, 50ml</td><td>Greiner, Frickenhausen, Allemagne</td><td>188271, 227270</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Biochrome, Berlin, Allemagne</td><td>S 0115</td><td></td></tr><tr><td>Système de lyophilisation</td><td>Labconco, Kansas City, États-Unis</td><td>7670520</td><td></td></tr><tr><td>Congélateur (-80&deg ; C)</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, États-Unis</td><td>Forma 900 Series</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>281.1</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microtome Type 819</td><td>Leica, Wetzlar, Allemagne</td><td>14035838925</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur Minilys</td><td>PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Allemagne</td><td>91-PCSM</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>K021.1</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>PAN Biotech, Aidenbach, Allemagne</td><td>P06-07800</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Allemagne</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne</td><td>P6887-1G</td><td></td></tr><tr><td>Precellys Keramik-Kit 1,4 mm</td><td>Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Allemagne</td><td>91-PCS-CK14</td><td></td></tr><tr><td>Rotamax 120 Agitateur de plaques</td><td>Heidolph, Schwabach, Allemagne</td><td>544-41200-00</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>CN30.3</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica, Wetzlar, Allemagne</td><td>M125</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP, 0,22 &micro ; m</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Allemagne</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Stuart mélangeurs analogiques à bascule et à rouleaux</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne</td><td>Z675113-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek O.C.T compound</td><td>Hartenstein, Würzburg, Allemagne</td><td>Kit</td> de transfusion TTEK <td></td></tr><tr><td>200&micro ; épousa</td><td>Sarstedt, N&uuml ; mbrecht, Allemagne</td><td>798.200.500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>5429.3</td><td></td></tr><tr><td>vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm</td><td>Points forts médicaux, Rohrdorf, Allemagne</td><td>CV102-003</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie2</td><td>Scientific Industry, New York, États-Unis</td><td>SI-0256</td><td></td></tr></tbody></table>

traitement du tissu cardiaque humain vers la matrice extracellulaire auto-assemblage hydrogel pour in vitro et in vivo des applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Préparations de la matrice extracellulaire acellulaire sont utiles pour étudier les interactions cellule-matrice et facilitent les demandes de thérapie régénératrice des cellules. Plusieurs produits commerciaux de la matrice extracellulaire sont disponibles comme les hydrogels ou membranes, mais ceux-ci ne possèdent pas d’activité biologique spécifique des tissus. Car DÉCELLULARISATION de perfusion n’est habituellement pas possible avec les tissus du coeur humain, nous avons développé un procédé de DÉCELLULARISATION d’immersion 3 étapes. Humaines tranches myocardiques achetés au cours de la chirurgie sont d’abord traitées avec tampon de lyse hyperosmolaire sans tensioactifs, suivie d’une incubation avec l’ionique détergent, dodécyl sulfate de sodium, et le processus s’achève en exploitant l’activité DNase intrinsèque des sérum de veau fœtal. Cette technique aboutit à feuilles acellulaire de matrice extracellulaire cardiaque avec en grande partie préservée composition d’architecture et des biopolymères de tissu fibreux, qui apparaissaient pour offrir des repères écologiques spécifiques aux populations de cellules cardiaques et souches pluripotentes cellules. Feuilles de matrice extracellulaire cardiaque peuvent ensuite être encore transformés en une poudre de microparticules sans modification supplémentaire chimique, ou, via la digestion pepsique à court terme, dans un hydrogel auto-assemblage de matrice extracellulaire cardiaque avec conservés bioactivité.

Le protocole 3 étapes pour DÉCELLULARISATION du myocarde humain présenté ici résultats dans l’élimination presque complète du matériel cellulaire, tout en préservant les principales composantes de l’ECM et la structure fibrillaire d’ECM. Après DÉCELLULARISATION, le brut prélèvement de cellules du tissu est évident par le changement de couleur (Figure 1 a). L’analyse histologique avec des taches de H &amp; E et Trichrome de Masson a révélé l’absence totale de ...

Ce protocole décrit la DÉCELLULARISATION complete du myocarde humaine tout en préservant ses constituants de la matrice extracellulaire. Traitement ultérieur des résultats dans la production de microparticules et un hydrogel auto-assemblage cytoprotecteurs matrice extracellulaire.

Traitement du tissu cardiaque humain vers la matrice extracellulaire auto-assemblage Hydrogel pour In Vitro et In Vivo des Applications

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

L’objectif global de cette procédure est de transformer la matrice extracellulaire cardiaque en un hydrogel, ce qui permet d’étudier l’effet de la matrice dans divers tests cellulaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine cardiaque, telles que la façon dont la matrice extracellulaire affecte le comportement cellulaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle facilite l’utilisation de la matrice extracellulaire pour réaliser des expériences à grande échelle in vitro ou in vivo.Les applications de cette technique peuvent être étendues à une thérapie de l’infarctus du myocarde, car la matrice peut fournir des indices de survie essentiels. Pour commencer l’expérience, utilisez un scalpel stérile avec une lame numéro dix, pour retirer le tissu adipeux d’un myocarde ventriculaire gauche précédemment obtenu. Coupez le myocarde en cubes d’environ 1 x 1 cm sur 1 cm, à l’aide d’un scalpel.Ensuite, placez les cubes dans un tube stérile de 50 ml. Conservez les tubes contenant les cubes à 80 degrés Celsius. Sortez le tube contenant les cubes préparés du congélateur et transportez-le sur de la glace jusqu’au cryostat.Réglez la température de l’objet et de la chambre du cryostat à 15 degrés Celsius. Réfrigérer les tubes vides de 50 ml et les tampons dans la chambre. Ajoutez une couche de milieu de cryosection sur le tampon à froid et laissez-le geler jusqu’à ce qu’il soit blanc et solide.Ajoutez une deuxième couche de milieu de cryosection et placez un tube de myocarde dans la deuxième couche. Assurez-vous que le milieu de cryosection et le myocarde sont complètement congelés. Ensuite, insérez le tampon avec du myocarde congelé dans le support et serrez toutes les vis.Coupez la surface du tissu jusqu’à l’obtention d’une surface de section uniforme. Sectionnez le myocarde congelé avec sectionnement automatique pour garantir des sections de coupe uniformes. Environ 30 à 40 sections peuvent être tranchées à partir d’un cube.Placer chaque tranche, après l’avoir sectionnée, sans serrer dans un tube de 50 ml prérefroidi. Fermez les tubes remplis et placez-les sur de la glace. Transférez les sections congelées de tous les tubes de 50 ml dans un bécher stérile.Ajouter 50 ml de solution de lyse par tube de 50 ml contenant des tranches de myocarde. Ensuite, secouez les tranches de myocarde dans un bécher stérile. Filtrez le liquide avec les tranches de tissu à travers une passoire grossière.Ensuite, transférez les tranches de tissu à l’aide d’une pince à épiler émoussée dans un nouveau bécher stérile. Ajouter 50 mL de SDS à 0,5 % dans du PBS par tube initial de 50 mL de tranches de myocarde. Agitez le bécher en continu pendant six heures à 100-150 tr/min à température ambiante.Après avoir secoué, filtrez le liquide avec les tranches de mouchoirs à travers une passoire grossière. À l’aide d’une pince à épiler, transférez les tranches de mouchoirs dans un nouveau bécher stérile et lavez-les trois fois avec 50 ml de PBS. Ensuite, lavez les tranches pendant la nuit dans du PBS, avec 1 % de pénicilline streptomycine et 1 % de nystatine.Le lendemain, retirez la solution de lavage et ajoutez 25 ml de FBS préchauffé à 37 degrés Celsius avec 1 % de pénicilline streptomycine et 1 % de nystatine, aux tranches décellularisées par tube initial de 50 ml de tranches de myocarde. Incuber les tranches pendant trois heures à 37 degrés Celsius pour éliminer tout ADN restant de la matrice. Ensuite, transférez les tranches dans un nouveau bécher stérile et lavez-les trois fois avec 50 ml de PBS.Placez les tranches ECM sans serrer dans une nouvelle plaque stérile à six puits. Congelez l’ECM à 80 degrés Celsius et lyophilisez-le pendant deux jours dans un lyophilisation. Pour la pulvérisation de la tranche ECM, utilisez des tubes de broyage contenant des billes de céramique de 1,4 mm.Remplissez les tubes sans serrer avec de l’ECM lyophilisée, à l’aide d’une pince à épiler stérile et émoussée. Congelez rapidement les tubes dans de l’azote liquide. Insérez les tubes congelés dans la fraiseuse et pulvérisez l’ECM.Réglez la durée sur 30 secondes, ajustez la vitesse maximale et démarrez l’appareil. Après la pulvérisation, sortez les tubes et congelez-les à nouveau dans de l’azote liquide. Lavez les microparticules des tubes, en ajoutant 1 mL de ddH20 par tube, et agitez pour une solubilisation complète.Ensuite, filtrez la solution hétérogène à travers une maille de 200 micromètres, dans un tube de 50 ml. Congelez le tube dans de l’azote liquide. Remplacez le couvercle standard du tube par un filtre de 0,22 micromètre pour empêcher la poudre de s’écouler du tube.Insérez le tube dans le lyophilisateur et lyophilisez à nouveau pour éliminer l’eau de l’étape de lavage. Dissoudre la poudre de MEC humaine lyophilisée préalablement préparée dans une solution de pepsine, jusqu’à une concentration finale de 10 mg par mL. Transférez la solution dans des tubes de 2 mL d’un volume de 1 mL par tube.Pipetez la solution pour bien mélanger. Ensuite, placez les tubes dans l’agitateur et secouez à 1200 tr/min pendant 48 heures à 27 degrés Celsius. Sortez les tubes du shaker et placez-les sur de la glace ou un support de tube pré-refroidi.Mélangez 1/9 du volume de la solution ECM de PBS 10X froid, avec 1/10 du volume d’une solution ECM d’hydroxyde de sodium 0,1 molaire froid, dans un tube pré-refroidi et placez-le sur de la glace pour neutraliser la solution ECM digérée et inactiver la pepsine. Enfin, ajoutez la solution ECM au mélange de neutralisation et mélangez soigneusement par pipetage ou vortex. Des tests quantitatifs pour des composants ECM individuels ont révélé une élimination plus complète de l’ADN et une meilleure conservation du collagène total, de l’élastine et des glycosominoglycanes par rapport à la décellularisation par SDS seul.La RT-PCR a été utilisée pour quantifier l’expression des protéines structurelles de la cardiomyocite, des facteurs de transcription cardiomyogéniques précoces et tardifs et des gènes marqueurs de surface des cellules endothéliales dans l’ESC murin, subissant une différenciation spontanée. Le contact avec la cECM entraîne les cellules souches pluripotentes, de préférence vers un phénotype semblable à celui du cardiomyocite. La microscopie optique à contraste de phase démontre que la digestion enzymatique de la CEM pendant 48 heures permet d’obtenir une solution de MEC plus homogénéisée.La coloration vivante/morte des fibroblastes cardiaques humains sur l’hydrogel cECM montre une viabilité accrue. Les microparticules cECM et l’hydrogel cECM améliorent l’activité métabolique des cellules HL-1 contractiles, dans des conditions ischémiques, par rapport aux cellules en culture standard. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine du tissu à l’hydrogel, si elle est correctement exécutée.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la régénération cardiaque, pour explorer les effets de la matrice extracellulaire cardiaque, in vitro et in vivo, des systèmes modèles.

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Méthodes de préparation d'une matrice de gel injectable à partir de tissus décellularisé et l'injecter dans le rat...

La fabrication des matériaux injectables d&#39;origine biologique pour l&#39;ingénierie tissulaire du myocarde

Nous décrivons l'isolement des cardiomyocytes néonataux et la préparation des cellules pour l'encapsulation dans les constructions d'hydrogel de fibrine pour l'ingénierie tissulaire. Nous décrivons des méthodes d'analyse de l'ingénierie tissulaire du myocarde après la période de culture, y compris force active générée lors de la stimulation électrique et la viabilité des cellules et la coloration immunohistochimique.

L&#39;encapsulation des cardiomyocytes dans un hydrogel de fibrine pour l&#39;ingénierie du tissu cardiaque

Ce manuscrit décrit la création de tissus cardiaques modifiés définis à l’aide de l’expression de marqueurs de surface et du tri cellulaire. Les tissus définis peuvent ensuite être utilisés dans un bioréacteur multi-tissus pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque afin de fournir un système modèle fonctionnel, mais contrôlé, du cœur humain.

Construction des Défini humaines Engineered cardiaques Tissues pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque

Ici, nous montrons la génération de tissu cardiaque humain conçu à partir de cellules souches pluripotentes induites (hiPSC) cardiomyocytes dérivée de. Nous présentons une méthode pour analyser la force de contraction et de modification à titre d'exemple de configuration de contraction de l'inhibiteur du canal hERG E-4031. Cette méthode montre haut niveau de robustesse et l'aptitude pour le dépistage des drogues cardiaque.

Automatisé Contraction L&#39;analyse des tissus humains Engineered cardiaque pour le dépistage de la sécurité cardiaque médicaments

Cette méthode permet de DÉCELLULARISATION d’un organe solide complexe à l’aide d’un protocole simple basé sur un choc osmotique et la perfusion de détergent ionique avec une interruption minimale orgue matrice. Elle compose d’une technique de DÉCELLULARISATION roman pour les coeurs humains à l’intérieur d’une poche sous pression avec un suivi en temps réel du débit de flux dynamique et cellulaires de débris.

DÉCELLULARISATION du cœur humain à l’intérieur d’une poche sous pression dans une Orientation inversée

Le protocole actuel génère des tissus cardiaques en forme de maille contenant des cellules cardiovasculaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour permettre l’étude de la thérapie d’implantation cellulaire pour les maladies cardiaques.

Préparation de tissus cardiaques en forme de maille dérivés de cellules iPS humaines pour la réparation myocardique in vivo

La thérapie à base de cellules souches est apparue comme une stratégie efficace pour réparer les tissus cardiaques blessés après l’infarctus du myocarde. Nous fournissons une application in vivo optimale pour la transplantation de cellules souches utilisant des hydrogels de gélatine qui peuvent être enzymatiquement liés.

Transplantation intramyocardique d’hydrogels injectables à chargement MSC après l’infarctus du myocarde dans un modèle murin

Le but de ce protocole est d’expliquer et de démontrer le développement d’un modèle microfluidique tridimensionnel (3D) de tissu cardiaque humain fortement aligné, composé de cardiomyocytes dérivés de cellules souches co-cultivés avec des fibroblastes cardiaques (CFs) dans un hydrogel biomimétique et à base de collagène, pour des applications dans l’ingénierie tissulaire cardiaque, le criblage de drogue, et la modélisation de maladie.

Développement de tissu cardiaque humain organisé en 3D au sein d’une plate-forme microfluidique

Un ensemble de protocoles pour la génération et la cryoconservation de sphéroïdes cardiaques (CS) à partir de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme cultivés dans un format multidimensionnel à haut débit est présenté. Ce modèle tridimensionnel fonctionne comme une plate-forme robuste pour la modélisation des maladies, les criblages à haut débit et conserve sa fonctionnalité après cryoconservation.

Génération, criblage à haut débit et biobanque de sphéroïdes cardiaques dérivés de cellules souches pluripotentes d’origine humaine

Des fibroblastes isolés du cœur humain adulte ont été cultivés jusqu’à la confluence sur des boîtes recouvertes de gélatine pour produire la matrice extracellulaire spécifique du myocarde. Après décellularisation, ce substrat peut être utilisé pour la culture et l’étude d’autres cellules cardiaques et des interactions cellule-matrice.

Production de matrice extracellulaire cardiaque à partir de fibroblastes humains adultes pour l’enrobage de la boîte de culture

Une méthode reproductible est présentée pour générer des tissus myocardiques 3D combinant l’écriture par électrofilage fondu (MEW), des échafaudages de polycaprolactone (PCL) et des hydrogels de fibrine avec des cardiomyocytes et des fibroblastes dérivés de hiPSC. Cette technique offre un contrôle précis de l’architecture de l’échafaudage et peut être appliquée dans les tests précliniques de médicaments et la modélisation des maladies cardiaques.

Génération 3D de tissu myocardique humain à l’aide de l’écriture électrofilée à l’état fondu d’échafaudages de polycaprolactone et de cellules cardiaques dérivées de hiPSC

Découvrez la décellularisation du myocarde humain pour produire un hydrogel de matrice extracellulaire auto-assemblant. Cette méthode permet d'étudier le comportement cellulaire et de développer des applications thérapeutiques pour l'infarctus du myocarde.

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Traitement du tissu cardiaque humain vers la matrice extracellulaire auto-assemblage Hydrogel pour In Vitro et In Vivo des Applications

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