Name: Mis à jour le rouleau Tube méthode d’imagerie Intermittent précisément localisé et répétitif au cours de la Culture à long terme des tranches de cerveau dans un système fermé (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Découvrez la méthode modifiée de tube à rouleau pour cultiver et imager des tranches de cerveau de rongeurs sur le long terme. Cette technique permet l'imagerie répétée à haute résolution des mêmes populations neuronales.

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<ol><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal%2C+a+new+serum-free+medium+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).</li>
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<li>Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+and+cofilin-actin+rods+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease.</a> Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).</li>
<li>He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).</li>
<li>Minamide, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+use+of+replication-deficient+adenovirus+for+transgene+expression+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons.</a> Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).</li>
<li>Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+synapsin+1+gene+promoter+confers+highly+neuron-specific+long-term+transgene+expression+from+an+adenoviral+vector+in+the+adult+rat+brain+depending+on+the+transduced+area%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area.</a> Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).</li>
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<li>Davis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+dimers%2Ftrimers+potently+induce+cofilin-actin+rods+that+are+inhibited+by+maintaining+cofilin+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation.</a> Mol Neurodegener. 6, 10(2011).</li>
<li>Walsh, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+and+proinflammatory+cytokines+utilize+a+prion+protein-dependent+pathway+to+activate+NADPH+oxidase+and+induce+cofilin-actin+rods+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons.</a> PLOS ONE. 9 (4), 95995(2014).</li>
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<li>Shaw, A. E., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+regulation+of+cofilin+activity+in+the+CNS%3A+a+novel+therapeutic+approach+for+treatment+of+multiple+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders.</a> Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).</li>
</ol>

La méthode du tube rouleau décrite ici permet de culture à long terme et une imagerie direct du tissu cérébral en tranches. Un problème majeur avec la technique de tranche appliquée ici est dans le montage et l’entretien des tranches. Revêtements de lamelle qui prennent en charge la tranche adhérence, promouvoir l’amincissement de la tranche en améliorant l’excroissance des neurites et la migration des cellules hors la tranche ; ainsi, nous avons évité l’utilisation de ces substrats. L’insertion des groupes aminés sur le...

Des cultures primaires de neurones dissociés des régions du cerveau de rongeur sont un outil important utilisé par les chercheurs pour observer les réponses à pathologiquement impliqués des stimuli. Toutefois, ces études présentent l’inconvénient de regarder les neurones en 2D uniquement et sans leur système de soutien glial. En outre, sauf s’il est cultivé dans des conditions de très haute densité (640 neurones/mm2 ou environ 16 % de la surface) dans lequel il devient impossible de suivre l’excroissance au hasard d’une dendrite ou axone depuis plus d’une courte distance de son corps cellulaire, hippocampe viabilité neuronale pendant 4 semaines diminue de façon importante1, limitant l’utilisation de cultures dissociées des études étendues des pathologies liées au vieillissement. La mise en culture des tranches préparés à partir de cerveau de rongeur est une option intéressante qui permet de surmonter ces limitations en conservant une architecture cellulaire organisés et la viabilité des semaines ou des mois. Conditions pour le maintien de nombreuses régions du cerveau de rongeur dans la tranche de culture ont été décrits2.
Deux méthodes principales sont largement utilisés pour les cultures à long terme des tranches de cerveau : culture sur la membrane à l' interface air-liquide3 ou mise en culture sur les lamelles dans des tubes scellés a permis de tourner dans un incubateur à rouleau d’aération4. Tranches sur des membranes peuvent être photographiées directement avec la microscopie de fluorescence à haute résolution à l’aide d’un microscope droit et eau immersion objectifs5. Alternativement, tranches cultivés sur les membranes ont été transférés à la vaisselle en verre bas pour atteindre la bonne résolution des épines dendritiques, à l’aide d’un microscope inversé6. Toutefois, les deux méthodes d’imagerie tranches cultivés sur les membranes sont des systèmes ouverts qui nécessitent des modifications moyennes et utilisent souvent les antifongiques et/ou des antibiotiques pour prévenir ou réduire la contamination5,6. Tranches sur une membrane à l’interface air-médium maintiennent excellente morphologie et la survie, mais revenir à des emplacements précis en imagerie répétitive à fort grossissement est extrêmement difficile à moins que l’expérience est issue uniquement de petits groupes de cellules exprimant un marqueur fluorescent. Bien que les tranches cultivés sur les membranes ont été utilisés avec virale véhiculée par expression de transgènes5,6, protocoles de prévention des risques biotechnologiques peuvent nécessiter un système de culture clos être employées pour certains vecteurs viraux qui sont utilisés pour exprimant fluorescent étiquetée protéines et reporters de la physiologie cellulaire. En outre, les objectifs à immersion exigent décontamination entre les échantillons qui seront suivies dans la culture5. Une application importante des cultures interface membrane est de combiner une imagerie avec l’électrophysiologie de temps unique points7.
La méthode du tube à rouleaux avec lamelles couvre-objet à l’intérieur du tube en plastique ne permet pas de n’importe quel électrophysiologie ou l’imagerie haute résolution sans enlever le couvre-objet. Ainsi, cette méthode a été le plus souvent appliquée à des études à long terme dans lequel, après fixation observations ont été faites à8. Décrite ici est une méthode qui utilise la technique de culture de tube de rouleau, mais sur les tubes percés-out avec des tranches sur lamelles couvre-objet qui peut être photographiée de façon répétitive pour aussi longtemps que les cultures est maintenue. Le système clos ne requiert aucun changement médiatique pour l’imagerie et utilise des lamelles de photodécoupe pour fournir des repères qui permettent d’imagerie à fort grossissement, après quelques jours ou semaines, les domaines précis précédemment imagés.
Nous appliquons cette méthode pour analyser les changements dans l’hippocampe de rongeur, une région de majeur du cerveau impliquée dans la mémoire et l’apprentissage. L’hippocampe rongeur est souvent étudiée comme modèle pour des changements pathologiques ou liée à l’âge observée au cours du développement de troubles cognitifs9, telles que celles qui se produisent dans l’AD. Notre méthode est particulièrement bien adaptée à l’étude des changements pathologiques qui se développent au sein d’une seule tranche au fil du temps en réponse aux changements environnementaux, tels que l’augmentation des peptides bêta-amyloïdes, qui est caractéristique de l’AD8. Une pathologie associée du cerveau humain et les rongeur est la présence d’agrégats de cofilin-actine et tiges, les faisceaux contenant ce dernier des filaments dans laquelle cofilin et l’actine sont dans un rapport molaire 1:110,11, 12. tiges ont été observés dans les tranches fixes d’hippocampe de rat après un traitement de bêta-amyloïdes, ainsi que dans une tranche de cerveau de rongeurs vivants exprimant cofilin-GFP, soumis à l’hypoxie,8, et ils peuvent contribuer à la dysfonction synaptique chez AD et d’AVC. Ici, nous utilisons cette nouvelle méthode de culture pour observer l’évolution temporelle et la distribution dans les tranches des exogènes chimériques fluorescentes protéines exprimées introduites par différents virus. Ensuite, nous utilisons l’expression neuronale spécifique d’une construction de journaliste cofilin pour suivre l’évolution de la tige de cofilin et pathologie globale dans des tranches d’hippocampe en réponse au traitement par solubles oligomères bêta-amyloïdes (Aßo).

<table><tbody><tr><td>Fond des plats de culture de 15 cm</td><td>VWR Scientific</td><td>25384-326</td><td></td></tr><tr><td>Vis à métaux à tête cruciforme (#10-32)</td><td>Ace Hardware</td><td></td><td>2,5 » de long et 3/16 » de diamètre</td></tr><tr><td>Rondelles plates #10</td><td>ACE Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Écrous à vis mécaniques (#10-32)</td>ACE <td>Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rubber Grommets&nbsp ;</td><td>Quincaillerie ACE</td><td>5/16 », d’épaisseur ; 5/8 », diamètre de trou ; 1,125 », tube</td>en polyéthylène OD (5/16 » ;<td></td></tr><tr><td> OD, 3/16" ; ID)</td><td>ACE Hardware</td><td></td><td>Cut to 1.8</td></tr>" <tr><td>Longueur Rondelle de blocage #10</td><td>Perceuse à colonne ACE</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>5 vitesses&nbsp ;</td><td>Ace Hardware</td><td>ProTech Model 1201</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Flat-Sided Tubes</td><td>VWR</td><td>62407-076</td><td></td></tr><tr><td>Forets, 3 mm, 6 mm et 15 mm&nbsp ;</td><td>Ace Hardware</td><td>Diablo freud marque</td><td>Forets pour couper le plastique.</td></tr><tr>Forets pour le bois, lime à bois <td>Ace Hardware</td><td></td><td></td> <td>de 1,5 cm et 1 mm</td></tr><tr><td>, pinces à ressort Ace Harware</td><td></td><td></td><td></td>rondes de 1/4 po</tr><tr><td>, porte-pression de 16 mm</td> outil d’ébavurage à tête pivotante <td>Ace Hardware</td><td></td><td></td></tr>, feuille de silicone adhésive <tr><td>Ace Hardware</td><td>26307</td><td></td>de<td>5 po</td></tr> <tr><td>(joint sécurisé)</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>666581</td><td>0,5 mm d’épaisseur</td></tr><tr><td>Perforatrice de 6 mm Perforatrice</td><td>Office Max</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 12 mm</td><td>thepunchbunch.com</td><td></td><td></td></tr> lamelles phototechnologiques <tr><td>à 70 % d’éthanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, diamètre 12 mm</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>1916-91012</td><td></td></tr><tr>Bec <td></td><td></td><td></td><td>Bunsen</td></tr><tr><td>Éthanol absolu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eau</td><td></td><td></td><td></td>nanopure</tr><tr><td>3-aminopropyltriéthoxylane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>#5 Dumont Forceps</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Hachoir à tissus McIlwain</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir à double tranchant</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Filter Paper</td><td>VWR</td><td>28450-182</td><td>Coupé en cercles de 5,8 cm de diamètre</td></tr><tr><td>Poly-chloro-trifluoro-éthylène (Aclar)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>10501-10</td><td>Couper en cercles de 5,8 cm de diamètre</td></tr><tr><td>#21 Lame chirurgicale</td><td>VWR Scientific</td><td>25860-144</td><td></td></tr><tr><td>#5 Dumont Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Spatule en acier inoxydable avec extrémité effilée</td><td>VWR</td><td>82027-518</td><td></td></tr><tr><td>Gey’s Balanced Salt Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9779&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Glucose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15023-021</td><td>Solution à 25 % (p/v), filtre de 0,2 mm stérilisé</td></tr><tr><td>Plasma de poulet</td><td>Cocalico Biologicals</td><td>30-0300-5L</td><td>Réhydrater dans de l’eau stérile, centrifugeuse à 2500 x g 30 min à 4 &deg ; C, congélation rapide des aliquotes dans de l’azote liquide et stockage à&nbsp ; -80 °C</td></tr><tr><td>Thrombine topique (bovine)</td><td>Pfizer</td><td>Thrombin-JMI</td><td>Aliquotes de congélation rapide dans l’azote liquide à 1 000 unités internationales/mL dans le diluant fourni et stocké à -80&deg ;C. Utilisation à 250 unités/mL.</td></tr><tr><td>Cell Roller System</td><td>Bellco Biotech</td><td>SciERA</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à rouleaux</td><td>Forma</td><td>Modèle 3956</td><td></td></tr><tr><td>N21-MAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AR008</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>200 mM Glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15023-021</td><td>Solution à 25 % (p/v), filtre de 0,2 mm stérilisé</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10888-022&nbsp ;</td><td>Milieu complet : 48 mL de neurobasal A, 1 mL de N21-MAX, 0,625 mL de 200 mM de glutamine, 0,180 mL de glucose à 25 %, 0,250 mL de 100x stylo/streptocoque.</td></tr><tr><td>Emballage de lentivirus de troisième génération</td><td>Life Technologies</td><td>K4975-00</td><td></td></tr><tr><td>159 K filtres centrifuges à coupure (Centricon)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr> Système <tr><td>de clonage lentiviral (InFusion)</td><td>Clonetech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmids 30323, 50856, 51279</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colorant de viabilité des cellules neuronales (NeuO)</td><td>Technologies des cellules souches</td><td>1801</td><td>Décongeler une fois et congeler rapidement en 4 & micro ; L aliquotes. Conserver à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>Objectifs de microscope</td><td>Olympus</td><td>air : 4X, 20 ; huile : 40X, 60X,Système</td><td></td></tr> <tr><td>confocal à disque rotatif</td><td>Yokagawa</td><td>CSU22</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Caméra EMCCD</td><td>Photométrie</td><td>Cascade II</td><td></td></tr><tr><td>Linéaire codé (x,y), piézo z plat, platine ASI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope lasers et intégration</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cellules</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Plasmine humaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1867</td><td>0,002 U/mL dans 0,1 % d’albumine sérique bovine (filtre 0,2 mm stérilisé), congélation rapide dans de l’azote liquide et stockage à -80 &deg ;C.</td></tr></tbody></table>

mis à jour le rouleau tube méthode d’imagerie intermittent précisément localisé et répétitif au cours de la culture à long terme des tranches de cerveau dans un système fermé

Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System

Coupes de cerveau de rongeurs cultivées sont utiles pour étudier le comportement moléculaire et cellulaire des neurones et des cellules gliales dans un environnement qui soutient plusieurs de leurs interactions normales en vivo . Tranches provenant d’une variété de lignées de souris transgéniques ou utilisation de vecteurs viraux pour l’expression des protéines fluorescent étiquetées ou reporters dans les coupes de cerveau de type sauvage permettent d’imagerie haute résolution en microscopie par fluorescence. Bien que plusieurs méthodes ont été développées pour l’imagerie des tranches de cerveau, alliant la culture tranche avec la capacité d’exécuter répétitives une imagerie de cellules spécifiques en tranches direct sur de longues périodes a posé des problèmes. Cela est particulièrement vrai lorsque les vecteurs viraux sont utilisées pour l’expression des protéines exogènes, puisque cela se fait mieux dans un système fermé pour protéger les utilisateurs et d’éviter toute contamination croisée. Nous rapportons des simples modifications apportées à la méthode de culture de rouleau tube cerveau tranche qui permettent pour l’imagerie haute résolution répétitive des tranches sur plusieurs semaines dans un système fermé. Cultivant les tranches sur des lamelles de photodécoupe permet l’utilisation de repères de rapidement et précisément repositionner la scène pour l’image du champ identique au fil du temps avant et après des traitements différents. Des exemples sont donnés pour l’utilisation de cette méthode combinée à une coloration neuronale spécifique et expression d’observer les changements dans l’architecture tranche hippocampe, expression neuronale induite par virale de protéines fluorescentes et le développement de la pathologie cofilin, qui a été précédemment observé dans l’hippocampe de la maladie d’Alzheimer (ma) en réponse au traitement de la tranche avec des oligomères de peptide amyloïde-β (Aβ).

Pour déterminer la précision avec laquelle les repères peuvent être utilisés pour reimage les mêmes cellules dans les mêmes champs au fil du temps, nous avons examiné les tranches cultivées sur des lamelles de photodécoupe (Figure 6A). Les neurones ont été visualisées par la souillure avec un colorant vital (100 nM pendant 2 h ; ne tache pas les cellules non neuronales), qui disparaît de neurones au fil du temps sans léser les cellules<sup cl...

Présenté ici est la méthode du tube mis à jour le rouleau pour la culture et intermittent une imagerie du cerveau rongeur tranches sur plusieurs semaines avec un repositionnement précis sur couvre-objet en photodécoupe. Viabilité neuronale et la morphologie de la tranche sont bien entretenus. Sont prévues des adaptations de ce système entièrement fermé à l’aide de virus pour l’expression spécifique de type cellulaire.

Mis à jour le rouleau Tube méthode d’imagerie Intermittent précisément localisé et répétitif au cours de la Culture à long terme des tranches de cerveau dans un système fermé

Cultured rodent brain slices are useful for studying the cellular and molecular behavior of neurons and glia in an environment that maintains many of ...

L’objectif global de cette méthode modifiée de tube rouleau pour la culture de tranches de cerveau est de fournir un système de culture fermé pour la survie à long terme des tranches. avec la capacité d’imagerie répétitive à haute résolution de la florescence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le développement neuronal et les troubles neurodégénératifs qui nécessitent l’observation des mêmes neurones au fil du temps, comme la localisation des protéines clés impliquées dans la formation ou la perte de synapses.Les principaux avantages de cette technique sont le système de culture entièrement fermé qui permet l’utilisation en toute sécurité des virus pour l’expression des protéines et l’utilisation de lamelles photodécoupées pour localiser les mêmes cellules pour l’imagerie. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous cultivions des tranches sur des lamelles à l’intérieur de tubes à rouleaux, mais nous avions besoin d’un meilleur moyen de visualiser les changements qui se produisent dans les tranches vivantes au fil du temps. L’utilisation généralisée de vecteurs viraux pour exprimer des transgènes et des populations cellulaire

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Source : Wiegreffe, C., et al.,  Imagerie confocale en accéléré de neurones migrateurs dans une culture en coupe organotypique de cerveau embryonnaire de souris à l’aide deIn Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017) Cette vidéo montre la microscopie confocale time-lapse pour observer la migration radiale des neurones corticaux à partir de la zone sous-ventriculaire à la plaque corticale via des échafaudages gliaux radiaux dans des tranches de cerveau embryonnaire de souris transduites.

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