Mis à jour le rouleau Tube méthode d’imagerie Intermittent précisément localisé et répétitif au cours de la Culture à long terme des tranches de cerveau dans un système fermé

L’objectif global de cette méthode modifiée de tube rouleau pour la culture de tranches de cerveau est de fournir un système de culture fermé pour la survie à long terme des tranches. avec la capacité d’imagerie répétitive à haute résolution de la florescence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le développement neuronal et les troubles neurodégénératifs qui nécessitent l’observation des mêmes neurones au fil du temps, comme la localisation des protéines clés impliquées dans la formation ou la perte de synapses.

Les principaux avantages de cette technique sont le système de culture entièrement fermé qui permet l’utilisation en toute sécurité des virus pour l’expression des protéines et l’utilisation de lamelles photodécoupées pour localiser les mêmes cellules pour l’imagerie. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous cultivions des tranches sur des lamelles à l’intérieur de tubes à rouleaux, mais nous avions besoin d’un meilleur moyen de visualiser les changements qui se produisent dans les tranches vivantes au fil du temps. L’utilisation généralisée de vecteurs viraux pour exprimer des transgènes et des populations cellulaires spécifiques pour l’imagerie microscope nous a poussés à développer un système fermé pour protéger les utilisateurs et éliminer la contamination des objectifs de microscope.

La capacité de suivre la population identique de cellules dans des tranches de cerveau au fil du temps permet d’étudier le développement de changements pathologiques et l’altération des synapses dans des modèles de rongeurs de troubles neurologiques humains. Pour commencer, préparez le support de tube à rouleaux et fabriquez un gabarit pour aider à percer un trou dans les tubes à rouleaux comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. À l’aide du gabarit, maintenez en position un tube de culture en plastique à côtés plats, d’un centimètre, de sorte que le côté plat soit vers le haut.

Percez ensuite un trou de six millimètres de diamètre avec le centre à un centimètre du bas et centré entre les côtés du tube. Avec l’outil d’ébavurage pivotant, lissez les bords du trou et faites quatre rainures sur le bord intérieur du trou pour faciliter le drainage du trou pendant la rotation. Ensuite, rincez les tubes avec de l’éthanol à 70 %, puis faites-les sécher à l’air libre dans une enceinte de sécurité biologique.

Stérilisez les tubes dans des disques de caoutchouc de silicone adhésifs poinçonnés de 12 millimètres pendant 40 minutes sous la lampe UV. Après 20 minutes, repositionnez les tubes et les disques de manière à ce que toutes les surfaces exposées soient stérilisées. Ensuite, décollez le support blanc du disque adhésif, alignez les trous et fixez le caoutchouc de silicone à l’extérieur du tube.

Une fois les tranches obtenues, placez deux microlitres de plasma de poulet au centre du côté photogravé d’une lamelle préparée. Répartissez légèrement le plasma pour obtenir un point de trois à quatre millilitres de diamètre. Ensuite, utilisez une spatule stérile à pointe étroite pour soulever une tranche de cerveau préparée.

À l’aide d’une pince fermée, maintenez la tranche sur la pointe de la spatule tout en soulevant la tranche. Touchez la spatule au point de plasma sur la lamelle et, à l’aide d’une pince fermée, poussez la tranche sur la lamelle. Ajoutez une fine couche de plasma de poulet sur la lamelle avant de placer la tranche et une quantité minimale de plasma traité à la thrombine pour couvrir la tranche.

Si la tranche flotte, elle ne restera pas collée lorsque le nuage sera retiré. Ensuite, mélangez 2,5 microlitres de plasma et 2,5 microlitres de thrombine dans un tube séparé. Placez rapidement 2,5 microlitres de ce mélange sur et autour de la tranche et pipetez doucement de haut en bas pour la mélanger.

Retirez le revêtement en plastique transparent de la face exposée de l’adhésif en caoutchouc de silicone précédemment fixé sur le tube du rouleau. Placez ensuite la lamelle avec la tranche de cerveau sur l’adhésif en alignant la tranche dans le trou. Pour assurer l’adhérence, appliquez une pression douce et uniforme sur la lamelle avec le pouce, en appuyant uniformément sur la lamelle et en la maintenant pendant environ une minute tout en la transférant dans l’enceinte de sécurité biologique.

La pression exercée sur la lamelle pour l’adhère au tube sans fuite doit être juste suffisante et maintenue suffisamment longtemps pour éliminer les canaux d’air dans le saillant. Trop de pression fissurera la lamelle. Dans une enceinte de sécurité biologique, ajoutez 0,8 millilitre de milieu de culture neurobasal complet A dans chaque tube.

Ensuite, faites couler un mélange de 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’air à travers une pipette Pasteur stérile bouchée de coton maintenue solidement par une pince. Utilisez-le pour rincer le tube du rouleau avec le mélange gazeux et boucher rapidement le tube lorsqu’il est retiré de la pipette. Ensuite, étiquetez les tubes avec le numéro de la tranche et le numéro du panier.

Insérez les tubes dans un support à roulettes ; s’assurer qu’ils sont géométriquement équilibrés. S’il y a un nombre impair de tubes, ajoutez des tubes vierges pour équilibrer. Placez les grilles dans un incubateur à rouleaux à 35 degrés Celsius, avec des rouleaux faisant tourner la grille à rouleaux de 10 à 13 tours par heure.

Inclinez l’incubateur vers l’arrière d’environ 5 degrés en soulevant son avant sur une planche. Transférez un tube avec une culture en tranches dans un support de tube sur mesure comme celui illustré ici. Ensuite, placez le support de tube dans l’adaptateur de platine pour maintenir la lamelle perpendiculaire à l’objectif pendant l’imagerie.

Ensuite, poussez le curseur de l’adaptateur de platine contre le tube pour maintenir le tube en position. À l’aide d’un objectif quadruple sous trans-éclairage en champ clair, faites la mise au point sur la période de la grille photogravée sous la tranche. Pour la séance d’imagerie initiale, balayez rapidement autour de la tranche pour localiser et enregistrer le numéro des différentes régions où une imagerie à fort grossissement est souhaitée.

Une fois les régions d’intérêt identifiées, déplacez la scène jusqu’au premier carré de la grille contenant une région d’intérêt. Passez ensuite à l’objectif d’erreur de force 20 et localisez une marque de repère. Ensuite, passez à un objectif de puissance plus élevée, localisez le même repère et enregistrez les positions x et y de la platine.

Déplacez la platine pour trouver les autres champs d’intérêt à proximité et enregistrez leurs décalages x et y par rapport à la marque repère. Les positions de décalage permettent d’obtenir un point précis cohérent du même emplacement de lamelle de recouvrement lorsque la tranche est imagée, même si le réglage x, y d’origine de la marque de repère change lorsque le tube ou l’adaptateur de platine sont retirés et remplacés. Capturez une image Z-stick dans chaque champ sélectionné à l’aide de la commande de l’objectif du microscope ou d’une commande de platine piézoélectrique si elle est disponible.

L’utilisation d’un colorant vital neuronal, comme le montre la pile d’images confocales ici, met en évidence l’architecture 3D des neurites et du corps cellulaire, mais la coloration est exclue du noyau. Pour examiner les changements en fonction du temps de la morphologie et de la viabilité des tranches de croissance au cours de la culture à long terme, la même tranche a été marquée avec un colorant vital neuronal fluorescent une fois par semaine, 24 heures avant l’imagerie. Pour démontrer la reproductibilité de l’imagerie des cellules identiques au fil du temps, le même champ d’une tranche marquée avec un colorant vital neuronal le jour 13 a été imagé les jours 14, 15, 16 et 17.

La position de trois cellules chaque jour est indiquée par un symbole au-dessus du noyau. En plus du colorant vital neuronal, des protéines fluorescentes à médiation virale peuvent être utilisées avec ce système pour marquer les cellules. Ici, un rapporteur sensible au calcium et des bâtonnets contenant de la cofiline peuvent être clairement identifiés 10 jours après l’infection.

La mise en œuvre réussie de cette procédure nécessite une préparation préalable de tous les tubes, lamelles et solutions. Être capable d’obtenir des coupes dans un court intervalle post-mortem est également crucial pour le succès et nécessite beaucoup de pratique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ 90 minutes pour obtenir 12 à 18 tranches d’hippocampe d’un bébé souris, y compris les temps de dissection et de placage.

À la suite de cette procédure, des tranches de cerveau peuvent être infectées à divers moments par des virus pour obtenir l’expression spécifique du type cellulaire de protéines marquées par fluorescence ou le silence pour l’expression génique avec de petits ARN interférents ou un ARN en épingle à cheveux court pour sonder la fonction des gènes. N’oubliez pas que travailler avec des virus recombinants peut être dangereux et que des précautions telles que le port d’une protection oculaire doivent toujours être prises lorsque vous travaillez avec ces réactifs.