Application de la microscopie vitesse haut débit Super-résolution en direct cil primaire

Récemment, nous avons cartographié les emplacements de spatiales en trois dimensions (3D) de voies de transport pour différentes protéines translocation à l’intérieur des cils primaires dans des cellules vivantes. Ici ce détails papier expérimental, le processus d’échantillons biologiques et les analyses de données pour la fluorescence 3D Super-resolution imaging approche nouvellement appliqués en live cils primaires.

L’objectif global de cette expérience est d’identifier les voies de transport des protéines dans les cils primaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cils, telles que les différences de voies de transport des protéines chez les cils normaux et dysfonctionnels. Le principal avantage de cette technique est qu’elle a une résolution suffisamment élevée pour voir les voies de transport des protéines de subdiffraction dans les cellules vivantes.

Pour commencer, décongelez du stock congelé de cellules NIH-3T3 spécialement conçues à 37 degrés Celsius, une semaine et demie avant l’expérience. Transférez les cellules décongelées dans un flacon de culture cellulaire de 25 centimètres carrés contenant trois millilitres de milieu préchauffé. Maintenez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone.

Cultivez les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent 80 % de confluence, puis divisez les cellules. Afin de diviser les cellules, trypsinez-les avec 0,25 % de trypsine pendant deux minutes à 37 degrés Celsius. Après la brève incubation, aspirez la trypsine et remplacez-la par deux millilitres de milieu de culture préchauffé.

Pipetez le support pour briser les amas de cellules, puis retirez 75 % des cellules du flacon et ramenez le volume total du support à trois millilitres. Divisez les cellules au moins trois fois avant l’expérience pour assurer l’homogénéité de leur cycle cellulaire. Deux jours avant l’expérience, divisez les cellules et plaquez-les à 60-70 % de confluence sur une plaque à fond en verre de 35 millimètres avec 1,5 millilitre du même milieu de culture.

Ensuite, un jour avant l’expérience, transfectez chimiquement les cellules avec le plasmide souhaité. Mélangez 500 à 1000 nanogrammes du plasmide dans un rapport de un à 2,5 avec un réactif de transfection et 0,25 millilitre de milieu sérique réduit sans antibiotiques pendant 30 minutes. Une fois que le complexe de transfection s’est formé, aspirez le milieu du plat à fond en verre de 35 millimètres et remplacez-le par le mélange de transfection de 0,25 millimètre et 1,25 millimètre supplémentaire de milieu sérique réduit sans antibiotiques et remettez la plaque dans l’incubateur.

Pour les cellules avec une construction SSTR3 marquée de l’extérieur, retirez le milieu de la boîte à fond de verre une heure avant l’expérience. Lavez les cellules cinq fois avec un millilitre de PBS et ajoutez un millilitre de milieu sérique réduit complété par une micromolaire de streptavidine conjuguée à Alexa 647. Pas plus de 15 minutes avant l’expérience, retirez le milieu du plat à fond de verre et lavez les cellules cinq fois avec un millilitre de PBS.

Ajoutez ensuite un millilitre de tampon d’imagerie dans le plat à fond de verre. Fixez la plaque inférieure en verre à la platine dans le microscope. Trouvez une cellule express GFP à l’aide de l’ensemble de filtres GFP et localisez une cellule qui exprime correctement SSTR3-GFP dans un cil primaire.

Une fois qu’une cellule appropriée a été trouvée, alignez le point NPHP4-mCherry à la base des cils primaires avec l’emplacement sur le plan d’imagerie qui correspond à l’éclairage du point unique du laser. À l’aide de la fonction d’accrochage, dans l’onglet appareil photo de la fenêtre des commandes de mise au point, capturez une image d’épifluorescence des protéines NPHP4-mCherry et SSTR3 marquées avec une protéine de fluorescence verte. Une fois les images de référence obtenues, réduire localement la concentration des molécules uniques marquées en photoblanchissant la zone de transition avec un éclairage laser d’un milliwatt pendant 20 secondes.

Pour vous préparer au suivi d’une molécule unique, réduisez la puissance d’éclairage laser à 0,5 milliwatt pour les molécules marquées avec Alexa 647. Réglez le gain et l’intensification au maximum et la fréquence d’images à deux millisecondes. Cliquez ensuite sur le bouton de flux dans l’onglet Appareil photo de la fenêtre des commandes de mise au point et engagez le laser d’éclairage approprié.

Enregistrez les molécules uniques marquées non photoblanchies au fur et à mesure qu’elles sont transportées à travers la région photoblanchie de la zone de transition. Et n’oubliez pas de ne pas enregistrer plus de deux minutes de vidéo pour éviter les effets de la dérive ciliaire. Après avoir capturé les molécules individuelles, traitez les vidéos à l’aide d’un algorithme d’ajustement gaussien 2D tel que Glimpse du laboratoire Gelles, qui localise avec précision le centroïde du point d’excitation de chaque molécule, de la fonction d’étalement et d’une zone d’intérêt englobante.

Enfin, sélectionnez tous les emplacements de molécules uniques avec une précision supérieure à 10 nanomètres et corrigez le centre des cils en fonction de la distribution des emplacements de molécules uniques équipés d’une fonction gaussienne 2D. Comme décrit dans cette vidéo, l’éclairage à point unique peut être utilisé pour suivre une molécule SSTR3 marquée AF647 à travers la zone de transition marquée par NPHP4-mCherry. Avant l’analyse des données, la superposition de la vidéo d’une seule molécule sur l’éclairage à grand champ est une étape de validation utile pour s’assurer que le laser est correctement aligné et qu’il existe un rapport signal/bruit adéquat.

L’image ici est une cellule avec un cil primaire identifié par la coloration. IFT20 est un composant du complexe de transport intraflagellaire qui transporte la cargaison le long des microtubules à l’intérieur des cils primaires, marqués par Arl13b-mCherry. Une fois identifiée, la microscopie rapide est utilisée pour suivre les protéines IFT20-GFP individuelles.

Ensuite, un algorithme de transformation 2D à 3D est utilisé pour produire la distribution de densité de probabilité spatiale de la protéine à l’intérieur des cils primaires le long d’une seule dimension. Cette région à haute densité colocalise probablement avec les microtubules axonémiques en accord avec l’emplacement connu de la voie de transport intraflagellaire. Lors de cette procédure, il est important d’aligner précisément l’échantillon avec le laser afin de minimiser les erreurs systématiques.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de faire du suivi de molécule unique avec la microscopie rapide et vous saurez comment obtenir la voie de transport d’une molécule unique dans les cils primaires.