Name: Méthodes pour analyser les effets de l’Uranium naturel sur In Vitro Osteoclastogenesis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse des effets de l'uranium naturel sur l'ostéoclastogenèse in vitro utilisant des cellules RAW 264.7. Cette technique permet d'évaluer la viabilité cellulaire et la différenciation ostéoclastique.

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Les auteurs tiens à remercier Chantal Cros pour assistance technique utile. Cette recherche a été financée par des subventions de la « Commissariat à l’Energie Atomique et aux énergies Alternatives » (URANOs - Programme Transversal de Toxicologie du CEA et RERPC CEA-AREVA) et de l’ANR (toxicité de l’URanium : approche multi-niveaux de biominéralisation processus en os, ANR-16-CE34-0003). Ce travail a été également soutenu par l’Université de Nice Sophia-Antipolis et le CNRS.

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<li>Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uranium+inhibits+bone+formation+in+physiologic+alveolar+bone+modeling+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Res%22%5BJournal%5D)">Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling.</a> Environ. Res. 54 (1), 17-23 (1991).</li>
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<li>Kurttio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+as+a+possible+target+of+chemical+toxicity+of+natural+uranium+in+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water.</a> Environ. Health Perspect. 113 (1), 68-72 (2005).</li>
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<li>Mirto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+uranium%28VI%29+speciation+for+the+evaluation+of+in+vitro+uranium+cytotoxicity+on+LLC-PK1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Exp.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells.</a> Hum. Exp. Toxicol. 18 (3), 180-187 (1999).</li>
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<li>Milgram, S., Carrière, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+and+phenotypic+effects+of+uranium+and+lead+on+osteoblastic+cells+are+highly+dependent+on+metal+speciation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation.</a> Toxicology. 250 (1), 62-69 (2008).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Pour autant que nous savons, c’est la première fois que nous décrivons une procédure détaillée visant à étudier les effets de l’uranium naturel sur OS résorption des cellules. Cette approche sera utile à une meilleure compréhension de l’impact de l’uranium sur la physiologie osseuse et peut fournir un nouvel outil intéressant pour le dépistage des chélateurs de l’uranium. En outre, nous pensons que le protocole décrit ici pourrait être appliqué pour étudier l’impact des autres métaux lourds sur osteoclatogenesis.
<p ...

L’uranium est un élément radioactif naturel présent dans les sols, air et eau ; par conséquent, animaux et les humains sont exposés à l’uranium naturel dans leur alimentation. En plus de sources naturelles, uranium provient d’origine anthropique, qui augmente son abondance dans l’environnement. L’uranium pose des risques chimiques et radiologiques. Cependant, parce que l’uranium naturel (qui est un mélange isotopique contenant 99,27 % 238U, 0,72 % 235U et 0,006 % 234U) a une faible activité spécifique (25,103 Bq.g-1), ses impacts sur la santé sont attribués à sa toxicité chimique.
Quelle que soit sa voie d’accès (inhalation, ingestion ou cutanée), la plupart d’uranium pénétrant dans l’organisme est éliminé par les fèces et seule une petite partie atteint la circulation générale. Environ 67 % de l’uranium dans le sang est ensuite filtrée par les reins et quitte le corps dans l’urine dans les 24 h1. Le reste se dépose principalement dans les reins et les os, les deux organes de cible principale de la toxicité de l’uranium pour2,3,4. Parce que le squelette a été identifié comme le principal site d’uranium à long terme conservation2,3,4,5,6, plusieurs études ont été réalisées afin d’explorer les effet de l’uranium sur OS physiologie7.
L’OS est un tissu minéralisé qui est remodelé en permanence tout au long de sa durée de vie. Remodelage osseux est un processus complexe qui dépend des types de cellules spécialisées et se compose essentiellement de deux phases : la résorption de la matrice préexistante vieux par les ostéoclastes suivie de novo construction d’os par les ostéoblastes. Les ostéoclastes sont des cellules multinucléaires grands résultant de la fusion de cellules précurseurs d’origine hématopoïétique qui migrent vers des sites de résorption où qu’ils attachent à l’OS8. Leur fixation se produit simultanément avec une réorganisation à grande échelle de leur cytosquelette9. Cette réorganisation est nécessaire pour la mise en place d’un compartiment isolé entre la cellule et la surface de l’os dans lequel les ostéoclastes sécrète des protons, conduisant à la dissolution de l’hydroxyapatite et des protéases impliquées dans la dégradation de la matrice organique. Les produits de dégradation qui en résultent sont mégacaryocyte, transporté à travers la cellule à la zone de la membrane opposée à la surface osseuse et sécrétée, un processus appelé transcytose10,11.
Les résultats des études in vivo et in vitro indiquent que l’uranium inhibe la formation osseuse et altère le nombre et l’activité des ostéoblastes7,12. En revanche, les effets de l’uranium sur la résorption osseuse et les ostéoclastes ont été peu explorées. Plusieurs des études in vivo ont signalé une augmentation de la résorption osseuse après administration de nitrate d’uranyle de souris ou rats13,14. En outre, une enquête épidémiologique a suggéré que l’augmentation de l’apport d’uranium dans l’eau potable ont tendance à être associée à une augmentation de la concentration sérique d’un marqueur de résorption osseuse en hommes15. Pris ensemble, ces conclusions ont conduit à la conclusion que l’uranium, qui s’accumule dans les os pourrait favoriser la résorption osseuse. Toutefois, les mécanismes cellulaires impliqués dans cet effet potentiel de l’uranium restent une question ouverte. Pour cette raison, nous avons décidé d’examiner l’impact de l’uranium sur le comportement de la résorption des cellules osseuses.
Nous décrivons ici le protocole que nous avons mis en place pour caractériser et quantifier les effets de l’uranium naturel sur la viabilité des ostéoclastes avant et sur la différenciation des ostéoclastes et activité de résorption. Les expériences décrites dans les présentes ont été faites avec la lignée de cellules macrophages de souris transformées RAW 264.7, qui peut facilement se différencient en ostéoclastes lorsque cultivées en présence de la cytokine RANKL pour 4 ou 5 jours, et qui est classiquement utilisé pour étudier ostéoclastes différenciation et fonction16. Les procédures mises en place sont fiables, donnent des résultats hautement reproductibles et sont pleinement applicable aux ostéoclastes primaires. Pour toutes ces raisons, nous croyons que cette méthode est utile pour obtenir une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la toxicité de l’uranium dans les os. En outre, nous pensons que cette approche pourrait être adaptée comme outil de dépistage pour identifier les nouvelles d’uranium par des agents chélateurs.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>&alpha ;-MEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>EMEM sans rouge de phénol</td><td>Lonza</td><td>12-668E</td><td></td></tr><tr><td>Eau pour culture cellulaire</td><td>Lonza</td><td>BE17-724F</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pénicilline-streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Solution de L-Glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Solution de Bleu de Trypan 0,4 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Sérum fœtal bovin</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 7,5 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase acide, Lekocyte (TRAP) kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de thiazolyle Bromure de tétrazolium (MTT) en poudre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Rouge d’alizarine Sel de sodium, 1 % p/v aq. sol.</td><td>Alfa Aeros</td><td>42746</td><td></td></tr><tr><td>Osteoassay Plaques de résorption osseuse, 24 plaques de puits</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3987</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 24 plaques de puits</td><td>Falcon</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Flask 75 cm2</td><td>Falcon</td><td>353133</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques en polypropylène 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Racleurs de cellules 30 cm</td><td>TPP</td><td>Référence 90003</td><td></td></tr></tbody></table>

méthodes pour analyser les effets de l’uranium naturel sur in vitro osteoclastogenesis

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

L’uranium a été montré pour interférer avec la physiologie osseuse et il est bien établi que ce métal s’accumule dans les os. Cependant, on connaît les effets de l’uranium naturel sur le comportement des cellules osseuses. En particulier, l’impact de l’uranium sur les ostéoclastes, les cellules responsables de la résorption de la matrice osseuse, n’est pas documentée. Pour étudier cette question, nous avons créé un nouveau protocole avec l’acétate d’uranyle comme une source d’uranium naturel et de la lignée murine RAW 264.7 comme modèle des précurseurs ostéoclastiques. Ici, nous avons détaillé tous les tests requis pour tester la cytotoxicité d’uranium sur les précurseurs d’ostéoclastes et d’évaluer son impact sur l’osteoclastogenesis et la fonction de résorption des ostéoclastes matures. Les conditions que nous avons développé, en particulier pour la préparation des milieux de culture contenant de l’uranyle et l’ensemencement des RAW 264.7 cellules permettent d’obtenir des résultats fiables et hautement reproductif. En outre, nous avons optimisé l’utilisation des outils logiciels pour faciliter l’analyse de divers paramètres tels que la taille des ostéoclastes ou le pourcentage de matrice résorbé.

Phosphatases acides tartrate-résistantes de coloration a été utilisée pour visualiser les ostéoclastes comme grandes cellules violets avoir 3 ou plusieurs noyaux. Des images représentatives des ostéoclastes provenant des 264.7 cellules crues cultivées en présence de RANKL et ions uranyle sont indiquées à la Figure 1. Changements dans le nombre et la taille des ostéoclastes en réponse à l’uranium sont facilement visibles dans l’image composite de tout puits et...

L’uranium est connu pour affecter le métabolisme osseux. Nous présentons ici un protocole visant à étudier les effets de l’exposition de l’uranium naturel sur la viabilité, la différenciation et la fonction des ostéoclastes, les cellules en charge de la résorption osseuse.

Méthodes pour analyser les effets de l’Uranium naturel sur In Vitro Osteoclastogenesis

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

L’objectif général de cette procédure est d’étudier les effets de l’exposition naturelle à l’uranium sur la viabilité, la différenciation et la fonction des ostéoclastes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la toxicité environnementale concernant l’impact de l’exposition à l’uranium sur la physiologie et le métabolisme osseux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle constitue un nouvel outil intéressant pour le dépistage des sources d’uranium.Lorsque la culture cellulaire RAW 264.7 a atteint une confluence de 85 à 90 %, à l’aide d’un grattoir cellulaire, soulever mécaniquement les cellules du fond du ballon de culture cellulaire et transférer les cellules dans un tube conique stérile de 50 millilitres. Pipetez la solution cellulaire plusieurs fois pour briser les amas et compter la suspension unicellulaire résultante. Diluez les cellules à une concentration unique de 10 pour 10 cellules par millilitre dans un milieu essentiel minimum modifié alpha, complété par de la L-glutamine et 5 % de sérum de veau fœtal, et ajoutez un millilitre de cellules par puits à une plaque de culture cellulaire de 24 puits pour une incubation de six h

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Developmental Biology

Biologie du développement

Dans cette vidéo, nous décrivons un test de résorption ostéoclastique in vitro sur des plaques de culture cellulaire enrobées de phosphate de calcium cultivées avec des ostéoclastes dérivés de cellules mononucléées du sang périphérique humain. Les ostéoclastes forment un anneau d’actine caractéristique sur la matrice recouverte de phosphate de calcium de la plaque de culture cellulaire et dégradent la matrice dans la région du cycle d’actine pour libérer des ions calcium et phosphate, ce qui...

Essai de fosse de résorption : une technique in vitro pour quantifier l’activité de résorption calcique des ostéoclastes matures à l’aide de plaques de culture enrobées de phosphate de calcium

Dans cette vidéo, nous démontrons l’effet de différentes concentrations d’anticorps anti-c-fms sur l’ostéoclastogenèse, qui est le processus de formation des ostéoclastes à partir des progéniteurs des ostéoclastes.

Effet de l’anticorps anti C-fms sur l’ostéoclastogenèse dans les cellules de moelle osseuse de souris in vitro

Les ostéoclastes sont des cellules du capital de résorption osseuse dans le corps. Une capacité à isoler les ostéoclastes en grand nombre a conduit à des avancées significatives dans la compréhension de la biologie des ostéoclastes. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour l'isolement, la culture et la quantification de l'activité des ostéoclastes in vitro.

Ostéoclastes Dérivation de moelle osseuse de souris

l’eau de saignement de production (PBW) a été traitée avec des nanoparticules d’oxyde cuivrique (CuO-NPs) et la toxicité cellulaire a été évaluée dans des cellules humaines en culture. L’objectif de ce protocole était d’intégrer l’échantillon environnemental natif dans un format de culture cellulaire évaluant les changements de toxicité dus au traitement CuO-NP.

Suppression des éléments traces par Cupric nanoparticules d&#39;oxyde de Uranium<em&gt; In Situ</em&gt; Récupération de l&#39;eau de ressuage et son effet sur la viabilité cellulaire

Les ostéoclastes sont des polycaryons macrophages spécifiques aux tissus dérivés de la lignée monocyte-macrophages des cellules souches hématopoïétiques. Ce protocole décrit comment isoler les cellules de la moelle osseuse afin que de grandes quantités d’ostéoclastes soient obtenues tout en réduisant le risque d’accidents que l’on retrouve dans les méthodes traditionnelles.

Isolement, purification et différenciation des précurseurs d’Ostéoclast de la moelle osseuse de rat

Ce protocole comprend la dissection de murin des os longs et l’isolement de la moelle osseuse, pour générer des macrophages de la moelle osseuse et de produire des ostéoclastes à l’aide de la colonie de macrophages stimulant facteur (M-CSF) et activateur du récepteur du ligand facteur nucléaire Kappa-B (RANKL) ou facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et leur arrestation par des anticorps anti-c-fms, récepteurs de M-CSF.

Effet des anticorps Anti-c-fms sur la Formation des ostéoclastes et la prolifération des précurseurs des ostéoclastes In Vitro

Ce protocole présente un test d’absorption d’acides aminés radiomarqués, utile pour évaluer la consommation d’acides aminés dans les cellules primaires ou dans les os isolés.

Évaluation de la consommation d’acides aminés dans les cellules osseuses en culture et les arbres osseux isolés

Le test de flux métabolique cellulaire en temps réel mesure le taux de consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire, qui correspond à la production mitochondriale et glycolytique d’adénosine triphosphate, à l’aide de capteurs de pH et d’oxygène. Le manuscrit explique une méthode pour comprendre l’état énergétique des ostéoblastes et la caractérisation et l’interprétation de l’état bioénergétique cellulaire.

Utilisation d’un analyseur de flux métabolique cellulaire en temps réel pour surveiller la bioénergétique des ostéoblastes

Nous présentons ici des protocoles qui offrent une base flexible et stratégique pour manipuler viralement les cellules précurseurs d’oligodendrocytes afin de surexprimer des protéines d’intérêt afin d’interroger spécifiquement leur rôle dans les oligodendrocytes via le modèle in vitro de myélinisation du système nerveux central.

Production et utilisation de lentivirus à des cellules sélective transduction primaire Oligodendrocyte précurseur pour In Vitro Les dosages de la myélinisation

Nous avons mis au point une méthode d’encapsulation de cellules souches pluripotentes (cellules PS) dans des capsules d’hydrogel d’alginate à l’aide d’une buse coaxiale.  Cela empêche les cellules de s’agréger excessivement et limite le stress de cisaillement subi par les cellules en culture en suspension.  La technique est applicable à la production de masse de cellules PS ainsi qu’à la recherche sur la niche des cellules souches.

Encapsulation alginate de cellules souches pluripotentes en utilisant une buse de co-axiale

Découvrez une méthode d'analyse des effets de l'uranium naturel sur l'ostéoclastogenèse in vitro utilisant des cellules RAW 264.7. Cette technique permet d'évaluer la viabilité cellulaire et la différenciation ostéoclastique.

Méthodes pour analyser les effets de l’Uranium naturel sur In Vitro Osteoclastogenesis

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