Méthodes pour analyser les effets de l’Uranium naturel sur In Vitro Osteoclastogenesis

L’objectif général de cette procédure est d’étudier les effets de l’exposition naturelle à l’uranium sur la viabilité, la différenciation et la fonction des ostéoclastes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la toxicité environnementale concernant l’impact de l’exposition à l’uranium sur la physiologie et le métabolisme osseux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle constitue un nouvel outil intéressant pour le dépistage des sources d’uranium.

Lorsque la culture cellulaire RAW 264.7 a atteint une confluence de 85 à 90 %, à l’aide d’un grattoir cellulaire, soulever mécaniquement les cellules du fond du ballon de culture cellulaire et transférer les cellules dans un tube conique stérile de 50 millilitres. Pipetez la solution cellulaire plusieurs fois pour briser les amas et compter la suspension unicellulaire résultante. Diluez les cellules à une concentration unique de 10 pour 10 cellules par millilitre dans un milieu essentiel minimum modifié alpha, complété par de la L-glutamine et 5 % de sérum de veau fœtal, et ajoutez un millilitre de cellules par puits à une plaque de culture cellulaire de 24 puits pour une incubation de six heures à 37 degrés Celsius.

La densité d’ensemencement cellulaire est un paramètre important pour la reproductibilité de la différenciation et de la réabsorption des ostéoclastes. Portez une attention particulière au comptage des cellules, à la préparation de la suspension cellulaire et à son homogénéité avant de plaquer les cellules. Pour préparer la solution de sel d’urinoir, à partir d’une solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 7,5 % testée sur culture cellulaire stérile, préparez et refroidissez d’abord 100 millimolaires de bicarbonate dans de l’eau sur de la glace et ajoutez un volume de solution d’acétate d’urinoir de 100 millimolaires, goutte à goutte, dans neuf volumes de la solution de bicarbonate glacée en agitant doucement.

Laissez la solution s’équilibrer à température ambiante. Après trois heures, diluer le volume approprié de solution d’urinoir, goutte à goutte, dans un milieu de différenciation contenant 50 nanogrammes par millilitre de RANKL jusqu’à ce que la concentration de travail souhaitée de l’urinoir soit atteinte et permettre encore trois heures d’équilibre à température ambiante. Les longues étapes d’incubation après chaque dilution du sel d’urinoir sont essentielles pour la stabilisation des complexes d’urinoir dans les solutions.

À la fin de la deuxième période d’équilibre, remplacez délicatement le milieu dans chaque puits par un millilitre d’urinoir traité ou de milieu témoin selon le cas et remettez les cellules dans l’incubateur. Les ostéoclastes multinucléés doivent apparaître entre le troisième et le quatrième jour de culture. Pour évaluer la taille et la morphologie des ostéoclastes nouvellement différenciés, colorez les cellules avec de la phosphatase acide résistante au tartrate, selon les instructions du fabricant et imagez toute la surface de chaque puits à une résolution suffisante pour distinguer les noyaux cellulaires.

Lorsque tous les puits ont été imagés, ouvrez une image d’un puits à l’aide du logiciel ImageJ open source et vérifiez les unités d’échelle. Cochez ensuite la case Global dans la fenêtre contextuelle pour appliquer les nouvelles unités d’échelle à toutes les images ultérieures. Dans le menu Analyser, sélectionnez Définir les mesures et cochez les cases Étiquette de zone et d’affichage.

Décochez toutes les autres cases. Dans le menu Analyser, ouvrez Outils puis le Gestionnaire de régions d’intérêt et sélectionnez l’outil de sélection rectangulaire dans la fenêtre principale d’ImageJ. Décrivez une région d’intérêt d’environ 1 000 par 1 000 micromètres et cliquez sur le bouton Ajouter pour ajouter la sélection au gestionnaire de régions d’intérêt.

Cliquez ensuite sur Plus, Enregistrer pour enregistrer la région. Pour créer une copie de l’une des cinq régions à analyser, sélectionnez la région d’intérêt dans le Gestionnaire de régions d’intérêt et cliquez avec le bouton droit de la souris à l’intérieur de la zone sélectionnée pour dupliquer la région. Cochez les cases Afficher tout et Étiquettes, puis sélectionnez l’outil de sélection de polygone pour délimiter manuellement l’un des ostéoclastes dans la région d’intérêt dupliquée.

Pour ajouter ce schéma au Gestionnaire de régions d’intérêt, cliquez sur Ajouter dans la fenêtre Gestionnaire de régions d’intérêt. Une fois que tous les ostéoclastes ont été ajoutés, sélectionnez tous les contours et cliquez sur Mesurer pour mesurer leurs surfaces. Transférez ensuite les mesures qui apparaissent dans la fenêtre des résultats dans une feuille de calcul.

Pour évaluer la fonction des ostéoclastes traités en urinoir, un jour avant l’ajout du milieu de différenciation, déposer des cellules RAW d’une culture cellulaire confluente de 85 à 90 % sur une plaque d’ostéo de 24 puits dans un milieu de croissance, comme nous venons de le démontrer. Le lendemain, remplacez doucement le surnageant par un urinoir de différenciation contenant un milieu et laissez les cellules RAW se différencier en ostéoclastes, comme nous venons de le démontrer. Le cinquième jour de l’ostéoclastogenèse, remplacez le milieu contenant l’urinoir par une solution d’eau de Javel à 10 % pour éliminer les cellules de la surface mimétique osseuse.

Après cinq minutes à température ambiante, lavez les puits deux fois avec de l’eau déminéralisée et laissez-les sécher à l’air. Ensuite, colorez les sels de calcium dans les zones non résorbées de chaque puits avec une solution de sel de sodium de rouge d’alizarine S à 1 %. Après 10 à 15 secondes, retirez la solution d’alizarine et lavez doucement les puits trois à quatre fois avec de l’eau.

Pour convertir une image RVB des puits colorés à l’alizarine au format 8 bits en niveaux de gris, dans le menu Image, sélectionnez Type et 8 bits. Ensuite, à l’aide de l’outil de sélection ovale, tracez le contour de toute la surface du puits à analyser pour la résorption et enregistrez la région d’intérêt, comme nous venons de le démontrer. Pour faciliter la sélection du seuil, sélectionnez Modifier et effacer à l’extérieur pour effacer toutes les entités en dehors de la région d’intérêt définie.

Dupliquez la région d’intérêt comme vous venez de le démontrer et sélectionnez Ajuster le seuil dans le menu Image, en ajustant la barre de défilement pour sélectionner un seuil approprié. Toutes les zones résorbées doivent être au-dessus du seuil et apparaître blanches, tandis que toutes les zones non résorbées doivent être en dessous du seuil et apparaître en rouge. Pour finaliser la sélection du seuil, cliquez sur Appliquer dans la fenêtre Seuil et enregistrez l’image binaire finale dans le format qui vous intéresse.

Pour définir les mesures à prendre dans la région d’intérêt, dans le menu Analyser, sélectionnez Définir les mesures, cochez les cases Zone, Fraction de zone et Limite au seuil, puis décochez toutes les autres cases. Ensuite, pour obtenir la fraction de la zone résorbée directement dans la fenêtre des résultats, inversez l’image binaire dupliquée en sélectionnant Inverser dans le menu Édition et en prenant soin que la région d’intérêt principale soit sélectionnée sur l’image binaire finale et mesurez la fraction de la zone résorbée. Les changements dans le nombre et la taille des ostéoclastes nouvellement différenciés en réponse à l’uranium sont facilement visibles dans les images composites de puits entiers, ainsi que dans les images agrandies de régions d’intérêt sélectionnées.

La taille des ostéoclastes cultivés dans différentes conditions de culture peut être analysée, comme il vient de le démontrer, en décrivant tous les ostéoclastes dans chaque région et en mesurant la surface de chaque cellule délimitée. Pour étudier l’impact de l’uranium sur l’activité de résorption des ostéoclastes, les cellules RAW 264.7 sont plaquées et différenciées sur des plaques de surface ostéomimétiques. À la fin du test, les ostéoclastes sont retirés et les zones non résorbées sont colorées et imagées comme démontré.

Les images sont ensuite converties en niveaux de gris 8 bits et seuillées pour faciliter le calcul des zones résorbées. Cette procédure peut également être appliquée à l’étude de l’impact d’autres métaux lourds sur l’ostéoclastogenèse.