Ostéoclastes Dérivation de moelle osseuse de souris

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les ostéoclastes de la moelle osseuse de souris en grand nombre. Ceci est accompli en prélevant d’abord des os de souris euthanasiées. Ensuite, les cellules sont libérées de la moelle osseuse à l’aide d’un mortier et d’un pilon pour écraser les os dans un tampon de faits.

Ensuite, la solution de moelle osseuse est superposée sur le milieu de séparation cellulaire à gradient de densité et la séparation cellulaire à gradient de densité est effectuée. Enfin, la couche contenant les cellules d’intérêt est aspirée et les cellules sont placées dans un milieu d’induction de microphages de moelle osseuse. En fin de compte, la coloration au piège est utilisée pour montrer la présence d’un grand nombre d’ostéoclastes.

Les implications de cette technique s’étendent aux maladies associées à une fonction ostéoclastique altérée, dont la gravité peut varier d’une maladie néonatale mortelle due à l’incapacité de former un espace médullaire pour l’hématopoïèse à rencontrer plus fréquemment des pathologies telles que l’ostéoporose, car elle produit une méthode fiable pour isoler un grand nombre d’ostéoclastes de la moelle osseuse de souris. Pour commencer, apportez 10 millilitres de séparation cellulaire à gradient de densité disponible dans le commerce, à température moyenne à ambiante dans un tube conique de 50 millilitres. Placez une aliquote de 50 millilitres de tampon de télécopie à température ambiante à utiliser avec le milieu de séparation des cellules à gradient de densité.

Après avoir préparé des milieux supplémentaires et euthanasié une souris C 57 black six, selon le protocole textuel, placez la souris sur une planche de dissection et utilisez de l’éthanol à 70 %. Pour le pulvériser, récoltez la féra, le tibia, l’œil et la colonne vertébrale. Ensuite, placez les os dans les faits tampon sur de la glace.

Ensuite, à l’aide de papier de soie propre, retirez les muscles et les tissus mous des os. Placez les os dans un mortier et un pilon avec trois millilitres de faits, tamponnez-les et écrasez-les doucement. Ensuite, aspirez le liquide taché de sang et passez-le à travers une passoire de 70 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres.

Ajoutez cinq millilitres supplémentaires de tampon d’effets à l’os écrasé et écrasez davantage avant de transférer le liquide à travers la passoire dans le tube de 50 millilitres. Continuez ce processus jusqu’à ce que le liquide ne tache plus en rouge avant de granuler la moelle osseuse à 200 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Pour effectuer une séparation en gradient, aspirez les surnageants de la pastille cellulaire et utilisez 10 millilitres de tampon de télécopie pour les réanimer.

Suspendez la pastille, inclinez le tube conique du milieu de séparation cellulaire à gradient de densité de température ambiante à environ 30 degrés, et à l’aide d’une pipette électrique avec la pointe de la pipette contre la surface supérieure intérieure du tube. Superposez lentement la solution de moelle osseuse sur le milieu à l’aide d’une centrifugeuse à température ambiante, sans accélération ni décélération. Faites tourner la pente à 200 G pendant 15 minutes.

Aspirez ensuite la couche intermédiaire trouble, qui contient les cellules d’intérêt, et transférez-les dans un nouveau tube conique. Ajoutez 20 millilitres de tampon de télécopie glacé pour laver les cellules. Ensuite, utilisez un millilitre de milieu stimulant les microphages de la moelle osseuse pour remettre en suspension la dernière pastille cellulaire après le comptage cellulaire.

Placez deux millilitres de milieu stimulant les microphages dans chaque puits d’une plaque de 24 puits. Ajoutez ensuite 200 000 cellules dans chaque puits, une densité cellulaire qui garantira une culture adéquate des ostéoclastes in vitro. Agitez doucement la plaque et incubez à 37 degrés Celsius sans changer de milieu pendant trois jours.

Après le troisième jour, remplacez le milieu par un milieu d’induction ostéoclastique de moelle osseuse et commencez à le changer quotidiennement pendant cinq à sept jours. À ce moment-là, de grands ostéoclastes multinucléés devraient être visibles. Reportez-vous au protocole de texte pour la coloration et le test de résorption comme indiqué ici.

Un nombre élevé d’ostéoclastes peut être confirmé à l’aide d’un dosage résistant au tartrate. Les ostéoclastes colorant les phosphotates sont visualisés comme de grandes cellules violettes avec plusieurs noyaux en utilisant le protocole démontré dans cette vidéo. Il est courant d’isoler les ostéoclastes avec jusqu’à 30 noyaux par cellule.

L’utilisation d’une surface minéralisée est considérée comme la méthode de référence pour évaluer l’activité résorbtive des ostéoclastes in vitro. Dans cette figure, la microscopie à fond clair à un grossissement de 10 x montre un pourcentage de surface minéralisée ou de fosses résorptives qui se forment comme indiqué en noir, ce qui permet de déterminer la capacité de résorption des ostéoclastes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler de manière fiable un grand nombre d’ostéoclastes de la moelle osseuse de souris.