Name: Ostéoclastes Dérivation de moelle osseuse de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Apprenez à isoler des ostéoclastes à partir de la moelle osseuse de souris en grande quantité. Cette méthode utilise un gradient de densité pour séparer les cellules et permet d'étudier la biologie osseuse et les maladies associées.

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Nous reconnaissons l&#39;appui de subventions des NIH R01 DE021683, DE019434 R01, U01 HL099776, la Fondation Oak et le laboratoire Hagey for Pediatric médecine régénérative.

REMARQUE: déclaration éthique: Toute recherche impliquant des animaux vertébrés a été réalisée dans les protocoles de conformité approuvés par la commission administrative de Stanford sur le soin des animaux de laboratoire (APLAC). 1. Préparation <ol><li> Autoriser 10 ml de milieux disponibles dans le commerce de séparation cellulaire à gradient de densité (qui contient le polysucrose et de diatrizoate de sodium, ajusté à une densité de 1,077 g / ml) de venir à la température ambiante dans un tube conique de 50 ml. </li><li> Préparer cytométrie en flux (FACS) avec un tampon phosphate de 1x solution saline tamponnée (PBS) et 2% de sérum de veau foetal (SVF). Il suffit de 50 ml aliquote et maintenir cette aliquote à la température ambiante pour une utilisation au cours de l&#39;étape de milieux de séparation cellulaire à gradient de densité. </li><li> Avoir un seau de glace prêt à maintenir le tissu isolé et cellules en cours de la procédure d&#39;isolement. </li></ol> 2. Préparer les milieux de culture <ol><li> Préparez le support de base: MEM (Minimal Essential Medium), sans rouge de phénol (500 ml), le glutamate (1x), FCS (10x), 10 000 unités / ml penicillin (1x). </li><li> Filtre milieux de base avec un filtre de 0,22 um. </li><li> Préparer os médias moelle macrophages par induction: <ol><li> 50 ml de milieux de base préparé à l&#39;étape 2.1. </li><li> Ajouter la prostaglandine E2 (PGE2, M. 352,465 g / mol) à 10 -7 M concentration finale. </li><li> Ajouter Macrophage Colony-Stimulating Factor (M-CSF) à 10 ng / ml. </li><li> Ne pas filtrer la solution finale de macrophages de la moelle osseuse en stimulant médias. </li></ol></li><li> Préparez le support d&#39;induction des ostéoclastes: <ol><li> 50 ml de milieux de base préparé à l&#39;étape 2.1. </li><li> Ajouter la prostaglandine E2 (PGE2, M. 352,465 g / mol) à 10 -7 M concentration finale </li><li> Ajouter Macrophage Colony-Stimulating Factor (M-CSF) à 10 ng / ml. </li><li> Ajouter RANKL à 10 ng / ml. </li><li> Ne pas filtrer la solution finale de médias ostéoclastes d&#39;induction. </li></ol></li></ol> 3. Isolement de moelle osseuse <ol><li> Euthanasier une souris C57BL / 6Procédé utilisant le dioxyde de carbone par inhalation, suivie d&#39;une dislocation cervicale. NOTE: Les rongeurs doivent être euthanasiés par un personnel qualifié en utilisant la technique, matériel et les agents appropriés. </li><li> Positionner et fixer la souris sur une planche de dissection et pulvériser avec 70% d&#39;alcool. </li><li> Disséquer les fémurs, tibias, humérus et la colonne vertébrale. <ol><li> Commencez avec la souris en position couchée. Faire une incision verticale le long de la branche inférieure et commencer par dissection sur la longueur du fémur et du tibia en divisant les pièces jointes des tissus mous. Enfin, disloquer les os de l&#39;articulation du genou et de la hanche afin de libérer pleinement os du squelette. </li><li> Procéder pour faire une incision le long de la longueur du membre supérieur pour isoler l&#39;humérus. Disloquer l&#39;humérus à l&#39;épaule et du coude en disséquant doux attachement capsulaire de tissu. </li><li> Enfin, mettez la souris sur, de sorte que la souris est sujette. Faire une incision de la peau le long de la longueur de la colonne vertébrale, à la ligne médiane. Observez la douce paravertebralle tissu de chaque côté de la colonne vertébrale et incise le long du bord osseux de la colonne vertébrale, de dissection à travers la masse paravertébrale des tissus mous. En utilisant une paire de ciseaux, faire une coupe horizontale à travers la colonne vertébrale à la base du cou, et à la fin de la colonne vertébrale, juste en amont de l&#39;insertion de la queue, ce qui libère la colonne vertébrale de la fixation des tissus mous. </li></ol></li><li> Une fois que les os sont récoltées, les garder dans un tampon FACS sur la glace. </li><li> Utilisez du papier de soie pour nettoyer les muscles et les tissus mous de l&#39;os. </li><li> Placez les os nettoyés dans un mortier avec 3 ml de tampon FACS. </li><li> Concasser les os doucement dans le pilon et le mortier. </li><li> Aspirer le fluide et le transfert taché de sang dans un tube conique de 50 ml en faisant passer la solution à travers un tamis cellulaire de 70 pm. </li><li> Ajouter 5 ml de tampon FACS à l&#39;os écrasés et écraser davantage. Encore une fois, retirez le fluide à l&#39;aide d&#39;une pipette et transférer à la 50 ml tube conique à travers une passoire 70 um. </li><li> Typiquement écraser les os twiCE à trois fois dans du tampon FACS frais, à l&#39;aide d&#39;un mortier et d&#39;un pilon, ajoutant à chaque fois à nouveau 5 ml de tampon FACS frais, jusqu&#39;à ce que le liquide ne tache pas rouge. </li><li> Centrifuger la solution de la moelle osseuse à 200 xg pendant 5 min à 4 ° C pour obtenir un culot cellulaire. </li></ol> 4. Séparation Gradient de cellules de moelle osseuse <ol><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 10 ml de tampon FACS (maintenu à la température ambiante). </li><li> Prendre le tube conique de 50 ml contenant 10 ml de milieux disponibles dans le commerce de séparation cellulaire à gradient de densité (RT). </li><li> La solution de couche de moelle osseuse sur le gradient de densité des milieux de séparation cellulaire. Pour ce faire, lentement en utilisant une pipette électrique. Angle de la pointe de la pipette contre la surface intérieure vers le haut du tube conique et incliner le tube conique à environ 30 °. L&#39;utilisation d&#39;un réglage de la vitesse lente de la pipette, expulser doucement la solution de la moelle osseuse de manière à ne pas perturber le gradient de densité des milieux de séparation cellulaire. NOTE: En fin de compte il y auraune définition claire entre les deux solutions (solution cellulaire et la solution de milieu de séparation cellulaire en gradient de densité). </li><li> L&#39;utilisation d&#39;une centrifugeuse à température ambiante, centrifuger le gradient de densité milieux de séparation cellulaire et de la solution de cellules dans une centrifugeuse équilibré à 200 xg pendant 15 min. En outre, supprimer l&#39;accélération et la décélération de la centrifugeuse afin d&#39;assurer une séparation de phases appropriée à l&#39;aide du gradient de densité de gradient de milieu de séparation cellulaire. </li><li> Après centrifugation, aspirer hors de la couche du milieu trouble qui contient les cellules de moelle osseuse d&#39;intérêt. </li><li> Transférer ces cellules dans un nouveau tube conique. Ajouter 20 ml de tampon FACS supplémentaire (conservé dans la glace) pour laver les cellules. </li><li> Centrifuger à 200 g pendant 5 min à 4 ° C pour obtenir un culot cellulaire. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml finale de stimulation des macrophages médias pour permettre le comptage des cellules en utilisant un hématimètre. </li></ol> 5. Décompte Cellulaire <ol><li> Prenez 10 pl de la solution cellulaire et mélangeravec 10 pi de bleu trypan. Charge 10 ul du mélange résultant SUR UNE hémocytomètre et obtenir le nombre de cellules par ml de solution. </li></ol> 6. La culture cellulaire <ol><li> Placer 2 ml de milieu de macrophage dans chaque puits d&#39;une plaque de 24 puits. </li><li> Ajouter 200.000 cellules dans chaque puits. NOTE: Dans notre expérience, la densité cellulaire placage est l&#39;un des besoins les plus cruciaux pour adéquat à la culture in vitro des ostéoclastes. </li><li> Agiter doucement la plaque et placer dans un incubateur régulière à 37 ° C. </li><li> Ne modifiez pas les médias pendant 3 jours. </li><li> Après 3 jours dans les médias de macrophage, changer les médias aux médias des ostéoclastes. </li><li> Ci-après, changer le quotidien des médias pendant 5-7 jours, à quel point, les grandes, les ostéoclastes multinucléées doit être visible sur la plaque de culture. </li></ol> 7. coloration avec résistant au tartrate acide phosphatase (TRAP) <ol><li> Après 5-7 jours in vitro de culture, aspirer les médias de la culture bien. </li><li> Laver les puits doucement avec du PBS 1X trois fois. </li><li> Fixer les cellules par addition d&#39;une solution de paraformaldéhyde à 4% et laisser reposer pendant 1 heure à 4 ° C. </li><li> Pendant ce temps, préparer la tache de TRAP (qui est disponible dans le commerce) par préchauffage à 37 ° C. </li><li> Après 1 heure dans du paraformaldéhyde, Aspirer paraformaldéhyde et laver délicatement 3 fois avec PBS 1x. </li><li> Ajouter 1 ml de colorant préchauffé piège dans chaque puits de la plaque à colorer. </li><li> Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 heure, à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Après 1 heure, aspirer la tache de TRAP. </li><li> Laver les puits 3 fois avec de l&#39;eau déminéralisée préchauffé. </li><li> Contre le bien à l&#39;hématoxyline de Gill (MISE EN GARDE) pendant 1-2 min. </li><li> ostéoclastes de l&#39;image en utilisant la microscopie à champ clair. </li><li> Laver les puits avec de l&#39;eau déminéralisée jusqu&#39;à une intensité de la couleur adéquate de la tache est réalisée, généralement lorsque les noyaux apparaissent blue. </li></ol> 8. résorption ostéoclastique Assay <ol><li> Utilisation d&#39;une boîte de culture de 24 puits en polystyrène disponibles dans le commerce qui est pré-revêtu d&#39;une ou l&#39;autre substrat de l&#39;os ou un revêtement de phosphate de calcium cristallin inorganique. </li><li> Placer 2 ml de milieu de macrophage dans chaque puits. </li><li> Ajouter 200 000 cellules de moelle osseuse fraîchement isolées obtenues à l&#39;issue de l&#39;étape 2 à chaque puits. </li><li> Agiter doucement la plaque avant de la placer dans un incubateur à 37 ° C pendant 3 jours. </li><li> Au jour 3, modifier le support de médias de la différenciation des ostéoclastes. </li><li> Effectuer des changements quotidiens des médias avec les médias de la différenciation des ostéoclastes pendant 5-7 jours. </li></ol> 9. Quantification de la résorption ostéoclastique activité <ol><li> Après 5-7 jours de culture dans un milieu de différenciation des ostéoclastes in vitro sur un substrat minéralisé, d&#39;analyser la surface minéralisée, comme décrit ci-dessous, afin d&#39;évaluer la capacité des ostéoclastes pour former resorptisur puits, un indicateur de l&#39;activité des ostéoclastes. </li><li> Aspirer le milieu de la plaque d&#39;essai de résorption et ajouter 100 ul d&#39;une solution d&#39;eau de Javel à 10% dans chaque puits. </li><li> Incuber les cellules avec la solution d&#39;eau de Javel à 10% pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Laver les puits 3 fois avec de l&#39;eau distillée. </li><li> Aspirer l&#39;eau restante et secouer l&#39;excès d&#39;eau de la plaque et laisser sécher à l&#39;air pendant 3-5 heures. </li><li> Contre la plaque avec un kit de coloration de Von Kossa disponible dans le commerce pour permettre la visualisation facile du substrat non résorbé. </li><li> Utilisez la microscopie à champ clair de prendre des images de pièces représentatives de la surface résorbée. </li><li> En utilisant le logiciel d&#39;analyse d&#39;image, calculer le pourcentage de la surface résorbé pour permettre une quantification de l&#39;activité de résorption ostéoclastique. </li></ol>

<ol><li>Sims, N. A., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+the+activities+of+bone+formation+and+resorption%3A+a+multitude+of+signals+within+the+basic+multicellular+unit%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+reports%22%5BJournal%5D)">Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit.</a> BoneKEy reports. 3, 481 (2014).</li>
<li>Kahn, A. J., Simmons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+cell+lineage+in+bone+using+a+chimaera+of+chick+and+quial+embryonic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue.</a> Nature. 258, 325-327 (1975).</li>
<li>Walker, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+resorption+restored+in+osteopetrotic+mice+by+transplants+of+normal+bone+marrow+and+spleen+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells.</a> Science. 190, 784-785 (1975).</li>
<li>Burger, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+formation+of+osteoclasts+from+long-term+cultures+of+bone+marrow+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).</li>
<li>Underwood, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+where+comes+the+osteoclast%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">From where comes the osteoclast.</a> The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).</li>
<li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bench+to+bedside%3A+elucidation+of+the+OPG-RANK-RANKL+pathway+and+the+development+of+denosumab%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab.</a> Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).</li>
<li>Brown, J. E., Coleman, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denosumab+in+patients+with+cancer-a+surgical+strike+against+the+osteoclast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Clinical+oncology%22%5BJournal%5D)">Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast.</a> Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).</li>
<li>Khosla, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+the+OPG%2FRANKL%2FRANK+system%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: the OPG/RANKL/RANK system.</a> Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).</li>
<li>Boyle, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+MAPK+kinases+MKK3+and+MKK6+in+osteoclastogenesis+and+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss.</a> PloS one. 9, (2014).</li>
<li>Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand+and+osteoprotegerin+in+bone+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+medicine+%28Berlin%2C+Germany%29%22%5BJournal%5D)">Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology.</a> Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).</li>
<li>Teramachi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+IL-6+Expression+in+Osteoclasts+is+Necessary+but+not+Sufficient+for+the+Development+of+Paget%27s+Disease+of+Bone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget's Disease of Bone.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).</li>
<li>Catalfamo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+induced+and+intrinsic+alterations+in+type+2+diabetes-derived+osteoclast+function%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+diseases%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function.</a> Oral diseases. 19, 303-312 (2013).</li>
<li>Schueler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratibial+injection+of+human+multiple+myeloma+cells+in+NOD%2FSCID+IL-2Rgamma%28null%29+mice+mimics+human+myeloma+and+serves+as+a+valuable+tool+for+the+development+of+anticancer+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Xing, L., Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANKL-Based+Osteoclastogenic+Assays+from+Murine+Bone+Marrow+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH protocols. , (2008).</li>
<li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblasts+provide+a+suitable+microenvironment+for+the+action+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand.</a> Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).</li>
<li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin%2Fosteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE%2FRANKL%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).</li>
<li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li>
<li>Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+osteoclast+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of osteoclast development and function.</a> Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).</li>
<li>Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+disruptors+and+bone+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+toxicology%22%5BJournal%5D)">Endocrine disruptors and bone metabolism.</a> Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).</li>
<li>Manolagas, S. C., O'Brien, C. A., Almeida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+estrogen+and+androgen+receptors+in+bone+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).</li>
<li>Martin, T. J., Udagawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+regulation+of+osteoclast+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+endocrinology+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Hormonal regulation of osteoclast function.</a> Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+prevents+bone+loss+via+estrogen+receptor+alpha+and+induction+of+Fas+ligand+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts.</a> Cell. 130, 811-823 (2007).</li>
<li>Bellido, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+interleukin-6%2C+osteoclastogenesis%2C+and+bone+mass+by+androgens.+The+role+of+the+androgen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor.</a> The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).</li>
<li>Roato, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+among+cells+of+bone%2C+immune+system%2C+and+solid+tumors+leads+to+bone+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica.%2C+%26+developmental+immunology%22%5BJournal%5D)">Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases.</a> Clinica., & developmental immunology. 2013, (2013).</li>
<li>Autio, K. A., Morris, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+bone+physiology+for+the+treatment+of+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+advances+in+hematolog.%2C+%26+oncology%22%5BJournal%5D)">Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer.</a> Clinical advances in hematolog., & oncology. 11, 134-143 (2013).</li>
<li>Sottnik, J. L., Keller, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+and+targeting+osteoclastic+activity+in+prostate+cancer+bone+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases.</a> Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).</li>
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Aucun des auteurs n&#39;a divulgation ou de conflit d&#39;intérêt à déclarer.

Une capacité d&#39;isoler et de cultiver facilement un grand nombre d&#39;ostéoclastes in vitro a été chargé d&#39;aider à faire progresser la compréhension de la biologie des maladies des os et des ostéoclastes. Il a été l&#39;identification de RANKL qui mènent à cela, quand il a récemment été identifié comme le principal régulateur de la formation des ostéoclastes, la différenciation et la survie 16-18. Il a été notre expérience que la culture in vitro des osté...

Le remodelage osseux est dynamique et implique le couplage de la formation osseuse à la résorption osseuse 1. Ce processus finement régulé est responsable du maintien du squelette au cours de l&#39;homéostasie normale, et en réponse à une blessure et maladie. Les ostéoclastes sont des cellules multinucléées uniques qui sont capables de se résorber à la fois les matrices organiques et inorganiques de l&#39;os. Les ostéoclastes sont issus de la lignée des monocytes / macrophages de la moelle osseuse 5.2. Les anomalies de la fonction ou de la formation des ostéoclastes peuvent entraîner une variété de pathologies cliniques, y compris les conditions courantes telles que l&#39;ostéoporose. La capacité de générer des ostéoclastes in vitro a permis des avancées significatives dans notre compréhension de la biologie de l&#39;os 6. En conséquence, de nouveaux agents thérapeutiques émergent pour traiter des maladies liées aux ostéoclastes qui sont responsables de la morbidité et de la mortalité importantes 7 </sjusqu&#39;à&gt;. Entretien homéostatique de la masse osseuse et la force nécessite l&#39;action concertée des ostéoblastes de la formation osseuse et les ostéoclastes de résorption osseuse 8,9. homéostasie osseuse est modifiée dans un certain nombre de maladies, y compris l&#39;ostéoporose post-ménopausique, dans lequel une activité accrue des ostéoclastes conduit à la perte pathogène de la masse osseuse et de la densité 10. Avec l&#39;augmentation de la disponibilité des modèles murins transgéniques de la maladie humaine, il n&#39;y a plus possibilité de déchiffrer le rôle des ostéoclastes dans la maladie de l&#39;os humain 11-13. De nombreux protocoles pour des techniques de culture d&#39;ostéoclastes apparaissent dans la littérature, avec de nombreuses variantes décrites 9,12,14. Xing et ses collègues décrivent une méthodologie similaire au protocole décrit ci-dessous, dans leur description de dosages ostéoclastogéniques à partir de cellules de la moelle osseuse de souris. Cependant, pour libérer les cellules de la moelle osseuse après la récolte des os longs, Xing et al. Vider la cavité médullaire d&#39;α-MEM milieu complet14. Catalfamo examine l&#39;effet de l&#39;hyperglycémie sur la fonction des ostéoclastes et décrit un procédé dans lequel toutes les cellules mobilisées rinçage de la moelle osseuse par des sont cultivées pendant 24 heures, après quoi les cellules non adhérentes sont éliminées 12, une technique également utilisée par Boyle et al . 9 Ces protocoles publiés précédemment nécessitent la pratique de la chasse d&#39;eau de la moelle osseuse, une pratique fastidieux, qui présente aussi le risque d&#39;une blessure par piqûre d&#39;aiguille et de la perte de valeur de la moelle osseuse, comme on doit couper les deux extrémités de l&#39;os. Le protocole, que nous décrivons, met en oeuvre l&#39;utilisation d&#39;un mortier et d&#39;un pilon pour isoler les ostéoclastes, qui est similaire à la méthode d&#39;isolement de macrophages décrit par Weischenfeldt 15 et al. Notre expérience, cependant, est que l&#39;isolement des ostéoclastes et la culture in vitro en utilisant les résultats des techniques déjà publiés dans les résultats variables en termes de production des ostéoclastes, ce qui entraîne souventune incapacité à cultiver les ostéoclastes. Par conséquent, nous avons mis au point un protocole qui permet l&#39;isolement compatible de moelle osseuse de souris pour produire un grand nombre d&#39;ostéoclastes multinucléés in vitro, avec un rendement approximatif de 70 à 80% des cellules plaquées initialement la formation d&#39;ostéoclastes et des macrophages par la suite, en présence de médias ostéoclastes à induction.

<table><tbody><tr><td>MEM, sans glutamine, sans rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF, souris recombinante</td><td>Gibco</td><td>PMC2044</td><td></td></tr><tr><td>souris recombinante TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli exprimé)</td><td>R& D Systems</td><td>462-TEC-010</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandine E2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase acide, Lekocyte (TRAP) kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Osteoassay Plaques de résorption osseuse, 24 plaques de puits</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3987</td><td></td></tr></tbody></table>

ostéoclastes dérivation de moelle osseuse de souris

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

<html> Les ostéoclastes sont des cellules hautement spécialisées qui sont dérivés de la lignée des monocytes / macrophages de la moelle osseuse. Leur capacité unique à se résorber à la fois les matrices organiques et inorganiques de l&#39;os signifie qu&#39;ils jouent un rôle clé dans la régulation de remodelage osseux. Ensemble, les ostéoblastes et les ostéoclastes sont responsables du processus de couplage dynamique qui implique à la fois la résorption osseuse et la formation osseuse agissant de concert pour maintenir le squelette normal pendant la santé et la maladie. Comme la cellule principale de résorption osseuse dans le corps, des changements dans la différentiation ou la fonction des ostéoclastes peuvent entraîner des effets profonds dans le corps. Les maladies associées à la fonction des ostéoclastes modifié peut varier dans la sévérité de la maladie néonatale létale due à l&#39;échec à former un espace de moelle pour l&#39;hématopoïèse, à des pathologies telles que l&#39;ostéoporose, dans lequel excessive résorption osseuse ostéoclastique prédispose aux fractures formation plus couramment observé. ent &quot;&gt; Une capacité à isoler les ostéoclastes en grand nombre in vitro a permis des avancées significatives dans la compréhension du cycle de remodelage osseux et a ouvert la voie à la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques qui luttent contre ces maladies. Ici, nous décrivons un protocole pour isoler et cultiver les ostéoclastes de moelle osseuse de souris qui donnera un grand nombre d&#39;ostéoclastes.

Le but de cette méthode est d'isoler facilement un grand nombre d'ostéoclastes in vitro, typiquement en une semaine. Isolation réussie d'un grand nombre d'ostéoclastes a été confirmée en utilisant la phosphatase acide tartrate de coloration résistant (Figure 1A). Pour les ostéoclastes sont visualisées en tant que grandes cellules pourpres avec de multiples noyaux (typiquement ≥ 3 noyaux). En utilisant ce protocole, il est fréquent d'isoler les ostéoclastes avec pas moins de 30 noyaux par les os...

Les ostéoclastes sont des cellules du capital de résorption osseuse dans le corps. Une capacité à isoler les ostéoclastes en grand nombre a conduit à des avancées significatives dans la compréhension de la biologie des ostéoclastes. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour l&#39;isolement, la culture et la quantification de l&#39;activité des ostéoclastes in vitro.

Ostéoclastes Dérivation de moelle osseuse de souris

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les ostéoclastes de la moelle osseuse de souris en grand nombre. Ceci est accompli en prélevant d’abord des os de souris euthanasiées. Ensuite, les cellules sont libérées de la moelle osseuse à l’aide d’un mortier et d’un pilon pour écraser les os dans un tampon de faits.Ensuite, la solution de moelle osseuse est superposée sur le milieu de séparation cellulaire à gradient de densité et la séparation cellulaire à gradient de densité est effectuée. Enfin, la couche contenant les cellules d’intérêt est aspirée et les cellules sont placées dans un milieu d’induction de microphages de moelle osseuse. En fin de compte, la coloration au piège est utilisée pour montrer la présence d’un grand nombre d’ostéoclastes.Les implications de cette technique s’étendent aux maladies associées à une fonction ostéoclastique altérée, dont la gravité peut varier d’une maladie néonatale mortelle due à l’incapacité de former un espace médullaire pour l’hématopoïèse à rencontrer plus fréquemment des pathologies telles que l’ostéoporose, car elle produit une méthode fiable pour isoler un grand nombre d’ostéoclastes de la moelle osseuse de souris. Pour commen

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Dans cette vidéo, nous démontrons l’isolement et la culture de cellules stromales de moelle osseuse à partir des os longs de souris. Les BMSC adhérents isolés peuvent être utilisés pour une analyse plus approfondie.

Isolement et culture de cellules stromales de moelle osseuse à partir d’un tibia de souris

La signalisation Notch est une forme de communication cellulaire qui repose sur le contact direct entre les cellules. Pour induire correctement la signalisation Notch in vitro, les ligands Notch doivent être présentés aux cellules dans un état immobilisé. Ce protocole décrit des méthodes de stimulation in vitro de la signalisation Notch chez les précurseurs d’ostéoclastes de souris.

Stimulation de Notch Signalisation dans Souris ostéoclastes Précurseurs

Ce protocole décrit le développement d’un in vitro humain modèle préclinique d’osteoclastogenesis de monocytes du sang périphérique, cultivées avec des lignées de cellules cancéreuses du sein pour imiter l’interaction cellule-ostéoclastes de cancer. Le modèle pourrait être utilisé pour approfondir nos connaissances de la formation de métastases osseuse et améliorer les options thérapeutiques.

Développement d’un humain modèle préclinique de Osteoclastogenesis de Monocytes du sang périphérique conjointement mis en culture avec des lignées cellulaires de Cancer du sein

Ce manuscrit décrit un protocole d’isolat et la culture les ostéoclastes in vitro de la moelle osseuse de souris et d’étudier le rôle de la cible mammifère/mécaniste de la rapamycine complexe 1 dans la formation des ostéoclastes.

Une base RANKL Osteoclast Culture dosage de moelle osseuse de souris pour enquêter sur le rôle de mTORC1 dans la Formation des ostéoclastes

Dans cet article, nous présentons des méthodes pour isoler et de différencier les cellules stromales de la moelle osseuse et de cellules souches hématopoïétiques des os longs de souris. Deux protocoles différents sont présentés agronomiques différentes populations cellulaires appropriées pour l’expansion et la différenciation dans les ostéoblastes, les ostéoclastes et les adipocytes.

Isolement, Culture et différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse et les ostéoclastes progéniteurs de souris

Le nombre de nouveaux biomatériaux conçus pour réparer les lésions osseuses importantes est en expansion continue dans le but d’améliorer la guérison osseuse et surmonter les complications associées à la transplantation osseuse. Nous présentons ici une stratégie multidisciplinaire pour les tests de biocompatibilité préclinique de biomatériaux pour la réparation osseuse.

Profil de compatibilité biologique sur les biomatériaux pour la régénération osseuse

Les ostéoclastes sont des polycaryons macrophages spécifiques aux tissus dérivés de la lignée monocyte-macrophages des cellules souches hématopoïétiques. Ce protocole décrit comment isoler les cellules de la moelle osseuse afin que de grandes quantités d’ostéoclastes soient obtenues tout en réduisant le risque d’accidents que l’on retrouve dans les méthodes traditionnelles.

Isolement, purification et différenciation des précurseurs d’Ostéoclast de la moelle osseuse de rat

Les ostéoclastes sont des cellules clés qui résorbent les os dans le corps. Ce protocole décrit une méthode fiable pour la différenciation in vitro des ostéoclastes des monocytes du sang périphérique humain. Cette méthode peut être utilisée comme un outil important pour mieux comprendre la biologie des ostéoclastes dans l’homéostasie et dans les maladies.

Différenciation des ostéoclastes fonctionnels des monocytes CD14+ du sang périphérique humain

Ce protocole présente la différenciation des ostéoclastes humains à partir des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) et décrit des méthodes de caractérisation des ostéoclastes et des précurseurs d’ostéoclastes.

Différenciation et caractérisation des ostéoclastes à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines

Le présent protocole décrit une méthode rentable pour purifier, étendre et caractériser des cellules souches mésenchymateuses (BMSC) de moelle osseuse hautement homogènes provenant de souris. Cette approche facilite l’acquisition de grandes quantités de BMSC à fort potentiel de prolifération et de différenciation, soutenant les modèles murins et faisant progresser la recherche préclinique.

Purification, expansion et phénotypage basé sur la cytométrie en flux de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse dérivées de souris

Le modèle de lésion de la moelle osseuse murine est un outil utile pour étudier l’ostéogenèse postnatale par ossification intramembraneuse. Ce protocole chirurgical simplifié décrit la procédure d’ablation de la moelle osseuse pour l’évaluation en aval de la formation de nouveaux os et des réponses cellulaires après une blessure.

Méthodologie améliorée pour l’étude de l’ostéogenèse postnatale par ossification intramembraneuse dans un modèle de lésion de la moelle osseuse murine

Apprenez à isoler des ostéoclastes à partir de la moelle osseuse de souris en grande quantité. Cette méthode utilise un gradient de densité pour séparer les cellules et permet d'étudier la biologie osseuse et les maladies associées.

Ostéoclastes Dérivation de moelle osseuse de souris

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