Une méthode Optogenetic pour contrôler et analyser les profils d’Expression génique dans les Interactions cellule-cellule

L’objectif global de cette expérience est d’observer le transfert d’informations oscillatoires de cellule à cellule par contrôle optogénétique et surveillance en direct de l’expression des gènes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la façon dont les cellules communiquent entre elles par la voie de signalisation Notch, en particulier sur la façon dont les cellules se transmettent l’information oscillatoire. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons contrôler et surveiller la dynamique de l’expression des gènes avec une très grande précision.

La démonstration de la procédure sera assurée par Akihiro Isomura, un chercheur de mon laboratoire qui a développé cette nouvelle technologie. Pour transfecter des vecteurs plasmidiques de modules optogénétiques basés sur Tol2 avec le vecteur d’expression de la transposase dans des cellules C2C12, comptez d’abord les cellules trypsinisées à l’aide d’un compteur de cellules. Plaque 50 000 cellules C2C12 par puits dans une plaque de 12 puits un jour avant la transfection.

Ensuite, co-transfectez 0,375 microgramme de vecteurs optogénétiques à base de Tol2, 0,125 microgramme d’un vecteur de sélection de médicament et 0,5 microgramme du vecteur d’expression de la transposase en utilisant le réactif de lipofection. Trypsinisez les cellules transfectées et plaquez-les dans des boîtes de culture de 100 millimètres un jour après la transfection. Remplacez le milieu de culture des cellules transfectées par un milieu de culture complété par 100 milligrammes par millilitre d’hygromycine.

Cultivez les cellules pendant trois jours pour éliminer les cellules non transfectées. Notez qu’un changement moyen n’est pas nécessaire. Ensuite, essayez de tester les cellules transfectées et purifiez une population de cellules exprimant des protéines fluorescentes pour la sélection en triant les cellules réceptrices et photosensibles, comme détaillé dans le protocole de texte.

Mettez en place deux types d’incubateurs avec ou sans sources lumineuses pour une condition induite par la lumière ou une condition sombre. Utilisez un posemètre pour régler l’intensité lumineuse d’un transilluminateur à LED bleues. Mesurez l’intensité lumineuse après avoir fermé la porte.

Programmez les horaires et la durée de l’éclairage en chargeant un script de commande sur un microcontrôleur monocarte qui permet des programmes d’éclairage programmables. Comptez les cellules trypsinisées à l’aide d’un compteur de cellules et plaquez 100 000 cellules émettrices photosensibles portant pAI218 et pAI170 sur des boîtes de culture en plastique de 35 millimètres de diamètre. Placez les plats dans des incubateurs séparés pour les conditions d’obscurité et de lumière.

Après avoir mis en place les plats, gardez les portes des incubateurs fermées jusqu’à ce que les lysats cellulaires soient recueillis. Un jour et demi après le placage, commencez l’éclairage de la lumière. N’exposez pas les cellules à une lumière incontrôlée pour éviter une photostimulation indésirable.

Alors, faites cette étape sans ouvrir la porte. Notez que l’ouverture de la porte ici n’est que pour la démonstration. Environ deux jours après le placage, déplacez les plats d’échantillon des incubateurs vers la glace à intervalles de 30 minutes et commencez la préparation des lysats cellulaires pour une analyse plus approfondie.

Pour surveiller les réponses cellulaires lors de la stimulation optique par PMT en temps réel, essayez d’abord de tester et de compter le nombre de cellules émettrices et réceptrices avec des méthodes standard. Préparez une suspension d’un millilitre d’un volume total de 25 000 cellules réceptrices et 125 000 cellules émettrices. Plaquez les cellules mixtes dans chaque puits de plaques noires à 24 puits avec un milieu de culture contenant de la luciférine d’un millimolaire.

Analysez les cellules d’un lecteur de plaques pour le test de luciférase afin de confirmer que les signaux de sortie ne sont pas trop élevés pour le système d’enregistrement. Ensuite, placez la plaque sur le système d’enregistrement et démarrez un programme d’enregistrement. Par exemple, démarrez l’éclairage de la lumière 18 heures après le réglage de l’enregistrement.

Pour l’imagerie en temps réel des réponses unicellulaires sous le contrôle de la perturbation optogénétique, placez d’abord 50 000 cellules réceptrices et 250 000 cellules émettrices sur des paraboles de 27 millimètres de diamètre. Assurez-vous que les rapports de mélange et le nombre total de cellules sont correctement ajustés. Un jour après le placage, remplacez le support par deux millilitres du support d’enregistrement.

Placez la parabole à base de verre sur un microscope inversé équipé d’une chambre environnementale à 37 degrés Celsius et de 5 % de dioxyde de carbone. Installez une caméra CCD refroidie. Assurez-vous que la température du capteur CCD est refroidie à la valeur de destination.

Définissez les paramètres de la fenêtre time-lapse multidimensionnelle dans le logiciel d’acquisition automatique pour capturer des images avec des intervalles de cinq minutes et plus de 288 fois. Dans la fenêtre time-lapse multidimensionnelle, sélectionnez un canal de luminescence. Assurez-vous que le mode de lecture est réglé sur le mode de lecture lente de 50 kilohertz, ce qui est essentiel pour réduire les bruits de lecture afin de détecter la lumière bioluminescente faiblement émettrice.

Dans la fenêtre time-lapse multidimensionnelle, sélectionnez les canaux de fluorescence. Assurez-vous que le mode de lecture est réglé sur le mode rapide d’un mégahertz pour réduire le temps nécessaire à l’imagerie de fluorescence. Enfin, réglez le binning deux par deux avec une exposition de 400 millisecondes.

Ensuite, sélectionnez un onglet de journal pour configurer des programmes afin de stimuler les cellules avec un éclairage périodique à la lumière bleue. Cliquez sur le bouton plus pour ajouter une nouvelle configuration de journal. Sélectionnez un fichier journal dans une boîte de journal, choisissez plusieurs points temporels et définissez des valeurs dans les zones de point initial et d’intervalle pour planifier la stimulation.

Assurez-vous que le fichier journal spécifié inclut des protocoles séquentiels pour la sélection de l’éclairage, de l’ouverture de l’obturateur, du délai, de la fermeture de l’obturateur et du délai. Ensuite, établissez des programmes pour stimuler les cellules avec un éclairage périodique à la lumière bleue. Enfin, démarrez l’enregistrement time-lapse en cliquant sur le bouton Acquérir.

Enfin, extrayez des traces unicellulaires de canaux de luminescence à partir de films en accéléré, comme décrit dans le protocole texte. Les résultats représentatifs des tests optogénétiques émetteur-récepteur sont présentés ici. Les cellules émettrices photo-inductibles ont produit des modèles oscillatoires d’expression du ligand Delta en présence d’un éclairage périodique de lumière bleue, comme prévu.

Lorsque les cellules réceptrices sont co-cultivées avec les cellules émettrices photosensibles et exposées à un éclairage lumineux répétitif, un système d’enregistrement de bioluminescence en temps réel détecte les réponses cycliques des cellules réceptrices dans diverses conditions de rapports de mélange. De plus, la microscopie time-lapse avec éclairage lumineux répétitif révèle également les réponses synchronisées des cellules réceptrices au niveau de la cellule unique. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer comment l’information dynamique de l’expression des gènes est transférée dans les interactions cellule-cellule.