Test de tolérance au Glucose intrapéritonéal, mesure de la fonction pulmonaire et la Fixation du poumon pour étudier l’Impact de l’obésité et des troubles du métabolisme sur résultats pulmonaires

L’objectif global des trois méthodes suivantes est d’étudier l’impact de l’obésité et des troubles métaboliques sur la structure et la fonction pulmonaires. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche respiratoire sur l’impact des troubles métaboliques sur la structure et la fonction pulmonaires. L’avantage de ces techniques est qu’elles peuvent être combinées pour évaluer le rôle fonctionnel du métabolisme sur la pathogenèse des maladies pulmonaires chroniques et pour tester différentes approches thérapeutiques.

Les implications de ces techniques vont au-delà du phénotypage pour élucider le rôle fonctionnel spécifique des cibles métaboliques dans la pathogenèse des maladies pulmonaires. Ces méthodes peuvent également être appliquées à l’étude de la structure et de la fonction chez les animaux sains présentant des modifications génétiques, mais aussi dans des modèles animaux de BPCO et d’asthme. Généralement, les personnes novices dans ces méthodes auront des difficultés car l’insertion du tube trachéal, l’insufflation du poumon et l’administration de l’anesthésie profonde, ils nécessitent tous de l’expérience et de la formation.

Nous avons d’abord eu l’idée de ces méthodes lorsque nous avons découvert que l’obésité précoce chez la souris mais aussi chez l’homme était intimement liée à l’impact métabolique et aux maladies pulmonaires chroniques au-delà de la petite enfance. Pour mesurer la tolérance au glucose intrapéritonéal, retenez doucement une souris adulte à jeun de 12 heures par la queue et utilisez des ciseaux stériles pour inciser le bout de la queue. Appliquez immédiatement une goutte de sang qui s’écoule librement sur la bandelette de test du lecteur de glycémie pour mesurer la glycémie à jeun.

Le résultat du test apparaîtra sur l’écran du glucomètre après quatre secondes. Après avoir mesuré le glucose de chaque animal, étiquetez-les individuellement avec des marqueurs colorés et pesez les animaux. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de calibre 27 attachée à une seringue d’un millilitre, on administre 100 microlitres de glucose par tonne de gramme de poids corporel à chaque animal par injection intrapéritonéale et on mesure la glycémie 15, 30, 60 et 120 minutes plus tard avec de nouvelles bandelettes de test, comme cela vient d’être démontré.

Pour évaluer la fonction pulmonaire, placez une souris adulte en position couchée sur un coussinet et appliquez une pommade sur les yeux de l’animal. Après avoir confirmé une absence de réponse au pincement des orteils, mouillez la fourrure dans la région thyroïdienne avec de l’éthanol à 70 % et utilisez une pince pour soulever la peau sur la ligne médiane entre l’encoche jugulaire du sternum et la symphyse des tubercules du mentum. À l’aide de ciseaux émoussés, faites soigneusement une incision cutanée d’un centimètre dans la peau de la tente pour visualiser le tissu adipeux sous-cutané sous-jacent et la glande thyroïde et exposez la trachée avec une séparation contondante soigneuse des deux lobes thyroïdiens au niveau de l’isthme et une dissection des muscles sternothyroïdiens et sternothyroïdiens.

À l’aide d’une pince tranchante, passez une suture chirurgicale tressée 4-0 entre la trachée et l’œsophage et incisez soigneusement la trachée en fermant le larynx entre les cartilages trachéaux avec des microciseaux. Intuber avec un tube trachéal fixant le tube avec une suture chirurgicale et déplacer l’animal vers le lit chauffé d’une chambre corporelle. Connectez le tube trachéal à la plaque frontale et allumez le ventilateur.

Confirmez le mouvement du thorax en même temps que le taux de ventilation pour confirmer le bon placement de la sonde trachéale et observez le signal de pression sur l’écran de l’ordinateur. Pour contrôler les changements de pression transpulmonaire pendant la ventilation, insérez un tube œsophagien au niveau des poumons qui regardent l’écran afin de faciliter le placement du tube là où la déviation maximale de la pression et les artefacts cardiaques minimaux peuvent être observés. Commencez l’acquisition des données selon les instructions du fabricant et appliquez 10 microlitres de PBS sur le nébuliseur.

Commencer la nébulisation après cinq minutes d’acclamation, suivie d’une phase de réponse de trois minutes au cours de laquelle la résistance des voies respiratoires et la compliance du système respiratoire sont mesurées. Laissez l’animal récupérer pendant trois minutes avant de commencer la nébulisation suivante et suivez les instructions du logiciel pour l’application par étapes de concentrations croissantes de 10 microlitres de méthacholine sur le ventilateur. Pour l’analyse histomorphométrique quantitative du tissu pulmonaire, utilisez des ciseaux émoussés pour faire une petite incision dans le diaphragme d’une souris adulte et utilisez des ciseaux émoussés incurvés pour faire une incision péristernale sur toute la longueur de la cage thoracique pour ouvrir doucement le thorax.

Soulevez la cage thoracique pour exposer la cavité pleurale et retirez le thymus. Après avoir retiré le cœur, utilisez des pinces tranchantes pour préparer et exposer la trachée afin de passer une suture chirurgicale tressée 4-0 entre la trachée et l’œsophage, suivie d’une incision soigneuse de la trachée près du larynx entre les cartilages trachéaux. Intubez avec une canule intraveineuse de calibre 26 et utilisez un agent fixateur pour gonfler les poumons en fixant la pression à une pression constante de 20 centimètres d’eau.

Après 30 minutes à température ambiante, ligaturez la trachée et retirez la canule en même temps. Ensuite, excisez soigneusement les poumons sans endommager les tissus et stockez les poumons dans un agent fixateur frais à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Les souris obèses présentent une augmentation des taux de glucose sérique 15 et 30 minutes après l’injection intrapéritonéale de glucose, indiquant une altération de l’absorption cellulaire du glucose par rapport aux souris nourries avec un régime standard.

L’analyse invasive de la fonction pulmonaire montre une augmentation jusqu’à 1,5 fois de la résistance des voies respiratoires chez les souris obèses et riches en graisses après stimulation par la méthacholine par rapport aux animaux témoins. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine des sections du parenchyme pulmonaire après l’installation intratrachéale révèle de multiples zones non gonflées, des septa alvéolaires épais et des alvéoles de forme polygonale dans les poumons instillées avec trop peu de pression. En revanche, une pression d’instillation trop élevée conduit à des zones surgonflées avec des septa alvéolaires détruits.

L’application de la quantité appropriée de pression lors de la fixation pulmonaire conduit cependant à un poumon complètement gonflé avec des alvéoles de forme ronde. Une fois maîtrisés, les tests de tolérance au glucose intrapéritonéale peuvent être réalisés en deux heures et demie. Les tests de la fonction pulmonaire peuvent être terminés en une heure, et l’insufflation pulmonaire peut être terminée en moins d’une heure.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que l’adaptation des souris, la formation de l’enquêteur et le travail dans un environnement calme et moins stressé sont tous recommandés pour une acquisition optimale des données. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines du métabolisme et des maladies respiratoires pour explorer les mécanismes impliqués et la potentialisation des stratégies de traitement des maladies pulmonaires chroniques à l’aide de petits modèles animaux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier l’impact de l’obésité et des troubles métaboliques sur la structure et la fonction pulmonaires.

N’oubliez pas que le travail avec des animaux ou des instruments chirurgicaux peut provoquer des blessures ou des réactions cutanées et que des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle approprié doivent toujours être prises lors de l’exécution de ces procédures.