Ingénierie des surfaces des îlots pancréatiques avec un nanorevêtement StarPEG hépariné

Cette méthode peut aider à résoudre les principaux défis de la transplantation d’îlots pancréatiques, tels que l’immuno-rejet, la revascularisation des îlots pancréatiques après la transplantation et la survie. Le principal avantage de cette technique est que cette approche facile à adopter permet l’ingénierie de surface des cellules vivantes en remodelant le paysage cellulaire des îlots pancréatiques, ce qui améliorera la fonction du greffon, la survie et, en fin de compte, l’efficacité thérapeutique de la transplantation d’îlots. Les implications de cette technique s’étendent aux thérapies cellulaires, car les résultats thérapeutiques des thérapies cellulaires sont également limités par une faible rétention cellulaire et une faible survie.

La démonstration de cette procédure est faite par Jingyi Yang, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Tout d’abord, pesez 6,9 grammes d’héparine et dissolvez-le dans 2 millilitres d’eau déminéralisée glacée dans un tube Eppendorf. Dissoudre 0,23 gramme de NHS dans 0,5 millilitre d’eau déminéralisée glacée dans un tube Eppendorf.

Ensuite, dissolvez 0,77 gramme d’EDC dans 0,5 millilitre d’eau déminéralisée glacée dans un tube conique de 50 millilitres. Mélangez les solutions NHS et EDC dans un tube conique de 50 millilitres. Après avoir laissé la solution mélangée à température ambiante pendant 30 minutes, centrifugez-la à 12 000 tr/min pendant 10 minutes pour éliminer l’excès d’EDC et de NHS.

Ensuite, ajoutez 30 millilitres d’éthanol froid à la solution et centrifugez à 12 000 tr/min pendant 10 minutes. Maintenant, ajoutez 1 millilitre de 10 % starPEG MI aid à un tube conique de 50 millilitres. Ajoutez ensuite 0,67 millilitre de solution d’héparine NHS à 10 % dans le même tube conique de 50 millilitres.

Placez la solution mélangée dans un incubateur à 25 degrés Celsius pendant 20 minutes pour obtenir une solution claire et visqueuse. Cueillir à la main 200 îlots de souris précédemment extraits sous un microscope de dissection et les transférer dans un tube de 1,5 millilitre. Ajoutez 500 microlitres de PBS dans les îlots et centrifugez à 1 200 tr/min pendant une minute à quatre degrés centigrades.

Retirez le surnageant, ajoutez 250 microlitres de la solution d’héparine PEG et placez le mélange sur de la glace pendant 10 minutes. Pipette de haut en bas pour permettre aux îlots de bien se mélanger avec la solution d’héparine PEG. Ensuite, centrifugez le mélange à 1 200 tr/min pendant une minute.

Ensuite, retirez le surnageant et ajoutez 500 microlitres de PBS. Pipeter de haut en bas pour bien mélanger. Après une centrifugation à 1 200 tr/min pendant une minute, retirez le surnageant et conservez les îlots pour une utilisation ultérieure.

Ensuite, ajoutez un à deux millilitres de RPM I 1640, complété par 10 % FBS aux îlots revêtus. Et transférez ces îlots dans une boîte de culture bactérienne stérile non chargée. Enfin, observez la morphologie et les signaux fluorescents des îlots recouverts de FAM-Héparine-PEG sous un microscope à fluorescence inversée.

Des pics d’héparine caractéristiques, correspondant aux groupes HYDROXAL, ont été observés dans le spectre FTIR de nanorevêtement héparine-PEG. La diminution de l’amplitude de ces pics représente la conjugaison entre les groupes amide étoile-PEG MI et le groupe carbonal héparine. Le pic correspondant à la vibration d’étirement de l’amide carbonal a également été réduit, indiquant une réaction suffisante entre les groupes carboxylate d’héparine avec le suxsonate de succynimidal et l’amine d’aide MI en étoile.

Les données d’une microscopie électronique montrent la structure poreuse hautement interconnectée du nanorevêtement d’héparine-PEG, ce qui suggère qu’il pourrait convenir à la survie cellulaire lors de l’administration in vivo. Une mince couche de nano-revêtement, illustrée par une fluorescence verte, a été déposée uniformément à la surface des îlots revêtus, sans provoquer de changements évidents sur le volume ou la taille des îlots. Des îlots de souris recouverts d’héparine et de PEG ont montré une viabilité robuste des îlots en culture.

Une formation vasculaire significativement plus avancée était évidente à partir des cellules endothéliales des îlots pancréatiques qui ont été co-cultivées avec des îlots recouverts d’héparine-PEG, indiquée par des structures allongées ressemblant à des micro-vaisseaux et des structures vasculaires en forme de réseau. Un faible niveau de sécrétion d’insuline a été observé dans tous les groupes de traitement lorsque les îlots ont été perfusés avec une solution saline physiologique, complétée par un niveau sous-stimulant de glucose. Lorsque les îlots ont été stimulés avec un niveau super-physiologique de glucose, une augmentation de la sécrétion d’insuline a été observée.

Une fois maîtrisé, l’enrobage peut être réalisé en une minute s’il est effectué correctement pour préserver la viabilité des îlots.