Name: Ingénierie des surfaces des îlots pancréatiques avec un nanorevêtement StarPEG hépariné (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Découvrez l'ingénierie de surface des îlots pancréatiques avec un nanorevêtement héparine-starPEG. Cette technique améliore la survie et la fonction des greffons pour les thérapies cellulaires.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nous sommes reconnaissants pour le soutien financier du Fonds National des sciences naturelles de Chine (31770968) et la Tianjin Research Programme d’Application Foundation and Advanced Technology (17JCZDJC33400).

1. fabrication de Charte héparine Starpeg nanorevêtement
<ol><li>
Synthèse du succinate de succinimidyl héparine (héparine-NHS)
	<ol>
<li>Peser 0,69 g d’héparine et dissoudre dans 2,0 mL d’eau désionisée glacee.</li>
		<li>Peser de 0,23 g du NHS et les dissoudre dans 0,5 mL d’eau désionisée glacée dans un ballon à fond rond.</li>
		<li>Peser avec 0,77 g d’EDC et dissoudre dans 0,5 mL d’eau désionisée glacée dans un ballon à fond rond.</li>
		<li>Mélanger les solutions NHS et EDC dans un ballon à fond rond. Laisser la solution mélangée sur le banc à température ambiante pendant 30 min à température ambiante.</li>
		<li>Centrifuger le mélange EDC NHS à 5 031 x g pendant 10 min enlever l’excès EDC et NHS.</li>
		<li>Ajouter 30 mL d’éthanol froid à la solution de mélange et centrifuger à 5 031 x g pendant 10 min.<ol>
<li>Répéter deux fois.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation du starPEG-héparine nanorevêtement
	<ol>
<li>Ajouter 1,0 mL de 10 % (p/v) starPEG-(NH2)8 à un ballon à fond rond.</li>
		<li>Ajoute le même ballon à fond rond de 0,67 mL d’héparine-NHS de 10 % (p/v).</li>
		<li>Placer la mélange de la solution de starPEG-(NH2)8 et héparine-NHS dans une étuve à 25 ° C pendant 20 min obtenir une solution claire avec la viscosité. Remarque : Pour des expériences dans lesquelles il fallait fluorescent étiqueté héparine (héparine-FAM), la procédure de fabrication est le même sauf que l' étoile du (NH2) - PEG -8 a été dissoute dans l’eau désionisée additionné de 5 (6)- carboxyfluorescéine N- succinimidyl ester 0,1 % (rapport molaire) de starPEG-(NH2)8. )</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caractérisation de l’héparine-PEG nanorevêtement par spectroscopie infrarouge transformer de Fourier (FT-IR)
	<ol>
<li>Avant de commencer, rincer l’appareil agate de mortier, Pilon et enrobage (petits disques avec diamètre de 13 mm) avec l’acétone et de l’eau désionisée. Sécher la verrerie dans un four avant utilisation.</li>
		<li>Mélanger environ 0,1 et 1 % l’échantillon héparine-PEG avec 200 à 250 mg de poudre fine de KBr.</li>
		<li>Placez l’héparine-PEG et mélange de KBr dans le mortier d’agate et pulvériser finement en petits granules de 2 µm de diamètre.</li>
		<li>Transférer le mélange dans un dispositif de granulation. Exercez une force haute compression (8 T/cm2) dans le vide pendant 1 à 2 min former des boulettes transparentes.</li>
		<li>Tirez doucement les boulettes échantillon de l’appareil de granulation. Veillez à ne pas tirer trop fort afin de ne pas engager des fissures.</li>
		<li>Transférer les boulettes d’échantillon avec beaucoup d’attention à un Spectroscope infrarouge transformer de Fourier pour déterminer la structure chimique de l’échantillon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Examen des structures poreuses internes d’héparine-PEG nanorevêtement par microscopie électronique numérisée (SEM)
	<ol>
<li>Pour les procédures suivantes, préparer les pipettes et plaque de culture cellulaire standard de 48 puits.</li>
		<li>Pipetter, la solution de copolymère de l’héparine-PEG dans les puits d’une plaque de 48 puits de culture.</li>
		<li>Geler la plaque à-80 ° C pendant 24 h.</li>
		<li>Lypophilize les échantillons à-50 ° C dans l’environnement sous vide (0,1 Pa) pendant 24 h.</li>
		<li>Répartis échantillons sur la surface collante d’un talon aluminium.</li>
		<li>Enrober les échantillons d’or et d’observer en microscopie électronique numérisée d’observer les structures poreuses internes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Examen de la surface de nanorevêtement héparine-PEG par microscopie à force atomique (AFM)
	<ol>
<li>Nettoyez les lames de verre de silice avec solution de piranha (70 % H2SO4, 30 % H2O2) à 80 ° C pendant 40 min.</li>
		<li>Laisser agir les diapositives dans le méthanol pendant 10 min, puis dans le toluène pendant 10 min.</li>
		<li>Sécher les diapositives de séchage sous vide.</li>
		<li>Laver les diapositives avec beaucoup 3-aminopropyl-triéthoxysilane solution (2 % dans le toluène), remuez délicatement.</li>
		<li>Laisser agir les diapositives dans le méthanol pendant 10 min puis dans le toluène pendant 10 min.</li>
		<li>Place 100 µL de solution d’héparine-PEG de 3 % sur toute la surface des lames à l’aide d’une pipette standard.</li>
		<li>Examiner la surface de l’héparine-PEG sous un microscope à force atomique (une fréquence de résonance de 50 à 80 kHz, la force constante de 0,350 N m 21, rayon de pointe de 600 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. souris îlot ingénierie des surfaces avec l’héparine-PEG nanorevêtement
<ol><li>
Revêtement de surface îlot souris avec héparine-PEG nanorevêtement
	<ol>
<li>Extraire les îlots de souris par purification gradient collagénase digestion et histopaque, comme indiquée précédemment dans la JoVE19.</li>
		<li>Cueillir à la main 200 îlots sous un microscope à dissection d’un tube de 1,5 mL.</li>
		<li>Ajouter 500 µL de PBS aux îlots et centrifuger à 503 x g pendant 1 min.</li>
		<li>Décoller le surnageant et ajouter 250 µL de la solution de l’héparine-PEG et garder le mélange sur la glace pendant 10 min. Pipette de haut en bas pour permettre des îlots de mélanger bien avec la solution de l’héparine-PEG.</li>
		<li>Centrifuger à 503 x g pendant 1 min.</li>
		<li>Retirez le surnageant et ajouter 500 µL de PBS. Pipetter en haut et en bas pour bien mélanger.</li>
		<li>Centrifuger à 503 x g pendant 1 min et retirer le surnageant et garder les îlots pour une utilisation ultérieure. Pour l’examen des îlots de souris revêtus de l’héparine-PEG, FAM-héparine-PEG a été utilisé pour revêtement îlot, procédez comme suit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Examen des îlots de souris recouvert le nanorevêtement FAM-héparine-PEG
	<ol>
<li>Ajouter 1 à 2 mL de RPMI 1640 additionné de sérum de veau fœtal de 10 % aux îlots couchés et transférer ces îlots dans une boite de culture bactérienne stérile non chargée.</li>
		<li>Observer les signaux de morphologie et de la fluorescence des îlots de FAM-héparine-PEG nanorevêtement enduit sous un microscope à fluorescence inversé.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fonction d’héparine-PEG enduit îlots de souris par rapport aux îlots Non couché
<ol><li>
Viabilité de l’héparine-PEG enduit îlots de souris
	<ol>
<li>Cueillir à la main 20 des îlots héparine-PEG enduit souris et placez-les dans un puits d’une plaque de culture de cellules de 96 puits.</li>
		<li>Remplir un total de 10 puits de 20 îlots de souris héparine-PEG enduit pour chaque puits.</li>
		<li>Cueillir à la main 20 des îlots de contrôle noncoated et rangez-les dans un puits de la plaque de culture cellulaire de 96 puits même.</li>
		<li>Remplir un total de 10 puits de 20 îlots de contrôle noncoated pour chaque puits.</li>
		<li>200 µL de milieu RPMI 1640 additionné de sérum de veau fœtal 10 % dans chaque puits de la plaque à 96 puits contenant des îlots de mettre et maintenir en culture pendant 14 jours.</li>
		<li>Remplacer les milieux de culture îlot tous les 2 jours.</li>
		<li>Traiter les îlots avec un live/dead kit de coloration à la fin des 14 jours de culture et observé sous un microscope à fluorescence inversé.</li>
		<li>Compter les cellules PI+ (rouge) au sein de chaque îlot sous un microscope à fluorescence inversé.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Revascularisation de l’héparine-PEG enduit îlots de souris in vitro
	<ol>
<li>Refroidir préalablement tous les plastiques expérimentaux, y compris la plaque de culture et pipette conseils au moins 12 heures avant utilisation.</li>
		<li>Placer un endroit 24 puits sur un bloc de refroidissement. Ajouter 250 µL de glace froid Matrigel réduite en facteur de croissance dans chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits. Placer la plaque 24 puits couchée à 4 ° C pendant au moins 30 min.</li>
		<li>Alors que la solution de matrice est mise dans le réfrigérateur, trypsinize les cellules endothéliales de Mile Sven 1 (MS1) souris îlots pancréatiques.<ol>
<li>Supprimer tous les milieux de culture du flacon de culture de tissus. Rincer le ballon avec 5 mL de PBS.</li>
			<li>Retirer le PBS et ajouter 3 mL d’EDTA-trypsine. Incuber à 37 ° C pendant 3 min dans un incubateur standard.</li>
			<li>Taper légèrement le fond du flacon pour détacher les cellules et ajouter 5 mL de milieu additionné de sérum.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Recueillir les cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL et centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Décoller le surnageant et ajouter 5 mL de PBS. Pipetter en haut et en bas pour bien mélanger.</li>
		<li>Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min et décoller le surnageant.</li>
		<li>Ajouter le milieu DMEM additionné de sérum dans le tube et 50 000 cellules des graines dans chaque puits de la plaque 24 puits matrice-solution-enduit.</li>
		<li>Ajouter 5 îlots héparine-PEG enduit ou îlots de contrôle noncoated dans chaque puits.</li>
		<li>Ajouter le milieu DMEM additionné de sérum dans chaque puits pour un total de 500 µL / puits.</li>
		<li>Observez la formation du tube après une incubation de 4h et 24h sous un microscope optique.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sécrétion d’insuline stimulée par le glucose des îlots d’héparine-PEG enduit Remarque : Pour déterminer si nanorevêtement aurait une incidence sur la fonction des îlots de souris, la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose d’héparine-PEG enduite et d’îlots noncoated a été évaluée.<ol>
<li>Cueillir à la main 30 îlots héparine-PEG enduit ou îlots de contrôle noncoated dans un tube de 1,5 mL. Préparer un total de 10 tubes pour les enduits îlots et îlots noncoated chaque.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de solution saline physiologique additionnée de 2 mmol/L de glucose20 et incuber à 37 ° C pendant 2 h. Remarque : Pour la recette de la solution saline physiologique, reportez-vous au tableau 1. Garder le chapeau de tubes lâche pendant l’incubation dans l’incubateur.</li>
		<li>Eliminez autant solution que possible.</li>
		<li>Stimuler les îlots en ajoutant 600 µL de solution saline physiologique additionné de 20 mmol/L de glucose à 37 ° C pendant 30 min.</li>
		<li>Recueillir 200 µL de surnageant de chaque tube pour dosage ELISA utilisant une insuline commerciale ELISA kit d’insuline.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrin-1+ameliorates+myocardial+infarction-induced+myocardial+injury%3A+mechanisms+of+action+in+rats+and+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Netrin-1 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury: mechanisms of action in rats and diabetic mice.</a> Hum Gene Ther. 25 (9), 787-797 (2014).</li>
<li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-transplantation+of+skin-derived+precursors+and+collagen+sponge+facilitates+diabetic+wound+healing+by+promoting+local+vascular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Co-transplantation of skin-derived precursors and collagen sponge facilitates diabetic wound healing by promoting local vascular regeneration.</a> Cell Physiol Biochem. 37 (5), 1725-1737 (2015).</li>
<li>Saxon, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+engineering+by+a+modified+Staudinger+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction.</a> Science. 287 (5460), 2007-2010 (2000).</li>
<li>Sarkar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+cell+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engineered cell homing.</a> Blood. 118 (25), 184-191 (2011).</li>
<li>Kato, M., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rewiring+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Rewiring cell adhesion.</a> J Am Chem Soc. 126 (21), 6504-6505 (2004).</li>
<li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+membrane+engineering+for+cell+rolling+using+peptide+conjugation+and+tuning+of+cell-selectin+interaction+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stem cell membrane engineering for cell rolling using peptide conjugation and tuning of cell-selectin interaction kinetics.</a> Biomaterials. 33 (20), 5004-5012 (2012).</li>
<li>Merzaban, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+glycan+engineering+of+neural+stem+cells+augments+neurotropism+and+improves+recovery+in+a+murine+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Cell surface glycan engineering of neural stem cells augments neurotropism and improves recovery in a murine model of multiple sclerosis.</a> Glycobiology. 25 (12), 1392-1409 (2015).</li>
<li>Silvescu, C. I., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-CSF+induces+membrane+expression+of+a+myeloperoxidase+glycvariant+that+operates+as+an+E-selectin+ligand+on+human+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">G-CSF induces membrane expression of a myeloperoxidase glycvariant that operates as an E-selectin ligand on human myeloid cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10696-10701 (2014).</li>
<li>Zhi, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+bioactive+multilayered+nanocoatings+on+pancreatic+islet+cells%3A+incorporation+of+alpha1-antitrypsin+into+the+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Assembly of bioactive multilayered nanocoatings on pancreatic islet cells: incorporation of alpha1-antitrypsin into the coatings.</a> Chem Commun (Camb). 51 (53), 10652-10655 (2015).</li>
<li>Lou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+surface+bioengineering+with+a+heparin-incorporated+starPEG+nanofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C+Mater+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet surface bioengineering with a heparin-incorporated starPEG nanofilm.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 78, 24-31 (2017).</li>
<li>Orlando, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+replacement+strategies+aimed+at+reconstitution+of+the+beta-cell+compartment+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Cell replacement strategies aimed at reconstitution of the beta-cell compartment in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 63 (5), 1433-1444 (2014).</li>
<li>Kollmer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+function+of+alginate-encapsulated+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Long-term function of alginate-encapsulated islets.</a> Tissue Eng Part B Rev. 22 (1), 34-36 (2015).</li>
<li>Yang, H. K., Yoon, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+encapsulated+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Diabetes+Complications%22%5BJournal%5D)">Current status of encapsulated islet transplantation.</a> J Diabetes Complications. 29 (5), 737-743 (2015).</li>
<li>Kizilel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+pancreatic+islets+with+nano-thin+functional+polyethylene+glycol+coatings+for+enhanced+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of pancreatic islets with nano-thin functional polyethylene glycol coatings for enhanced insulin secretion.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2217-2228 (2010).</li>
<li>Zhi, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-scale+encapsulation+enhances+allograft+survival+and+function+of+islets+transplanted+in+a+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Nano-scale encapsulation enhances allograft survival and function of islets transplanted in a mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 55, 1081-1090 (2012).</li>
<li>Gattas-Asfura, K. M., Stabler, C. L. Layer-by-layer deposition of antifouling coatings on stainless steel via catechol-amine reaction. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5, 9964-9974 (2013).</li>
<li>Kollmer, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26414084">Long-term function of alginate-encapsulated islets.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 22 (1), 34-46 (2015).</li>
<li>Yang, H. K., Yoon, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+encapsulated+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Diabetes+Complicat%22%5BJournal%5D)">Current status of encapsulated islet transplantation.</a> J. Diabetes Complicat. 29, 737-747 (2015).</li>
<li>Zmuda, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096(2011).</li>
<li>Gey, G. O., Gey, M. K. <a target="_blank" href="http://cancerres.aacrjournals.org/content/27/1/45">The maintenance of human normal cells and tumor cells in continuous culture. I. Preliminary report: Cultivation of mesoblastic tumors and normal tissue and notes on methods of cultivation.</a> Am. J. Cancer. 27, 45-76 (1936).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-selective+azide+incorporation+into+endogenous+RNase+A+via+a+%22chemistry%22+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Site-selective azide incorporation into endogenous RNase A via a "chemistry" approach.</a> Org. Biomol. Chem. 11, 353-361 (2013).</li>
<li>Cabric, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anchoring+of+vascular+endothelial+growth+factor+to+surface-immobilized+heparin+on+pancreatic+islets%3A+implications+for+stimulating+islet+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Anchoring of vascular endothelial growth factor to surface-immobilized heparin on pancreatic islets: implications for stimulating islet angiogenesis.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 961-970 (2010).</li>
<li>Cabric, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+surface+heparinization+prevents+the+instant+blood-mediated+inflammatory+reaction+in+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Islet surface heparinization prevents the instant blood-mediated inflammatory reaction in islet transplantation.</a> Diabetes. 56, 2008-2015 (2007).</li>
<li>Asif, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparinization+of+cell+surfaces+with+short+peptide-conjugated+PEG-lipid+regulates+thromboinflammation+in+transplantation+of+human+MSCs+and+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Heparinization of cell surfaces with short peptide-conjugated PEG-lipid regulates thromboinflammation in transplantation of human MSCs and hepatocytes.</a> Acta Biomater. 35, 194-205 (2016).</li>
<li>Teramura, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23347835">Microencapsulation of cells, including islets, within stable ultra-thin membrane of maleimide-conjugated PEG-lipid with multifunctional crosslinkers.</a> Biomaterials. 34 (11), 2683-2893 (2013).</li>
<li>Zhi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+nanoencapsulation%3A+A+nanomedicine+technology+for+diabetes+research+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Res.+Clin.+Pract%22%5BJournal%5D)">Multilayer nanoencapsulation: A nanomedicine technology for diabetes research and management.</a> Diabetes Res. Clin. Pract. 100, 162-169 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans cet article, nous démontrons une approche « facile à adopter » pour une vie surface de la cellule ingénierie un nanorevêtement starPEG héparine-constituée par l’intermédiaire de pseudo-bioorthogonal chimie entre les groupes N- hydroxysuccinimide le nanorevêtement et le groupes d’îlots pancréatiques de surface membranaire. En effet, les groupes aminés dans les membranes cellulaires sont très réactives, et ainsi, les études antérieures ont signalé des interactions entre des groupes aminés primaires avec activés N- hydroxysuccinimidyl (NHS) ester dans des conditions physiologiques14 ,16,21. En outre, des recherches approfondies a signalé que l’incorporation d’héparine, un glycosaminoglycane fortement sulfatée et une composante importante de la matrice extracellulaire, au cours de l’encapsulation de l’îlot, pourrait conduire à améliorée après la transplantation revascularisation et réduit IBMIR22,23. Compte tenu des propriétés MULTIVALENTES d’héparine et la biocompatibilité de PEG, nous avons utilisé PEG 8 bras héparine maximale de chargement au cours de la fabrication de la nanorevêtement. L’héparine a été modifiée avec -NHS, qui réagirait par la suite avec les groupes de2 -NH sur la membrane de cellules d’îlot. En permettant la formation de liaisons covalentes entre -NH2 (de la membrane cellulaire) et -LHN de la Hep-PEG, les îlots seraient facilement « revêtir » par l’héparine-incorporé PEG, formant ainsi une couche de nano-mince (nanorevêtement) sur la surface extérieure de la pancréatique îlots.
L’approche actuelle est différente des méthodes publiées antérieurement qu’également choisi PEG polymère majeur pour la microencapsulation îlot dans cette pseudo-bioorthogonal réaction chimique entre le -NHS (de la nanorevêtement) et -NH2 de la cellule d’îlot membrane a été utilisé. Considérant que la stabilité de l’îlot/cellule revêtement, surtout dans un environnement complex, tels que le plasma, est crucial à la revascularisation après la transplantation et la survie, la formation entre -NHS et -NH2 serait plus stable par rapport à interaction hydrophobe entre PEG et membrane cellulaire24, interactions électrostatiques9,15,24,25,26 ou un lien biologique entre biotine streptavidine14.
En outre, contrairement à l’îlot approche de revêtement qui s’appuie sur l’approche LBL avec période de manutention îlot prolongé pour dépôt de couches multiples14,16,25, la technique présente également nécessite un minimum traitement et très courte période de revêtement des îlots isolés. Ces deux facteurs sont essentiels pour la survie de l’îlot après la transplantation viabilité îlots étant souvent déjà compromis isolation îlot suivant en raison de l’ECM endommagé au cours de la digestion enzymatique. Cependant, une des limites de l’approche actuelle sont que, contrairement à LBL, via lequel l’épaisseur de l’enduit extérieur pourrait être contrôlée en augmentant ou en réduisant le nombre de dépôt de couches, épaisseur de la Hep-PEG nanorevêtement ne peut pas être adapté pour le moment.
En outre, en raison de l’affection bénigne lorsqu’une réaction chimique entre le NHS - et -NH2 a lieu, l’approche actuelle est applicable aux cellules vivantes surface n'ingénierie pas limité à des îlots pancréatiques, mais la plupart de thérapie cellulaire. En outre, étant donné que l’héparine est connu pour interagir avec une gamme de cytokines et de molécules biologiquement actives, la Hep-PEG nanorevêtement présente également une plate-forme ouverte qui a le potentiel pour l’incorporation de médiateurs biologiques illimités ainsi que interfaces pour l’ingénierie des surfaces cellulaires plus complexe.

L’efficacité thérapeutique des thérapies à base cellulaire est limitée par la rétention cellulaire faible et faible taux de survie1,2. Afin d’améliorer les résultats de thérapies cellulaires, ingénierie de surface par l’intermédiaire de manipulation enzymatique de la cellule, la conjugaison de peptide, bioorthogonal chimie et physique encapsulation avec biomatériaux a été exploité3,4, 5,6,7,8,9,10. Le protocole actuel vise à réaliser l’ingénierie des surfaces des cellules vivantes, utilisant une méthode « facile à adopter » en appliquant un nanorevêtement ultraminces starPEG incorporé à l’héparine (héparine-PEG) à la surface des cellules. Ingénierie des surfaces des îlots pancréatiques a été présenté ici à titre d’exemple, en raison du caractère hétérogène des îlots de Langerhans et les conclusions désobligeantes de la transplantation d’îlots clinique actuelle.
En effet, la transplantation d’îlots clinique est actuellement effectuée par injection directe des îlots isolés dans la veine porte hépatique et cette procédure n’est disponible pour les patients sélectifs en raison de la rareté des matériaux de donateurs et de la faible efficacité thérapeutique 11. classiquement, alginate a été le plus couramment utilisé biomatériau pour encapsulation de l’îlot et modification de la surface, même s’il est loin d’être idéale en raison de l’instabilité chimique de l’alginate et fibrose inflammatoires12, 13. En outre, par rapport à la taille naturelle des îlots qui varie entre 100 à 200 µm, les microcapsules d’alginate-îlot sont plus grandes, variant entre 400 et 800 µm, qui excède la distance de diffusion physiologique de l’oxygène. Encapsulation de l’îlot conforme, c'est-à-dire., encapsulation d’îlots sans modification notable du volume de l’îlot, a été ensuite mis au point. Ainsi, les dépôts des nanomembranes composé de PEG, tétrafluoroéthylène, membrane de silicone ou nanorevêtement multicouche (également connu sous le nom la technique « couche par couche » [LBL]) a été signalée, résultant en une amélioration in vitro de survie îlot14 ,15,16,17,18, bien que la LBL approchent souvent nécessite de vastes îlots remise période pour le dépôt de plusieurs couches, ce qui peut compromettre la viabilité de l’îlot . En outre, l’instabilité des nanomembranes qui repose sur des interactions électrostatiques ou covalentes entre couches de biomembrane ou d’interactions hydrophobes entre nanomembranes et la surface de l’îlot soulève également des préoccupations9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
Un autre facteur limitant qui encombre les résultats thérapeutiques de la transplantation d’îlots intraporte est l’instant induite par le sang une réaction inflammatoire (IBMIR) causée par le contact direct des îlots implantés avec le sang, ce qui entraîne l’agrégation plaquettaire, coagulation et immunitaire préjudiciable ou indésirable activation cellulaire9. Pour résoudre ces problèmes, un nanorevêtement ultra-mince composé de polyéthylèneglycol en forme d’étoile (starPEG) a été préparé pour sa biocompatibilité établie et la polyvalence comme îlot matériau du boîtier. L’héparine, un glycosaminoglycane fortement sulfatée, a également été incorporé dans le nanorevêtement starPEG pour ses propriétés anti-inflammatoires, anti-coagulants et aptitude à faciliter la vascularisation en recrutant des pro-angiogénique facteurs de croissance22, 23.

<table><tbody><tr><td><Réactif >fort</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>AAJ207798</td><td></td></tr><tr><td>Streptozototine</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>31800022</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Solution de dissociation cellulaire</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8644</td><td></td></tr><tr><td>488 phalloïdine</td><td>Sigma</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sigma</td><td>21888-25mg-F</td><td></td></tr><tr><td>Annexine V/PI kit d’apoptose</td><td>Dojindo</td><td>AD10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de Clostridium, Type XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NHS Sigma-Aldrich</td><td>56480</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3449</td><td></td></tr><tr><td>8 bras PEG</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>1685176</td><td></td></tr><tr><td>FAM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M041100</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-carboxyfluorescéine N-succinimidyl</td><td>ester Sigma-Aldrich</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>KBr</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>32036</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyl-triéthoxysilane&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>toluène</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>S-15497-20X</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloration vivante/morte</td><td>Biovision, US</td><td>K501</td><td></td></tr><tr><td>BD MatrigelTM, matrice de membrane basale, facteur de croissance réduit</td><td>BD Bioscience</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium, 99,5 %</td> <td>J& K Scientific Ltd</td><td>105864</td> Chlorure de <td></td></tr><tr><td>potassium, 99 %, extra pur</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>991468</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium, 99,7 %, réactif ACS</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>988639</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté, 99 %, réactif ACS</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>182158</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrogénophosphate de potassium, 99 %, extra pur</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>128839</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté, 99 %, pour analyse</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>119370</td><td></td></tr><tr><td>Solution volumétrique de chlorure de calcium, 1,0 M CaCl2</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>21114</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin Albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900933</td><td></td></tr><tr><td>Rat/Souris Insuline ELISA</td><td>kit Millipore-linco</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr></tbody></table>

ingénierie des surfaces des îlots pancréatiques avec un nanorevêtement starpeg hépariné

Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Ingénierie des surfaces cellulaires peut protéger les cellules implantés contre attaque immunitaire de l’hôte. Il peut également remodeler paysage cellulaire pour améliorer la fonction du greffon et la survie après transplantation. Ce protocole vise à réaliser l’ingénierie des surfaces des îlots pancréatiques, en utilisant un nanorevêtement ultraminces constituées en héparine starPEG (Hep-PEG). Pour générer le nanorevêtement Hep-PEG pour l’ingénierie des surfaces îlots pancréatiques, succinate de succinimidyl héparine (héparine-NHS) a été synthétisée par modification de ses groupes carboxylate à l’aide de-(3-dimethylamino propyl) N -N'-éthyl carbodiimide chlorhydrate de (EDC) et N- hydroxysuccinimide (NHS). Le mélange de Hep-PEG a été ensuite formé par réticulation des aminés fonctionnalisés fin huit bras starPEG (starPEG-(NH2)8) et l’héparine-NHS. Pour le revêtement de surface îlot, îlots de souris ont été isolés par digestion de collagénase et purification dégradée à l’aide de Histopaque. Les îlots isolés ont été ensuite traitées avec solution Hep-PEG froide de glace pendant 10 min permettre la liaison covalente entre le NHS et les groupes amines de membrane de cellules d’îlot. Nanorevêtement avec la Hep-PEG subit une modification minime à la taille de l’îlot et le volume et l’héparinisation des îlots avec Hep-PEG peuvent également réduire la réaction inflammatoire induite par le sang instantanée, au cours de la transplantation d’îlots pancréatiques. Cette approche « facile à adopter » est assez douce pour l’ingénierie des surfaces des cellules vivantes sans compromettre la viabilité des cellules. Considérant que l’héparine a montré affinité de liaison de plusieurs cytokines, la Hep-PEG nanorevêtement fournit également une plate-forme ouverte qui permet l’incorporation de médiateurs biologiques fonctionnelles illimités et surfaces multicouches pour une vie surface cellulaire bio-ingénierie.

Le nanorevêtement héparine-PEG a été synthétisé par conjugaison du starPEG-(NH2)8 et l’héparine à l’aide d’EDC et NHS comme accouplement agents (Figure 1). Structure chimique de l’héparine-PEG nanorevêtement a été étudiée par FT-IR, et tel qu’illustré à la Figure 2, pics caractéristiques d’héparine pourraient être observées à 3 300 – 3 600 cm-1, correspondant aux groupes hydroxyle d’héparine (Figure 2 rouge). La diminution de l’amplitude du pic à 3 300 – 3 600 cm-1 (Figure 2 bleu) représente la conjugaison entre le starPEG - groupes d’amide8 (NH2) et le groupe carbonyle de l’héparine. Amplitude de crête 1 650 cm-1 correspond à l’amide carbonyle vibration d’élongation a également été réduite, ce qui indique une réaction suffisante entre les groupes carboxylate d’héparine avec succinimidyl succinate et amine de starPEG-(NH2) 8. structure de la surface de l’héparine-PEG nanorevêtement a été examiné par microscopie à force atomique et il est démontré de Lou et al., le nanorevêtement était d’environ 30 nm de hauteur et 2 µm de largeur par petits éléments poreux (taches foncées) allant entre 100 et 200 nm de diamètre10. Données obtenues par microscopie électronique numérisée confirment également la structure poreuse hautement interconnectée de l’héparine-PEG (Figure 3), ce qui suggère qu’il pourrait être approprié pour la survie des cellules pendant l’accouchement in vivo.
Revêtement de surface des îlots isolés de souris a été examinée et tel que présenté dans la Figure 4, fine couche de nanorevêtement, illustré par fluorescence verte a été uniformément déposé sur la surface du revêtement îlots sans provoquer de changements évidents sur l’îlot/taille du volume. Durant l’enrobage, il est recommandé de garder les îlots sur la glace pour maintenir leur viabilité. De même, la période de revêtement, 10 min dans ce cas, a été également optimisé pour permettre le maintien de la viabilité des îlots. Il est à noter que pour une meilleure observation de la nanorevêtement, microscopie électronique qui examine les sections transversales des îlots couchés comme indiqué précédemment9,16 serait plus appropriée, bien que les données seraient générées des îlots fixes et embarqués au lieu des îlots de vie dans la culture.
Concernant la survie et la fonction d’îlots couchés, revascularisation de l’îlot et fonctions dans ont été évalués in vitro. Si l'on considère les propriétés bénéfiques de l’héparine, fonctionnalisation de l’héparine sur la surface de l’îlot pourrait faciliter la revascularisation îlot de culture et, par conséquent, sa survie. Nous avons observé que les îlots de souris héparine-PEG enduit montraient viabilité îlot robuste en culture (Figure 5). Nettement plus avancé formation vasculaire était également évidente des cellules endothéliales en îlot (MS1) qui ont été cultivés conjointement avec l’héparine-PEG revêtue îlots, indiquées par des structures ressemblant à des microvaisseaux allongées et réseau-comme les structures vasculaires (Figure 6 ).
Le processus de nanorevêtement n’encouru aucune capacité sécrétrice d’effet insuline stimulée par le glucose des îlots héparine-PEG enduit. Faible niveau de sécrétion d’insuline a été observée dans tous les groupes de traitement lorsque les îlots ont été perfusés avec une solution saline physiologique additionnée de sub-stimulatory niveau de glucose (2 mmol/L ; La figure 7). Lorsque les îlots ont été stimulées avec un niveau supra-physiologique de glucose (20 mmol/L de glucose), augmentation de la sécrétion d’insuline a été observée dans tous les groupes de traitement.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2.jpg"> Figure 1 : Structure chimique du Hep-PEG nanorevêtement pour l’ingénierie des surfaces îlots pancréatiques. Revêtement de l’îlot a été réalisée par réticulation covalente entre l’héparine-NHS et des amines primaires au sein de la membrane cellulaire et étoiles - PEG-(NH2)8. Chaque molécule d’héparine possède plusieurs groupes carboxyle, qui ont été modifiés pour avoir un groupe de NHS. Les groupes carboxyles activés par le NHS vont réagir avec des amines primaires des protéines de liaisons amides de forme, par l’intermédiaire de laquelle nanorevêtement de Hep-PEG et îlots est stabilisé. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2.jpg"> Figure 2 : Spectre infrarouge d’étoiles - PEG-(NH2)8, héparine et Hep-PEG nanorevêtement dans séché État. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig3.jpg"> Figure 3 : Scanné des images de microscopie électronique de Hep-PEG en état séché. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig4.jpg"> Figure 4 : Des images représentatives de l’héparine-PEG enduit îlots sous microscope à fluorescence. L’héparine a été préalablement marqué avec FAM (indiqué en vert). Les images sont représentant de 100 îlots. Echelle = 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig4large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig5.jpg"> Figure 5 : Îlots héparine-PEG enduit exposées viabilité îlot robuste. (A) les données présentées comme l’écart-type mean± de moyens, n = 50 îlots par groupe. (B) des cellules vivantes ont été montrées dans les cellules vertes et mortes en rouge. Echelle = 100 µm. les Images sont représentatives des 50 îlots. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig6.jpg"> Figure 6 : Intra-îlot revascularisation facilite l’héparine-PEG nanorevêtement. Formation du Matrigel tube de cellules MS1 conjointement avec l’héparine-PEG enduit îlots et îlots de contrôle noncoated. Des images ont été prises à l’Echelle de 4 à 24 h. = 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig6large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig7.jpg"> Figure 7 : Héparine-PEG nanorevêtement ne subit aucun changement sur la fonction de sécrétion de l’insuline îlot. Héparine-PEG enduits îlots et îlots de contrôle noncoated (30) ont été exposés à 2 mmol/L (barre blanche) ou 20 mmol/L (barre noire) de glucose pour 30 min. de la sécrétion d’insuline en réponse à 20 mmol/L de glucose était comparable entre l’enduit et contrôler des îlots. Les données apparaissent comme moyenne ± écart-type des moyens, n = 10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole vise à réaliser l’ingénierie des surfaces des îlots pancréatiques, en utilisant un nanorevêtement starPEG héparine-constituée par l’intermédiaire de pseudo-bioorthogonal chimie entre les groupes N- hydroxysuccinimide le nanorevêtement et les groupes amine d’îlot membrane de la cellule.

Ingénierie des surfaces des îlots pancréatiques avec un nanorevêtement StarPEG hépariné

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

Cette méthode peut aider à résoudre les principaux défis de la transplantation d’îlots pancréatiques, tels que l’immuno-rejet, la revascularisation des îlots pancréatiques après la transplantation et la survie. Le principal avantage de cette technique est que cette approche facile à adopter permet l’ingénierie de surface des cellules vivantes en remodelant le paysage cellulaire des îlots pancréatiques, ce qui améliorera la fonction du greffon, la survie et, en fin de compte, l’efficacité thérapeutique de la transplantation d’îlots. Les implications de cette technique s’étendent aux thérapies cellulaires, car les résultats thérapeutiques des thérapies cellulaires sont également limités par une faible rétention cellulaire et une faible survie.La démonstration de cette procédure est faite par Jingyi Yang, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Tout d’abord, pesez 6,9 grammes d’héparine et dissolvez-le dans 2 millilitres d’eau déminéralisée glacée dans un tube Eppendorf. Dissoudre 0,23 gramme de NHS dans 0,5 millilitre d’eau déminéralisée glacée dans un tube Eppendorf.Ensuite, dissolvez 0,77 gramme d’EDC dans 0,5 millilitre d’eau déminéralisée glacée dans un tube conique de 50 millilitres. Mélangez les solutions NHS et EDC dans un tube conique de 50 millilitres. Après avoir laissé la solution mélangée à température ambiante pendant 30 minutes, centrifugez-la à 12 000 tr/min pendant 10 minutes pour éliminer l’excès d’EDC et de NHS.Ensuite, ajoutez 30 millilitres d’éthanol froid à la solution et centrifugez à 12 000 tr/min pendant 10 minutes. Maintenant, ajoutez 1 millilitre de 10 % starPEG MI aid à un tube conique de 50 millilitres. Ajoutez ensuite 0,67 millilitre de solution d’héparine NHS à 10 % dans le même tube conique de 50 millilitres.Placez la solution mélangée dans un incubateur à 25 degrés Celsius pendant 20 minutes pour obtenir une solution claire et visqueuse. Cueillir à la main 200 îlots de souris précédemment extraits sous un microscope de dissection et les transférer dans un tube de 1,5 millilitre. Ajoutez 500 microlitres de PBS dans les îlots et centrifugez à 1 200 tr/min pendant une minute à quatre degrés centigrades.Retirez le surnageant, ajoutez 250 microlitres de la solution d’héparine PEG et placez le mélange sur de la glace pendant 10 minutes. Pipette de haut en bas pour permettre aux îlots de bien se mélanger avec la solution d’héparine PEG. Ensuite, centrifugez le mélange à 1 200 tr/min pendant une minute.Ensuite, retirez le surnageant et ajoutez 500 microlitres de PBS. Pipeter de haut en bas pour bien mélanger. Après une centrifugation à 1 200 tr/min pendant une minute, retirez le surnageant et conservez les îlots pour une utilisation ultérieure.Ensuite, ajoutez un à deux millilitres de RPM I 1640, complété par 10 % FBS aux îlots revêtus. Et transférez ces îlots dans une boîte de culture bactérienne stérile non chargée. Enfin, observez la morphologie et les signaux fluorescents des îlots recouverts de FAM-Héparine-PEG sous un microscope à fluorescence inversée.Des pics d’héparine caractéristiques, correspondant aux groupes HYDROXAL, ont été observés dans le spectre FTIR de nanorevêtement héparine-PEG. La diminution de l’amplitude de ces pics représente la conjugaison entre les groupes amide étoile-PEG MI et le groupe carbonal héparine. Le pic correspondant à la vibration d’étirement de l’amide carbonal a également été réduit, indiquant une réaction suffisante entre les groupes carboxylate d’héparine avec le suxsonate de succynimidal et l’amine d’aide MI en étoile.Les données d’une microscopie électronique montrent la structure poreuse hautement interconnectée du nanorevêtement d’héparine-PEG, ce qui suggère qu’il pourrait convenir à la survie cellulaire lors de l’administration in vivo. Une mince couche de nano-revêtement, illustrée par une fluorescence verte, a été déposée uniformément à la surface des îlots revêtus, sans provoquer de changements évidents sur le volume ou la taille des îlots. Des îlots de souris recouverts d’héparine et de PEG ont montré une viabilité robuste des îlots en culture.Une formation vasculaire significativement plus avancée était évidente à partir des cellules endothéliales des îlots pancréatiques qui ont été co-cultivées avec des îlots recouverts d’héparine-PEG, indiquée par des structures allongées ressemblant à des micro-vaisseaux et des structures vasculaires en forme de réseau. Un faible niveau de sécrétion d’insuline a été observé dans tous les groupes de traitement lorsque les îlots ont été perfusés avec une solution saline physiologique, complétée par un niveau sous-stimulant de glucose. Lorsque les îlots ont été stimulés avec un niveau super-physiologique de glucose, une augmentation de la sécrétion d’insuline a été observée.Une fois maîtrisé, l’enrobage peut être réalisé en une minute s’il est effectué correctement pour préserver la viabilité des îlots.

surface-engineering-pancreatic-islets-with-heparinized-starpeg

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Le dosage in vitro la fonction β-cellulaire en utilisant des îlots isolés de souris de Langerhans est un élément important dans l'étude du diabète physiopathologie et la thérapeutique. Alors que de nombreuses applications en aval sont disponibles, ce protocole décrit précisément la mesure intracellulaire d'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) comme un paramètre essentiel de déterminer la fonction β-cellulaire.

Une méthode pour la souris Isolement îlots pancréatiques et AMPc intracellulaire Détermination

Ici, nous présentons une méthodologie pour générer et administrer un composé de microsphères poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) chargées d’intérêt à des îlots de souris intacts en culture, avec analyse ultérieure par immunofluorescence de la prolifération des cellules β. Cette méthode convient pour déterminer l’efficacité des mitogènes β cellules candidates.

Administration soutenue de mitogenes β-cellules à Intact Islets souris<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Utilisation Biodegradable poly (acide lactique-co-glycolique) Microsphères

Ce protocole démontre l'isolation des îlots murins et le semis sur un échafaud décellularisé. Les îlots soutenus par des échafaudages ont été transplantés dans la pate épididymique des souris diabétiques induites par la streptozotocine (STZ). Les îlots ont survécu au site de transplantation et ont inversé l'état hyperglycémique.

Transplantation soutenue d&#39;échafaudage d&#39;îlots dans la pate épididimale de souris diabétiques

Ce protocole d'isolement d'îlots a décrit une nouvelle voie d'injection de collagène pour digérer le tissu d'exocrine et une procédure simplifiée de gradient pour purifier les îlots des souris. Il s'agit de la digestion enzymatique, de la séparation/purification des gradients et de la cueillette manuelle des islets. L'isolement réussi peut donner 250-350 îlots de haute qualité et entièrement fonctionnels par souris.

Un protocole simple à haut rendement pour l'isolement des îlettes pancréatiques des souris

Des études ex vivo îlots pancréatiques sont importants pour la recherche sur le diabète. Les techniques existantes pour étudier des îlots cultivés dans leur architecture 3D natif sont chronophages, inefficace et rarement utilisés. Cet ouvrage décrit une méthode nouvelle, simple et efficace pour générer des sections de paraffine de haute qualité des îlots cultivés ensemble.

Îlots pancréatiques, enrobage pour les Sections de paraffine

Ce protocole décrit une méthode pour l'analyse quantitative de la formation complexe de protéine de mitophagie spécifiquement dans les cellules bêta des échantillons humains primaires d'islet. Cette technique permet ainsi l'analyse de la mitophagie à partir de matériel biologique limité, qui sont cruciaux dans les échantillons précieux de cellules bêta pancréatiques humaines précieuses.

Visualisation des complexes mitophatonus endogènes in situ dans les cellules bêta pancréatiques humaines utilisant l'analyse de la ligation de proximité

La matrice extracellulaire décellularisée (DECM) peut fournir des indices microenvironnementaux appropriés pour récapituler les fonctions inhérentes des tissus cibles dans une construction machinée. Cet article élucide les protocoles pour la décellularisation du tissu pancréatique, l'évaluation du bioink dECM pancréatique de tissu-dérivé, et la génération des constructions pancréatiques 3D de tissu utilisant une technique de bioimpression.

Bioink extracellulaire de matrice de tissu pancréatique-dérivé pour l'impression 3D Cell-Laden Pancréatique Tissue Constructs

Cette méthode de transplantation d’îlots couverts de graisse convient à la détection des îlots greffés dans la cavité intrapéritonéale. Notamment, il ne nécessite pas l’utilisation d’agents bioliants ou de suture.

Transplantation d’îlots pancréatiques couverts de graisse à l’aide de tissu adipeux blanc épididymaire

Ce protocole décrit une méthode standardisée pour la prélèvement chirurgical, la digestion enzymatique et la purification par gradient de densité des îlots pancréatiques de rat Lewis, permettant des préparations à haut rendement et à haute pureté pour une utilisation directe dans des études de transplantation ou in vitro .

Isolement et purification des îlots pancréatiques à partir de rats de Lewis grâce à la digestion enzymatique et à la séparation par gradient de densité

Nous avons développé une matrice extracellulaire et des poumons décellularisé bioréacteur roman biomimétiques qui peuvent être utilisés pour générer des tissus pulmonaires fonctionnelles. Par ensemencement des cellules dans la matrice et la culture dans le bioréacteur, nous générons des tissus qui démontre les échanges gazeux efficaces lorsqu'elles sont transplantées in vivo pour de courtes périodes de temps.

Procédure pour l&#39;ingénierie du poumon

Découvrez l'ingénierie de surface des îlots pancréatiques avec un nanorevêtement héparine-starPEG. Cette technique améliore la survie et la fonction des greffons pour les thérapies cellulaires.

Ingénierie des surfaces des îlots pancréatiques avec un nanorevêtement StarPEG hépariné

Explorer plus de vidéos